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天然聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹分析内源性IRF5二聚化

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DOI：

10.3791/60393

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2019年10月6日

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, City University of Hong Kong

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于分析CAL-1浆细胞样树突状细胞系中内源性干扰素调节因子5二聚化的天然蛋白质印迹法。该方案也可应用于其他细胞系。

摘要

干扰素调节因子5（IRF5）是调控免疫应答的关键转录因子，其在Toll样受体-髓样分化初级反应基因88（TLR-MyD88）信号通路的下游被激活。IRF5的激活过程包括磷酸化、二聚化以及随后从细胞质向细胞核的转位，从而诱导多种促炎性细胞因子的基因表达。检测IRF5激活状态的实验方法对于研究IRF5的功能及其相关信号通路至关重要。本文介绍了一种在人浆细胞样树突状细胞系CAL-1中检测内源性IRF5激活的可靠方法。该方案采用一种改良的非变性电泳检测技术，能够区分IRF5的单体与二聚体形式，从而提供一种经济且灵敏的IRF5激活分析手段。

引言

干扰素调节因子5（IRF5）是一种重要的转录调控蛋白，在调节免疫应答中发挥关键作用，特别是在促炎性细胞因子和I型干扰素（IFNs）的释放过程中1,2,3。IRF5的异常调控是多种自身免疫性疾病的重要诱因，这一点已通过IRF5基因位点上的多种多态性得到证实，这些多态性与系统性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿关节炎等疾病密切相关4,5,6,7,8,9,10。因此，在生理相关的细胞环境中，建立一种可靠的内源性IRF5活化状态检测方法，对于深入理解IRF5的调控通路及其下游效应至关重要。

IRF5在单核细胞、树突状细胞（DCs）、B细胞和巨噬细胞中组成性表达1,11。与其他IRF家族转录因子类似，IRF5在静息状态下位于细胞质中。激活后，IRF5被磷酸化并形成同源二聚体，随后转位至细胞核，结合I型干扰素（IFNs）和促炎性细胞因子编码基因的特异性调控元件，最终诱导这些基因的表达1,2,11,12,13。IRF5调控多种Toll样受体（TLRs）下游的先天免疫应答，例如定位于内体、依赖MyD88进行信号传导的TLR7、TLR8和TLR91,11,14。这些TLRs主要识别感染特征性的外源核酸，如单链RNA（ssRNA）和非甲基化的CpG DNA15,16,17,18。研究表明，IRF5可调控针对细菌、病毒和真菌感染的免疫应答19,20,21。鉴于IRF5在免疫系统中具有重要且多样的作用，增强或抑制IRF5活性可能为开发新型治疗药物提供一条新途径22。因此，建立一种监测内源性IRF5激活状态的实验方案，对于深入研究在不同类型细胞中调控IRF5活性的通路与机制至关重要。

据我们所知，在本实验方案建立之前，尚未有针对内源性IRF5活化的生化或凝胶电泳检测方法被发表。已有研究表明，磷酸化是IRF5活化的重要初始步骤，并已开发出一种特异性识别磷酸化IRF5的抗体，该抗体促成了对一个在IRF5活性中起关键作用的丝氨酸残基的发现与验证13。然而，尽管该抗体在免疫沉淀或过表达条件下可明确检测到磷酸化的IRF523，但在我们的实验中，其无法在全细胞裂解液中检测到IRF5的磷酸化（数据未显示）。二聚化是IRF5活化的下一步，迄今为止许多关于该步骤的重要研究依赖于在通常不表达IRF5的无关细胞类型中过表达表位标签标记的IRF511,12,24,25。先前的研究表明，二聚化的IRF5并不总是转位至细胞核，因此不一定代表完全活化25,26。已有研究开发出一种检测内源性IRF5核定位的实验方法，通过成像流式细胞术评估IRF5的活化状态27。该方法已被应用于多项对理解IRF5功能至关重要的研究中，特别是在原代细胞或稀有细胞类型中的研究28,29，极大地推动了该领域的发展。然而，该方法依赖于一种尚未广泛普及的专用仪器。此外，在解析IRF5调控通路并鉴定上游调控因子及通路组分时，通常需要研究活化的初始阶段。本研究提供了一种稳健且可靠的生化检测方法，用于检测IRF5早期活化事件，可在配备分子生物学基本设备的实验室中开展。本文所述的实验方案将有助于深入探究IRF5作用的通路与机制，尤其在与成像流式细胞术分析IRF5核定位等正交检测方法联合使用时更具价值23,27,28,30。

天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）是一种广泛用于分析蛋白质复合物的方法31,32。与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）不同，native PAGE 根据蛋白质的形状、大小和电荷进行分离，同时在不使蛋白质变性的前提下保持其天然结构31,33,34,35。本方案利用了 native PAGE 的这些特性，可检测 IRF5 的单体和二聚体形式。该方法在检测早期激活事件方面尤为重要，因为目前尚无适用于检测内源性磷酸化 IRF5 的商业化抗体。此前已有若干研究采用 native PAGE 来评估 IRF5 的二聚化，但其中大多数研究依赖于外源表位标签标记的 IRF5 过表达，以分析其激活状态2,13,24,36,37。本文提供了一种逐步操作的实验方案，通过改良的 native PAGE 技术，在人浆细胞样树突状细胞（pDC）系中分析内源性 IRF5 的二聚化，而 IRF5 的活性在该细胞系中已被证实对其功能至关重要1,38,39,40。该技术同样已应用于其他细胞系23。

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方案

注意： 本方案中使用经R848（TLR7/8激动剂）处理的CAL-1 pDC细胞系。该方案已应用于其他多种人源和小鼠细胞类型，包括RAW 264.7（小鼠巨噬细胞系）、THP-1（人单核细胞系）、BJAB（人B细胞系）、Ramos（人B细胞系）和MUTZ-3（人树突状细胞系）23。

1. CAL-1 细胞的刺激

  1. 在无菌条件下，将 CAL-1 细胞培养于 T75 培养瓶中，置于 37 °C、5% CO2 培养箱中，使用含 5% 胎牛血清（FBS）、25 mM HEPES 和 1× 巯基乙醇的 RPMI 1640 培养基（即完全 RPMI 1640 培养基），每瓶加入 20−25 mL。
  2. 将细胞转移至 50 mL 圆底离心管中。
    注意： CAL-1 细胞为非贴壁细胞。对于贴壁细胞类型，可采用标准胰酶消化法收集细胞。
  3. 在室温（RT）下以 200 × g 离心 5 分钟，弃上清液，将细胞沉淀重悬于 8 mL 完全 RPMI 1640 培养基中，制成均一的单细胞悬液。
  4. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。以每孔 1 × 106 个细胞的密度，将细胞接种于 6 孔板中，每孔加入 4 mL 预热的完全 RPMI 1640 培养基。于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 20−24 小时，使细胞融合度达到 90%−95%（相当于约 1.5 × 106 个细胞）。
  5. 通过向 6 孔板每孔加入 4 µL 的 1 mg/mL R848（终浓度为 1 µg/mL）刺激细胞。同时设置未刺激对照孔，即不含 R848 处理的细胞孔。
  6. 轻轻左右摇动培养板，确保 R848 均匀分散。随后将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 2−16 小时。

2. 细胞蛋白的提取

  1. 将6孔板中的细胞悬液转移至5 mL离心管中。
  2. 在室温下以200 × g 离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，以获得均一的单细胞悬液。
  3. 将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。
  4. 在4 °C下以12,000 × g 短暂离心0.5−1分钟，小心吸除上清液。
  5. 配制裂解缓冲液：在250 mL去离子水（ddH2O）中加入6.25 mL 1 M Tris-HCl（pH 7.4，终浓度为25 mM）、7.5 mL 5 M NaCl（终浓度为150 mM）、0.5 mL 0.5 M EDTA（终浓度为1 mM）、2.5 mL NP-40（终浓度为1%）和7.5 mL甘油（终浓度为5%）。使用前立即加入100倍蛋白酶抑制剂单次使用混合液，使终浓度为1倍。将配制好的裂解缓冲液置于冰上保存。
    注意：不含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液可在4 °C下保存。
  6. 将细胞沉淀用30 µL预冷的裂解缓冲液重悬，并通过反复吹打混匀。
  7. 在冰上孵育15−20分钟。
  8. 在4 °C下以12,000 × g 离心15−20分钟，澄清裂解物。将上清液转移至新的预冷1.5 mL离心管中。所有操作过程中均需将提取物保持在冰上。
    注意：细胞裂解物可在-20 °C或-80 °C下保存。切勿煮沸样品。
  9. 使用Bradford试剂测定蛋白浓度。

3. 通过非变性PAGE分析IRF5二聚化

  1. 配制上层（-）和下层（+）电泳缓冲液。上层缓冲液由含0.3%脱氧胆酸钠（NaDOC）的1×非变性PAGE电泳缓冲液组成，下层缓冲液仅使用1×非变性PAGE电泳缓冲液。
    注意：每次新电泳运行均需配制新鲜的上层缓冲液。
  2. 用清水彻底冲洗一块3%−12%的非变性PAGE胶，注意不要破坏加样孔。将凝胶放入小型电泳槽中并拔去梳子。在4 °C冷藏环境或冰上以150 V预电泳30分钟。
    注意：预电泳可去除过量的氨和过硫酸盐离子，这些离子可能干扰凝胶电泳过程。
  3. 在预电泳期间，将保存在冰上的细胞蛋白与4×非变性上样缓冲液混合，制备上样样品。
  4. 预电泳结束后，每样品上样10−15 µg蛋白，最终体积为10−15 µL。
    注意：蛋白上样量过高可能导致条带拖尾。
  5. 以85 V电泳30分钟，随后以150 V电泳2小时。
    注意：考虑到不同实验室所用设备和细胞系的差异，可能需要对蛋白样品浓度、电压和电泳时间进行微调以优化本实验方案。降低预电泳和电泳电压并延长电泳时间，有助于提高二聚体的分辨能力和结果的一致性。
  6. 将凝胶在SDS电泳缓冲液（25 mM Tris pH 8.3，250 mM 甘氨酸，0.1% SDS）中室温浸泡30分钟。
    注意：此步骤无需振荡。由于脱氧胆酸盐（DOC）存在时可能导致转膜效率低下，条带强度可能与上样蛋白量不成正比，这一现象主要影响IRF5的单体形式。在转膜前将凝胶浸泡于SDS电泳缓冲液可解决此问题。凝胶较为脆弱，操作时应从凝胶底部（即浓度较高的一端）小心处理。

4. IRF5的免疫印迹分析

  1. 将聚偏二氟乙烯（PDVF）膜浸入甲醇中约 5 分钟以激活。
  2. 在膜的一角剪一个切口以标记其方向。按照制造商说明书中的顺序小心组装转膜夹心结构，确保无气泡残留。
  3. 将转膜夹板放入转膜槽中，在冰上以 20 V 恒压转移 1 小时。
    注意： 后续所有孵育和洗涤步骤均需在摇床上进行。
  4. 转膜完成后，用塑料镊子取出膜，并在封闭缓冲液（TBS）中于室温封闭 45 分钟。
    注意： 含 5% BSA 的 TBS 缓冲液也可用作封闭缓冲液。
  5. 将膜与表 1中所列的一抗孵育。用 1× TBST 洗涤缓冲液（20 mM Tris，pH 7.0，150 mM NaCl 和 0.1% Tween 20）在摇床上洗涤 3 分钟，重复洗涤 2 次。
稀释比例稀释缓冲液孵育条件备注
一抗（Anti-IRF5）1/1,000TBS 封闭缓冲液4 °C 过夜或室温 2 小时若在含有 0.02% 叠氮化钠的条件下于 4 °C 保存，稀释后的抗体可重复使用多次。
二抗（Anti-rabbit）1/10,000TBS 封闭缓冲液室温 45 分钟若在含有 0.02% 叠氮化钠的条件下于 4 °C 保存，稀释后的抗体可重复使用多次。
注意：稀释比例需根据不同的生产厂家进行优化。

表1：免疫印迹实验中所用抗体的规格。

  1. 使用 表1 中列出的二抗孵育膜。用1×TBST洗涤缓冲液洗涤膜3分钟。重复洗涤2次。
  2. 使用适当的凝胶成像系统扫描印迹。

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结果

对未刺激或经1 µg/mL R848刺激2小时的CAL-1细胞进行免疫印迹（IB）分析，使用抗IRF5抗体检测（图1）。制备细胞裂解物后进行天然PAGE电泳。在未刺激的CAL-1细胞中，IRF5在天然PAGE上表现为单一的条带，对应其单体形式。当CAL-1细胞经R848处理2小时后，IRF5单体水平下降，同时出现迁移较慢的条带累积增加，该条带对应IRF5的二聚体形式。

IRF5蛋白的电泳图，显示未刺激和R848刺激条件下的结果。
图1：在TLR7/8激动剂刺激下，CAL-1细胞中内源性IRF5发生二聚化。CAL-1细胞在所示时间内未经处理或经R848处理。蛋白样品通过非变性PAG...

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讨论

本文所述方案是一种改良的非变性PAGE，可区分内源性IRF5的单体和二聚体形式。目前仅有少数研究报道过使用专门的成像流式细胞术检测内源性IRF5活化状态23,27,28,30。本方案采用常规技术以及常见的试剂和工具，用于评估细胞激活早期阶段内源性IRF5的活化状态。该方案在标准非变性PAGE基础上进行了简单改进，以实现对IRF5单体与二聚体形式的有效区分。该方法可轻松适用于其他细胞系的研究23。此改良的非变性PAGE方案能够清晰分辨内源性IRF5的两种形式，且无非特异性蛋白干扰（图2）。在该凝胶系统中，未刺激细胞来源的内源性IRF5表现为一条清晰的单一条带，而经R848处理2小时后，则出现对应于IRF5二聚体的条带（图1

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了周氏基金会和城市大学启动资金的资助。我们感谢周氏实验室的所有成员在实验方面的帮助以及对稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Life Technologies, HK21985023
300 W/250 V 电源，230 V 交流电Life Technologies, HKPS0301
抗 IRF5 抗体Bethyl Laboratories, USAA303-385
BIOSAN 摇床振荡器（适用于冷藏室）EcoLife, HKMR-12
EDTA 缓冲液，pH 8，0.5 M，4×100 mLLife Technologies15575020
甘油，500 mLLife Technologies15514011
甘氨酸Life Technologies, HK15527013
山羊抗小鼠 IgG DyLight 800 标记抗体LAB-A-PORTER/Rockland, HK610-145-002-0.5
山羊抗兔 IgG DyLight 800 标记抗体LAB-A-PORTER/Rockland, HK611-145-002-0.5
Halt 蛋白酶抑制剂混合液（100×）Thermo Fisher Scientific, HK78430
HEPESLife Technologies, HK15630080
LI-COR Odyssey 封闭缓冲液（TBS）Gene Company, HK927-50000
Mini Tank 转膜模块组合；转移模块，配件Life Technologies, HKNW2000
NativePAGE 3-12% 胶，10 孔试剂盒Life Technologies, HKBN1001BOX
NativePAGE 电泳缓冲液（20×）Life Technologies, HKBN2001
NativePAGE 上样缓冲液（4×）Life Technologies, HKBN2003
NP-40 替代物，壬基苯基聚乙二醇Tin Hang/Calbiochem, HK#492016-100ML
PBS，pH 7.4Life Technologies, HK10010023
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜Bio-gene/Merck Millipore, HKIPFL00010
蛋白定量试剂盒 II（BSA 法）Bio-Rad, HK5000002
R848Invivogen, HKtlrl-r848
RPMI 1640Life Technologies, HK61870127
氯化钠ThermoFisherBP358-1
脱氧胆酸钠 ≥97%（滴定法）Tin Hang/Sigma, HKD6750-100G
TrisLife Technologies, HK15504020
TWEEN 20Tin Hang/Sigma, HK#P9416-100ML

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