本文介绍了一种用于分析CAL-1浆细胞样树突状细胞系中内源性干扰素调节因子5二聚化的天然蛋白质印迹法。该方案也可应用于其他细胞系。
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本文内容
摘要
摘要
干扰素调节因子5（IRF5）是调控免疫应答的关键转录因子，其在Toll样受体-髓样分化初级反应基因88（TLR-MyD88）信号通路的下游被激活。IRF5的激活过程包括磷酸化、二聚化以及随后从细胞质向细胞核的转位，从而诱导多种促炎性细胞因子的基因表达。检测IRF5激活状态的实验方法对于研究IRF5的功能及其相关信号通路至关重要。本文介绍了一种在人浆细胞样树突状细胞系CAL-1中检测内源性IRF5激活的可靠方法。该方案采用一种改良的非变性电泳检测技术，能够区分IRF5的单体与二聚体形式，从而提供一种经济且灵敏的IRF5激活分析手段。
引言
干扰素调节因子5（IRF5）是一种重要的转录调控蛋白，在调节免疫应答中发挥关键作用，特别是在促炎性细胞因子和I型干扰素（IFNs）的释放过程中1,2,3。IRF5的异常调控是多种自身免疫性疾病的重要诱因，这一点已通过IRF5基因位点上的多种多态性得到证实，这些多态性与系统性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿关节炎等疾病密切相关4,5,6,7,8,9,10。因此，在生理相关的细胞环境中，建立一种可靠的内源性IRF5活化状态检测方法，对于深入理解IRF5的调控通路及其下游效应至关重要。
IRF5在单核细胞、树突状细胞（DCs）、B细胞和巨噬细胞中组成性表达1,
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方案
注意： 本方案中使用经R848（TLR7/8激动剂）处理的CAL-1 pDC细胞系。该方案已应用于其他多种人源和小鼠细胞类型，包括RAW 264.7（小鼠巨噬细胞系）、THP-1（人单核细胞系）、BJAB（人B细胞系）、Ramos（人B细胞系）和MUTZ-3（人树突状细胞系）23。
1. CAL-1 细胞的刺激
- 在无菌条件下，将 CAL-1 细胞培养于 T75 培养瓶中，置于 37 °C、5% CO2 培养箱中，使用含 5% 胎牛血清（FBS）、25 mM HEPES 和 1× 巯基乙醇的 RPMI 1640 培养基（即完全 RPMI 1640 培养基），每瓶加入 20−25 mL。
- 将细胞转移至 50 mL 圆底离心管中。
注意： CAL-1 细胞为非贴壁细胞。对于贴壁细胞类型，可采用标准胰酶消化法收集细胞。 - 在室温（RT）下以 200 × g 离心 5 分钟，弃上清液，将细胞沉淀重悬于 8 mL 完全 RPMI 1640 培养基中，制成均一的单细胞悬液。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。以每孔 1 × 106 个细胞的密度，将细胞接种于 6 孔板中，每孔加入 4 mL 预热的完全 RPMI 1640 ....
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结果
对未刺激或经1 µg/mL R848刺激2小时的CAL-1细胞进行免疫印迹（IB）分析，使用抗IRF5抗体检测（图1）。制备细胞裂解物后进行天然PAGE电泳。在未刺激的CAL-1细胞中，IRF5在天然PAGE上表现为单一的条带，对应其单体形式。当CAL-1细胞经R848处理2小时后，IRF5单体水平下降，同时出现迁移较慢的条带累积增加，该条带对应IRF5的二聚体形式。
图1：在TLR7/8激动剂刺激下，CAL-1细胞中内源性IRF5发生二聚化。CAL-1细胞在所示时间内未经处理或经R848处理。蛋白样品通过非变性PAG.......
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讨论
本文所述方案是一种改良的非变性PAGE，可区分内源性IRF5的单体和二聚体形式。目前仅有少数研究报道过使用专门的成像流式细胞术检测内源性IRF5活化状态23,27,28,30。本方案采用常规技术以及常见的试剂和工具，用于评估细胞激活早期阶段内源性IRF5的活化状态。该方案在标准非变性PAGE基础上进行了简单改进，以实现对IRF5单体与二聚体形式的有效区分。该方法可轻松适用于其他细胞系的研究23。此改良的非变性PAGE方案能够清晰分辨内源性IRF5的两种形式，且无非特异性蛋白干扰（图2）。在该凝胶系统中，未刺激细胞来源的内源性IRF5表现为一条清晰的单一条带，而经R848处理2小时后，则出现对应于IRF5二聚体的条带（图1
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了周氏基金会和城市大学启动资金的资助。我们感谢周氏实验室的所有成员在实验方面的帮助以及对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V 电源，230 V 交流电 | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| 抗 IRF5 抗体 | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN 摇床振荡器（适用于冷藏室） | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA 缓冲液，pH 8，0.5 M，4×100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| 甘油，500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| 甘氨酸 | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| 山羊抗小鼠 IgG DyLight 800 标记抗体 | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| 山羊抗兔 IgG DyLight 800 标记抗体 | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt 蛋白酶抑制剂混合液（100×） | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey 封闭缓冲液（TBS） | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank 转膜模块组合；转移模块，配件 | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% 胶，10 孔试剂盒 | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE 电泳缓冲液（20×） | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE 上样缓冲液（4×） | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 替代物，壬基苯基聚乙二醇 | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS，pH 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| 蛋白定量试剂盒 II（BSA 法） | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| 氯化钠 | ThermoFisher | BP358-1 | |
| 脱氧胆酸钠 ≥97%（滴定法） | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
参考文献
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that....
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