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泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

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DOI：

10.3791/60402

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2019年11月7日

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1Aix-Marseille Univ, INSERM, CNRS, Institut Paoli-Calmettes, CRCM

本文内容

摘要

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。

摘要

泛素（ub）和泛素样蛋白（ubl）介导的蛋白质翻译后修饰通过调控蛋白质的稳定性、活性、相互作用以及细胞内定位，在细胞内发挥重要的生物学调控作用。这些修饰使细胞能够响应信号并适应环境变化。这些机制的异常可导致严重的病理状况，例如神经退行性疾病和癌症。本文所述技术的目的是从培养的细胞系中快速、准确地建立依赖于泛素/泛素样蛋白的翻译后修饰谱。通过比较不同条件下获得的修饰谱，可以鉴定出特定的改变，例如由某种处理所诱导的变化。采用慢病毒介导的细胞转导方法，构建稳定表达双标签（6His 和 Flag）修饰蛋白（如泛素或 SUMO1、Nedd8 等泛素样蛋白）的细胞系。这些标签可用于从细胞中纯化泛素及其修饰的蛋白质。纯化过程分为两步：第一步利用 6His 标签在变性条件下进行，第二步利用 Flag 标签在天然条件下进行。该方法可实现对修饰蛋白的高度特异性和高纯度分离，随后通过液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）对这些蛋白进行鉴定和半定量分析。使用 Excel 软件对质谱数据进行简便的生物信息学分析，可通过去除背景信号建立翻译后修饰谱。通过比较不同条件下的修饰谱，识别出特异性改变，并进一步采用常规生物化学技术对其进行验证和深入研究。

引言

本文提出的方法旨在研究培养的哺乳动物细胞中由泛素家族成员介导的蛋白质翻译后修饰（PTMs），以鉴定与特定条件（如处理、分化等）相关的潜在改变。PTMs是蛋白质功能调控的最终步骤1。事实上，一旦通过翻译机制生成，大多数甚至所有蛋白质都会经历不同类型的PTMs，这些修饰可调节其活性、分子相互作用以及细胞内定位1。在众多PTMs中，由泛素蛋白家族介导的修饰尤为关键，包括泛素本身及所有类泛素蛋白，它们具有调控所有细胞内或部分胞质蛋白的潜力2。由于这些分子本身也是蛋白质，它们可以彼此共价连接，形成具有不同拓扑结构的同源或异源链，每种结构均与特定的调控功能相关联2。因此，亟需开发工具来解析并理解这一复杂的调控系统。目前全球已发展出多种方法，各有优缺点，本文所提出的方法性能优越，适用于培养细胞体系。

该方法的主要优势在于其准确性。事实上，通过联合使用两种标签（6His 和 Flag）以及两步纯化流程，分离得到的修饰蛋白纯度显著提高，因此比单一标签融合Ub/Ubl3,4更具选择性。6His标签的存在使得可在完全变性条件下进行第一步纯化，从而避免了含有泛素结合结构域的蛋白或其他与泛素化蛋白结合的蛋白共纯化。这是目前基于亲和纯化泛素化蛋白质组的多种方法所面临的技术难题，例如使用特异性抗体5或串联泛素结合元件（TUBEs）6的方法。重要的是，该技术不会偏向于某一种特定类型泛素化的纯化，而某些其他方法可能存在此类偏倚，因为该方法已成功鉴定出单泛素化及多种不同类型的多泛素化修饰7。因此，一旦发现泛素化发生改变，还需通过标准的生物化学方法对其进行更深入的研究，以确定所涉及的泛素化具体类型。

最后，本方案的另一项技术优势在于使用慢病毒，可快速、高效地建立稳定表达细胞系，使带标签的修饰因子以合理水平表达，同时不干扰细胞的正常生物学行为。

泛素化的一个重要功能是靶向蛋白质以进行蛋白酶体降解，但目前已知它还具有多种其他调控功能，可能影响大多数细胞内或部分细胞内的蛋白质1。由于存在多种泛素样蛋白，这一功能家族进一步扩大，这些蛋白共同构成一个几乎调控所有细胞机制的蛋白家族1。这些蛋白的异常改变可能对细胞生物学产生严重影响，并可能导致或参与病理状态8，例如癌症9。因此，需要开发相关工具来探索这一广阔领域，识别与病理状态相关的改变，从而为发现新的治疗靶点提供依据。

本方案专用于培养细胞，因为需要对这些细胞进行转导以表达外源性带标签的泛素（Ub）或类泛素蛋白（Ubl）。一旦构建成功，这些稳定细胞系可用于从二维或三维培养体系或异种移植模型中获取Ubl修饰谱，从而拓展可用于研究蛋白质翻译后修饰谱的不同实验模型范围。

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方案

1. 生成稳定表达6His-Flag-Ubl的细胞系

注意：将 pCCL-6HF-Ubl、pVSVG 和 delta-Helper 质粒共同转染至 HEK-293T 细胞中。

  1. 第0天：将293T细胞接种于6孔板中，使次日细胞融合度达到50–70%。
  2. 第1天：使用慢病毒生产用的转染试剂和操作方案，将50–70%融合度的细胞与以下质粒混合物共转染：1 µg pCCL-6HF-Ubl 或 pCCL-GFP、1 µg pVSVG 和 1 µg delta-Helper 载体。转染6小时后，更换为适合待转导细胞的新鲜培养基。将待转导细胞接种于6孔板中，使次日（即开始转导当天）细胞融合度达到10–20%。
  3. 第2天：转染24小时后，收集含有慢病毒颗粒的培养上清，并用0.45 µm滤器过滤。如有需要，此时可补充新鲜培养基以制备第二批慢病毒。将待转导细胞（融合度10–20%）的培养基更换为含慢病毒的上清。
    注意：含慢病毒的培养基可在+4 °C保存数天，或在-80 °C保存数月后再用于转导。
  4. 将细胞在标准培养箱（37 °C，5% CO2）中与慢病毒共同孵育24至72小时，随后更换为新鲜的标准培养基。如有可能，使用倒置荧光显微镜观察GFP表达情况，以评估转导效率：包括表达细胞的百分比及单个细胞的相对表达水平。若未检测到荧光信号，可继续培养额外2–3天，因GFP表达时间可能因待转导细胞类型而延长。
  5. 若GFP对照组结果为阳性，则继续培养所有细胞，直至获得足够数量，用于通过免疫荧光和抗Flag抗体进行的Western blot检测，以验证6HF-Ubl的表达情况。

2. 修饰蛋白的双重纯化

注意：缓冲液1：6 M 盐酸胍，0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4，pH 8.0，0.5% Triton X-100。
缓冲液2：50 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，1% Tween20，5% 甘油，pH 8.0。
缓冲液3：100 mM NH4HCO3，pH 8.0。

  1. 细胞裂解：准备就绪后，用室温（RT）磷酸盐缓冲液（PBS）至少洗涤培养皿一次，随后进行细胞裂解；或者， alternatively，用液氮速冻2 并在 -80 °C 下保存。裂解时，在室温下每15 cm培养皿加入2 mL缓冲液1。使用细胞刮刀将所有裂解物收集至50 mL锥形离心管中（终体积约20 mL）。
  2. 将裂解液超声处理三次，每次30秒，每次间隔1分钟。
  3. 将超声处理后的裂解液在15,000 x g 15分钟。
  4. 使用细胞滤器（40 µm）将上清液转移至新离心管中。
  5. 确定样品浓度，必要时进行调整，以获得相同量的蛋白质和相同体积。总蛋白量应控制在50至100 mg之间（适用于10个直径15 cm培养皿的MiaPaCa-2细胞）。
  6. 加入 Ni2+-NTA 琼脂糖凝胶，每 1 mg 蛋白质使用 2 µL 琼脂糖凝胶。
  7. 室温下以 30 rpm 转速旋转 2.5 小时。
  8. 500 × g 离心收集珠子 g 5 分钟。
  9. 用1 mL缓冲液1洗涤磁珠，将样品转移至1.5 mL微量离心管中，然后将管子置于冰上。后续所有步骤均在冰上或4 °C下进行。
  10. 用 1 mL 含 10 mM 咪唑的冰冻缓冲液 2 洗涤两次。
  11. 为洗脱结合的蛋白质，加入600 µL含250 mM咪唑的缓冲液2，在4 °C下旋转孵育2小时。
  12. 通过500 x g离心使珠子沉淀 g 孵育1分钟。将上清液转移至新的预冷的1.5 mL离心管中，加入50 µL Flag M2抗体偶联磁珠。
  13. 在 4 °C 条件下以 30 rpm 旋转 2.5 小时，然后用 500 µL 缓冲液 2 洗涤 2 次，再用 500 µL 缓冲液 3 洗涤 2 次。
  14. 最后洗脱时，加入100 µL含有Flag肽（浓度为0.1 µg/µL）的Buffer 3，4 °C旋转孵育1.5小时。
  15. 以 500 x g 离心 g 孵育1分钟，然后将上清液转移至新的预冷离心管中。
  16. 取10%（10 µL）用于SDS-PAGE电泳，并对凝胶进行银染以检测纯化质量。若纯化效果良好，则对剩余90%样品进行LC-MS/MS分析。

3. 质谱数据处理以生成泛素/类泛素蛋白修饰谱，并鉴定它们之间的显著差异

注意：质谱分析结果包含大量信息，包括每份样品中鉴定出的蛋白质的肽段总数以及每个蛋白质的峰面积值（前3个肽段面积的平均值10）。这些数据可使用肽段计数、峰面积值，或两者结合的方式进行处理。在使用峰面积进行计算时，由于这些数值通常在106数量级，因此在应用以下公式之前，需先将其除以该数量级。两种计数方法所得结果通常应表现出高度相关性。针对每个鉴定出的蛋白质，使用以下公式，其中：
v1 反应方程式中的化学平衡符号（⇌），用于说明勒夏特列原理。 未处理泛素样品中的肽段值（例如，Ub - 药物）
v2 反应方程式中的化学平衡符号（⇌），用于说明勒夏特列原理。 吉西他滨处理的泛素样品中的肽段值（例如，Ub + 药物）
k1 反应方程式中的化学平衡符号（⇌），用于说明勒夏特列原理。 未处理对照GFP样品中的肽段值（例如，GFP - 药物）
k2 反应方程式中的化学平衡符号（⇌），用于说明勒夏特列原理。 吉西他滨处理的对照GFP样品中的肽段值（例如，GFP + 药物）。

  1. 归一化：使用以下公式对经药物处理和未处理细胞中的泛素（Ubiquitin）和绿色荧光蛋白（GFP）信号值进行归一化。归一化后的 v = V，归一化后的 k = K。
    V1 = v1 × (∑v1 + ∑v2) / (2 × ∑v1)；V2 = v2 × (∑v1 + ∑v2) / (2 × ∑v2)
    K1 = k1·(∑k1 + ∑k2) / (2·∑k1)；K2 = k2·(∑k1 + ∑k2) / (2·∑k2)
  2. 背景去除：使用以下公式，从泛素样本的数值中减去对照样本（GFP）的数值，以获得两种条件下每种鉴定蛋白的特异性数值（V'1 和 V'2）。
    V'1 = V1 - K1，如果 V1 - K1 ≥ 0；V'1 = 0，如果 V1 - K1 < 0<0
    V'2 = V2 - K2，当 V2 - K2 ≥ 0；V'2 = 0，当 V2 - K2 < 0<0
  3. 泛素化修饰（Var）的变化。为了获得药物诱导的翻译后修饰（PTMs）正负变化的评分（介于 -100 至 +100 之间），使用以下公式：将处理组与未处理组样本特定数值之差除以所有数值之和（包括对照组中的数值，以便对在对照组GFP中也检测到的蛋白质进行惩罚），再乘以100。
    Var = (V'2 - V'1) / (V1 + K1 + V2 + K2) × 100；-100<变量<100 ;
    低于 -50（PTM 抑制）或高于 50（PTM 诱导）的变化通常被视为具有显著性。
  4. 置信度（Conf）。使用以下公式计算 0 到 100% 之间的置信度值：
    Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2)2)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ；若为0则 <0
    50 以上的数值通常被视为具有较高可信度。
  5. 为了获得更理想的诱导/抑制值分布，并同时考虑变异性和置信度参数，使用以下公式对 Var 和 Conf 值进行乘法运算，其中 V Chemical equilibrium symbol (⇌) in reaction equation, illustrating Le Chatelier's principle. Var 和 C Chemical equilibrium symbol (⇌) in reaction equation, illustrating Le Chatelier's principle. 会议
    =SI(V2>0;((V2*C2)^2)/(10^6);-((V2*C2)^2)/(10^6)
    注意：由于峰面积值通常比肽段计数更准确，因此可以使用专门用于解读此类数据的特定软件，例如 Perseus（https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus），并遵循其使用建议。

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结果

转导培养的哺乳动物细胞以构建表达 GFP 和 6HF-Ub 的细胞
为了产生后续用于转导 MiaPaCa-2 细胞的慢病毒，将 70% 汇合度的 HEK-293T 细胞共转染等量的三种质粒：pCCL-6HF-Ubiquitin、GFP/Delta-Helper 和 pvSvG。慢病毒产生 24 小时后，收集含有慢病毒颗粒的培养基并进行过滤。此时可通过倒置显微镜观察表达 GFP 的 293T 细胞的绿色荧光，以检测转染效率，荧光阳性细胞比例应接近 100%。MiaPaCa-2 细胞与慢病毒上清液共孵育 1 至 3 天。首先通过观察 GFP 转导细胞的 GFP 荧光来检测慢病毒转导效率（图 1A 上图）。不同细胞间的 GFP 表达水平可能有所差异，但所有细胞均应呈现荧光。完成该检测后，还需验证 Flag-泛素的表达情况，通常采用抗 Flag 抗体（通常为 M2 单克隆抗体）进行免疫荧光染色检测（图 1...

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讨论

我们已开发出一种稳健且可靠的方法，用于生成由泛素家族主要成员修饰的蛋白质谱型。事实上，我们已成功应用该方案生成了泛素、SUMO和Nedd8介导的翻译后修饰谱型，并检测了与治疗相关的改变7，以及在特定基因过表达或敲低（数据未显示）情况下，或在获得对多种化疗药物耐药表型的细胞中所发生的修饰变化。

在实验过程中，操作者需特别注意的步骤并不多。在吸取珠子（Ni-NTA 或抗 Flag 偶联珠）时，必须充分重悬珠子，尤其是抗 Flag 珠子，因其悬浮于黏稠的甘油缓冲液中；同时应剪去吸头末端一小段以增大孔径。另一个注意事项是应缓慢移液，以避免珠子堆积。其他关键步骤包括使用咪唑和 Flag 肽进行洗脱。洗脱后，必须使用洁净的汉密尔顿注射器收集上清液，以尽可能避免吸到仍结合有非特异性蛋白的珠子。

根据细胞类型和质谱分析所需的最终材料量，可相应增加或减少起始材料的用量。此时唯一需要调整的是镍珠的体积，应按照每1 mg裂解液蛋白使用2 µL镍珠的比例进行。有时纯化得到的蛋白量可能过低，此时应检测带标...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由法国抗癌联盟（La Ligue Contre le Cancer）资助HV和MS，由抗癌研究协会（ARC）资助PS，由法国国家癌症研究院（INCa）和普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸癌症研究中心（Canceropole PACA）资助JI。马赛蛋白质组学质谱平台（marseille-proteomique.univ-amu.fr）得到了IBISA（生物、健康与农学基础设施）、艾克斯-马赛技术平台、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸癌症研究中心（Cancéropôle PACA）、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区、帕奥利-卡尔梅特研究所（Institut Paoli-Calmettes）以及马赛癌症研究中心（Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ANTI-FLAG M2 亲和凝胶Sigma-AldrichA2220-5ML可结合所有 Flag 标签蛋白
抗 Flag M2 抗体Sigma-AldrichF3165用于检测 6His-Flag 标签的泛素/泛素样蛋白表达
细胞筛网 40 µmFalcon352350用于从盐酸胍裂解的细胞中去除漂浮的沉淀物
Flag 肽段Sigma-AldrichF3290从抗 Flag 珠粒中洗脱 Flag 标签蛋白
盐酸胍Sigma-Aldrich50933变性剂，用于使细胞裂解液中的所有蛋白质变性
咪唑Sigma-AldrichI5513从 Ni-NTA 珠粒中洗脱 6His 结合蛋白
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015用于转染 HEK-293T 细胞以产生慢病毒
低吸附管（Lobind 管）Sigma-AldrichZ666491避免珍贵样品的吸附损失
膜滤器，0.45 µmMilliporeHAWP04700F1用于过滤慢病毒上清液
Ni-NTAQiagen30210用于纯化 6His 标签蛋白

参考文献

  1. Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
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