体外重建分离细胞的空间接触模式 秀丽隐杆线虫 胚胎卵裂球与粘附性聚苯乙烯微珠

摘要

多细胞系统的组织复杂性使得识别细胞外信号与单个细胞行为之间的因果关系变得困难。本文介绍了一种利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎分裂球和粘附性聚苯乙烯微珠来研究接触依赖性信号与分裂轴之间直接关联的方法。

摘要

在多细胞系统中，单个细胞受到来自邻近细胞及周围环境的各种物理和化学信号的影响。这种组织复杂性使得识别外部信号与细胞动态之间的因果关系变得困难。通过人工重建的多细胞系统，研究人员能够在排除其他干扰因素的情况下，专门测试某一特定信号的作用，从而克服这一难题。本文介绍一种利用分离的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎细胞与黏附性聚苯乙烯微珠重建细胞接触模式的方法。该方法包括去除卵壳、通过破坏细胞间黏附来分离胚胎细胞、制备黏附性聚苯乙烯微珠，以及重建细胞-细胞或细胞-微珠之间的接触。最后，我们展示了该方法在研究细胞分裂轴方向中的应用，该方向在胚胎发育过程中对细胞空间排列和细胞命运决定具有调控作用。这一稳定、可重复且灵活的体外方法，能够用于研究细胞空间接触模式与细胞响应之间的直接关系。

引言

在多细胞发育过程中，单个细胞的细胞行为（例如分裂轴）由多种化学和物理信号所决定。理解单个细胞如何解读这些信息，以及它们如何作为一个涌现性状来调控多细胞结构的组装，是形态发生研究的最终目标之一。C. elegans 作为模式生物，在解析形态发生的细胞水平调控机制方面做出了重要贡献，例如细胞极性¹、细胞分裂模式¹、细胞命运决定²，以及组织尺度上的调控过程，如神经环路连接³和器官发生^4,5。尽管已有多种遗传学工具可供使用，但组织工程方法仍然有限。

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中，最成功的组织工程方法是经典的卵裂球分离法⁶；由于C. elegans胚胎被卵壳和通透性屏障所包围⁷，去除这些结构是该方法的主要步骤之一。尽管这种卵裂球分离方法能够以简化的方式重建细胞间的接触，但它无法消除不需要的信号；细胞接触仍然会带来机械性（例如黏附）和化学性信号，从而限制了我们全面分析信号与细胞行为之间因果关系的能力。

方案

1. 黏附性聚苯乙烯微球的制备

注意：本实验方案无需无菌操作技术。

1. 称取10 mg羧基修饰的聚苯乙烯微球，置于1.5 mL微量离心管中。
2. 用1 mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液清洗微球。由于MES缓冲液不含磷酸盐和醋酸盐（这些成分会降低碳二亚胺的反应活性），因此适用于蛋白偶联反应。涡旋振荡管子，使微球充分混匀。
3. 使用台式离心机在2,000 × g 条件下离心60秒。
4. 小心用移液器吸出上清液。
5. 按照步骤1.2–1.4，再用1 mL MES缓冲液清洗微球一次。
6. 向管中加入含10 mg EDAC的1 mL MES缓冲液，以活化微球表面的羧基基团。涡旋振荡管子，使微球充分混匀。
7. 将管子置于旋转混合器上，在室温下孵育15分钟。
8. 在2,000 × g 条件下离心60秒，使微球沉淀。
9. 小心用移液器吸出上清液。
10. 向管中加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）以清洗微球。涡旋振荡管子，使微球充分混匀。
11. 在2,000 × g 条件下离心60秒。
12. 小心用移液器吸出上清液。
13. 按照步骤1.10–1.12，再用1 mL PBS清洗微球一次。
14. 所用罗丹明的最终浓度取....

结果

在珠子制备过程中，我们确定了用于表达GFP-肌球蛋白II和mCherry-组蛋白的转基因品系的罗丹明红-X琥珀酰亚胺酯（Rhodamine Red-X succinimidyl ester）的最佳用量（图1A-D）。我们使用mCherry标记的组蛋白作为细胞周期进程的标记物。由于罗丹明红-X和mCherry均可被561 nm激光激发，因此罗丹明红-X信号的最佳强度应与组蛋白信号强度相当，以便同时对细胞和珠子进行成像。例如，用0.005 µg/mL罗丹明红-X琥珀酰亚胺酯处理的珠子荧光信号过弱，无法清晰观察珠子（图1A）；而用5 µg/mL罗丹明红-X琥珀酰亚胺酯处理的珠子荧光信号过强，干扰了mCherry-组蛋白的成像（图1D）。我们确定，对于该特定转基因品系，0.5 µg/mL罗丹明红-X琥珀酰亚胺酯为最佳浓度（图1.......

讨论

重建简化的细胞接触模式将使研究人员能够检验特定细胞接触模式在形态发生不同方面的作用。我们已利用该技术证明，细胞分裂轴受到与黏附微珠物理接触的调控¹⁰。由于分裂轴的确定通过影响形态发生¹⁴、干细胞分裂^15,16以及组织稳态^15,16，对多细胞发育至关重要，因此该方法有望揭示动物组织形成的新机制。

除了细胞分裂方向外，该方法还有望作为研究机械信号与细胞命运之间关系的平台。先前的研究报道，机械信号可调控细胞命运的决定。当在具有不同刚度的基质上培养时，人源间充质干细胞会分化为神经元、脂肪细胞、骨骼肌细胞和成骨细胞¹⁷。响应基质刚度，转录调控因子Yes相关蛋白（YAP）和TAZ（含PDZ结合基序的转录共激活因子）会转入.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐	Alfa Aesar	AAA1080703	用于微珠制备
吸液管组件	Drummond	21-180-13	用于卵裂球分离
秀丽隐杆线虫品系：N2，野生型	秀丽隐杆线虫遗传中心	N2	本研究使用的品系
秀丽隐杆线虫品系：KSG5，基因型：zuIs45; itIs37	本实验室	KSG5	本研究使用的品系
校准微量移液管，10 µL	Drummond	21-180-13	用于卵裂球分离
羧基修饰聚苯乙烯微珠（30 µm 直径）	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	用于微珠制备
CD脂质浓缩液	Life Technologies	11905031	用于卵裂球分离。在组织培养罩中操作。
Clorox	Clorox	N. A.	用于卵裂球分离。当次氯酸盐处理效果不佳时，应开启新瓶。
盖玻片架	本实验室	N.A.	用于卵裂球分离。
解剖显微镜：配备M支架的Zeiss Stemi 508，光源为内置LED，目镜放大倍数为10X	Carl Zeiss	Stemi 508	用于卵裂球分离。
胎牛血清，合格一次性装，加拿大来源	Gibco	A3160701	用于卵裂球分离。在组织培养罩中操作。
通用及精密滑动式皮下注射针头，25号	BD	14-826AA	用于卵裂球分离
菊粉	Alfa Aesar	AAA1842509	用于卵裂球分离
MEM维生素溶液（100倍浓缩）	Gibco	11120052	用于卵裂球分离。
MES（细白色晶体）	Fisher BioReagents	BP300-100	用于微珠制备
多孔玻片，10孔	MP Biomedicals	ICN6041805	用于卵裂球分离
PBS，磷酸盐缓冲液，10倍浓缩粉末	Fisher BioReagents	BP665-1	用于微珠制备
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140148	用于卵裂球分离。
聚乙烯吡咯烷酮	Fisher BioReagents	BP431-100	用于卵裂球分离
氯化钾	Bioshop	POC888	用于卵裂球分离
罗丹明红-X 琥珀酰亚胺酯，5-异构体	Molecular Probes	R6160	用于微珠制备
Schneider’s 果蝇无菌培养基	Gibco	21720024	用于卵裂球分离。在组织培养罩中操作。
氯化钠	Bioshop	SOD001	用于卵裂球分离
氢氧化钠溶液，10 N	Fisher Chemical	SS255-1	用于卵裂球分离
转盘共聚焦显微镜：Yokogawa CSU-X1，Zeiss Axiovert 倒置显微镜，Quant EM 512 相机，63X NA 1.4 平场复消色差物镜。系统由Slidebook 6.0控制。	Intelligent Imaging Innovation	N.A.	用于活体成像
注射器滤器，PTFE材质，非无菌	Basix	13100115	用于卵裂球分离。
Tygon S3 实验室管路，配方E-3603，内径3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	用于卵裂球分离。
Tygon S3 实验室管路，配方E-3603，内径6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	用于卵裂球分离。