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原代慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/胞质蛋白转运

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DOI：

10.3791/60426

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2019年10月23日

 ,  ,  , 
1Paul O'Gorman Leukaemia Research Centre, Institute of Cancer Sciences, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案可实现从原代慢性淋巴细胞白血病细胞中高效制备细胞核与细胞质组分，并对其进行优化。这些样品可用于确定蛋白质的定位，以及在细胞受到刺激或药物处理后，蛋白质在细胞核与细胞质区室之间转运发生的变化。

摘要

大分子物质的核输出在癌细胞中常常发生失调。肿瘤抑制蛋白（如p53）可能因异常的细胞定位而失活，从而破坏其作用机制。慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞以及其他癌细胞的存活，在一定程度上依赖于核质间转运的失调，这至少部分归因于转运受体XPO1的失调以及PI3K介导信号通路的持续激活。要深入理解这些蛋白在疾病病理生物学中的作用，必须明确各蛋白在其细胞内定位背景下的功能。此外，在亚细胞蛋白转运的背景下，识别细胞刺激所涉及的过程以及特定药理学抑制剂的作用机制，将有助于更全面地理解其作用机理。本文所述方案可实现从原代慢性淋巴细胞白血病细胞中高效、优化地制备细胞核和细胞质组分。这些组分可用于检测细胞刺激和药物处理后，蛋白在细胞核与细胞质组分之间转运的变化情况。所得数据可进行量化分析，并与免疫荧光图像平行呈现，从而提供可靠且可量化的结果。

引言

大分子在细胞核与细胞质之间的转运已被证实对正常细胞功能具有关键作用，而在癌细胞中这种转运常常发生失调1,2。此类失调可能源于调控核输出的蛋白质发生过表达或突变。其中一种蛋白——输出蛋白-1（Exportin-1, XPO1）是一种转运受体，可将超过>200种含有核输出信号（NES）的蛋白质从细胞核转运至细胞质2。XPO1的转运底物包括p53、FOXO家族成员和IB，通过抑制其作用机制导致这些蛋白失活1,2,3。当微环境信号作用于癌细胞时，还可能进一步引起蛋白质的错误定位，从而激活细胞内信号通路（如磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt通路），导致FOXO家族成员失活并随之从细胞核中被输出4,5。这种肿瘤抑制蛋白的错误定位已被证实与多种血液系统肿瘤及实体瘤的发生发展相关1,2,6。

开发用于血液系统恶性肿瘤（急性髓系白血病（AML）/慢性淋巴细胞白血病（CLL））临床治疗的小分子抑制剂，这些抑制剂可结合并选择性抑制XPO1功能，凸显了建立适当技术以评估药理学试剂对蛋白质在细胞核与细胞质之间穿梭影响的重要性6,7,8。成像技术已取得显著进展，能够在药物处理等外界刺激条件下识别蛋白质在亚细胞区室中的定位；然而，建立可靠且具有支持性的平行技术对于向科学界准确传达研究结果的有效性至关重要。

从患者血液样本中分离的静息淋巴细胞和恶性慢性淋巴细胞白血病B细胞（CLL-B细胞）在制备核与胞质组分时面临挑战，原因在于其核质比极高。为了规划未来的实验方案，优化实验条件以获得稳定且可靠的实验数据至关重要。本文所述方法可实现对核和胞质组分中蛋白质的定量，并确定细胞刺激和/或药物处理如何影响这些蛋白质的分布与表达水平。

方案

本研究所使用的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者原代样本已获得英国大格拉斯哥及克莱德NHS下属的苏格兰西部研究伦理服务机构批准，所有实验均依照批准的指南进行。

1. 从患者血液样本中分离CLL细胞

  1. 从已签署知情同意书的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者处获取来自诊所的外周血样本，样本保存于EDTA采血管中，并附有白细胞计数（WCC）。根据WCC值纯化外周血CLL样本。若WCC < 40 × 106 个细胞/mL，进行步骤1.1.1；若WCC ≥ 40 × 106 个细胞/mL，进行步骤1.1.2。
    1. 将所有EDTA采血管中的内容物倒入一个50 mL锥形离心管中，每1 mL血液加入50 µL人B细胞富集混合液。室温（RT）孵育20分钟。进入步骤1.1.2。
    2. 用室温CLL洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS），含0.5%胎牛血清（FBS）和2 mM EDTA）按1:1比例稀释样本。
  2. 根据样本体积，将适量室温密度梯度介质分装至适当大小的锥形离心管中（30 mL样本使用50 mL管加10 mL介质，或10 mL样本使用15 mL管加4 mL介质）。
  3. 小心地将样本叠加在密度梯度介质上方，于室温以400 × g 离心30分钟。
    注意： 离心前确保离心机处于室温，温度变化会影响单个核细胞的富集效果；同时关闭离心机刹车功能，因为突然制动可能破坏液体界面。
  4. 使用塑料巴氏吸管，轻轻吸取聚集在密度梯度介质与CLL洗涤缓冲液界面处的白色单个核细胞层，转移至新的50 mL锥形离心管中。
  5. 向分离得到的细胞层中加入40 mL CLL洗涤缓冲液以洗涤细胞，于室温以300 × g 离心10分钟。
  6. 弃去上清液，通过轻弹管底重悬细胞沉淀，然后重复步骤1.5中的洗涤步骤。
  7. 弃去上清液，按步骤1.6所述方法重悬细胞沉淀，再将其重悬于一定体积的CLL洗涤缓冲液中（最多40 mL，具体体积取决于细胞沉淀的大小）。
  8. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对细胞进行计数，随后进行流式细胞术检测CLL细胞纯度。
    注意： 此时CLL细胞可在实验所需培养基中以10 × 106 个细胞/mL的浓度进行培养，和/或以最高100 × 106 个细胞/管的浓度悬浮于含10%二甲基亚砜（DMSO）/FBS的冻存液中，用于后续实验的冷冻保存。

2. 慢性淋巴细胞白血病细胞的流式细胞术

  1. 按照表1所述标记12 mm × 75 mm的圆底聚苯乙烯管。
  2. 在2–5号管中各加入一滴补偿微珠，并置于冰上保存。向2–5号管中分别加入1 µL相应的抗体（抗CD5、CD19、CD23或CD45，具体见表1），冰上避光孵育20分钟（可用锡箔纸包裹冰桶以避光）。
    注意：这些管用于流式细胞术模板设置时的补偿对照。
  3. 将最多1 × 106个CLL细胞分别加入1、6和7号管中，每管加入2 mL FACS缓冲液（PBS + 2% FBS），在室温下以300 × g离心5分钟以洗涤细胞。弃去上清液，将含有细胞沉淀的管置于冰上保存。
    1. 重悬细胞沉淀，根据表1指示，将适当组合的抗体加入7号管细胞中，用FACS缓冲液调整终体积至100 µL。抗体使用浓度应符合制造商推荐。
    2. 用100 µL FACS缓冲液重悬2号和6号管中的细胞沉淀。
    3. 将细胞与2–5号管中已染色的微珠一起，在冰上避光孵育20分钟。
  4. 孵育结束后，向所有管中加入2 mL FACS缓冲液，在室温下以300 × g离心5分钟洗涤细胞。弃去上清液，通过轻轻弹动管壁重悬微珠/细胞沉淀。
  5. 用100 µL FACS缓冲液重悬1–5号管中的沉淀，置于冰上，待流式细胞仪分析时使用。
  6. 使用前立即用FACS缓冲液将DAPI溶液稀释至0.05–0.2 µg/mL。最佳浓度可能因情况而异，建议进行滴定优化。
  7. 用100 µL稀释后的DAPI溶液重悬6号和7号管中的细胞，冰上孵育至少5分钟，使细胞充分染色。
    注意：无需进一步洗涤，因为必须在缓冲液中保留DAPI以确保死细胞持续标记。加入DAPI后，细胞必须在4小时内完成流式细胞仪分析。
  8. 使用流式细胞仪分析细胞。

3. 慢性淋巴细胞白血病细胞亚细胞组分的制备

注意：在规划实验设置时，应包含一孔未刺激/未处理的细胞，用于制备全细胞提取物。

  1. 对 MEC1 CLL 细胞系或分离的原代 CLL 细胞进行所需的刺激和/或药物处理，使用 10 – 20 x 106 细胞/条件。随后将细胞用于亚细胞分级分离（步骤3.4） & 3.5）或制备全细胞提取物（步骤 3.6）。
  2. 溶液/试管的准备： 在收获细胞前，于分馏当天新鲜配制所有溶液/缓冲液。配制后的溶液需置于冰上保存，并在4小时内使用。
    1. PBS/磷酸酶抑制剂溶液：将磷酸酶抑制剂用1×PBS按1:20的比例稀释（例如，0.5 mL磷酸酶抑制剂加入9.5 mL 1×PBS中）配制而成。
      注意： 确保磷酸酶抑制剂未发生沉淀。若出现沉淀，于50 °C加热10分钟。
    2. 低渗缓冲液：通过将10倍浓度低渗缓冲液用蒸馏水按1:10稀释配制1倍浓度低渗缓冲液（例如，将50 μL 10x低渗缓冲液加入450 μL去离子水中）。2O)
    3. 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）：通过将1 M DTT用蒸馏水按1:100比例稀释配制10 mM DTT（即10 μL 1 M DTT加入990 μL dH₂O中）2O
      注意： DTT 极不稳定，每次使用时需新鲜配制。避免反复冻融。
    4. 完全裂解缓冲液：根据每个实验所需确定缓冲液体积。每个样本需要50 μL完全裂解缓冲液，因此将5 μL的10 mM DTT（步骤3.2.3）加入44.5 μL裂解缓冲液中，再加入0.5 μL蛋白酶抑制剂混合液。根据实验中样本数量可按比例放大该体积。
    5. 为每种刺激和/或药物处理分别标记四组1.5 mL微量离心管，用于盛装 freshly stimulated cells（步骤3.3）、新制备的胞质组分（步骤3.4.3）、新制备的核组分（步骤3.5.3）以及全细胞裂解液（步骤3.6.3）。将这些微量离心管预先置于冰上冷却，待用。
  3. 将细胞转移至分别标记的1.5 mL离心管中，于200 x g离心收集细胞沉淀 g 4 °C下离心5分钟。弃上清液，将细胞重悬于1 mL预冷的含磷酸酶抑制剂的PBS中（步骤3.2.1）。在200 x g条件下离心收集细胞 g 4 °C下离心5分钟。弃上清液，将细胞沉淀置于冰上保存。
  4. 细胞质组分的制备： 轻轻重悬用于亚细胞组分分离的细胞沉淀物于50 μL 1×低渗缓冲液中（步骤3.2.2）。将细胞置于冰上孵育15分钟，使细胞充分肿胀。
    注意： 低渗缓冲液体积可根据细胞数量凭经验适当增加。
    1. 向每个样本中加入 0.8 - 2.5 μL（1:20 至 1:60）去垢剂，并以最高转速涡旋震荡 10 秒。
      1. 为确定用于特定细胞类型以分离核与胞质组分的最适去垢剂浓度，应首先进行去垢剂浓度梯度实验。建议的浓度范围为1:20至1:60（即将2.5 μL至0.8 μL去垢剂加入50 μL低渗缓冲液中）即可满足需求。
        注意：如果调整步骤 3.4 中低渗缓冲液体积，需确保维持适当的去垢剂比例。
      2. 使用相差显微镜在加入去垢剂前后观察细胞，以验证细胞裂解效果。完整细胞体积较大，细胞核致密且呈深色，细胞质则表现为围绕细胞核的明亮晕轮。
        注意： 通过使用蛋白质印迹法分析去垢剂梯度产生的裂解组分中的特定蛋白质，进一步确认裂解是否充分。
    2. 裂解后，将样品在14,000 x g 4 °C下持续30秒。
    3. 小心地将上清液转移至预冷的、已标记的微量离心管中。 细胞质组分 可保存于 -80 °C，待后续分析时使用。剩余沉淀物含有细胞核组分（步骤 3.5）。
      注意： 避免对样本进行反复冻融。
  5. 细胞核组分的制备： 将每个细胞核沉淀物用50 μL完全裂解缓冲液（步骤3.2.4）通过反复吹打重新悬浮。
    注意： 完全裂解缓冲液的体积可根据起始细胞数量进行经验性调整。
    1. 加入2.5 μL去垢剂以溶解与核膜相关的蛋白质，并在最高转速下涡旋震荡10秒。将样品置于冰上孵育30分钟。
    2. 在最高转速下涡旋振荡30秒，然后以14,000 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。
    3. 将上清液转移至预冷的、已标记的微量离心管中。 细胞核组分 可保存于 -80 °C，待需要进一步分析时使用。
      注意： 避免样本反复冻融。
  6. 慢性淋巴细胞白血病细胞全细胞裂解液的制备
    注意： 全细胞提取物的制备可与核组分的制备（步骤3.5）同时进行。
    1. 将全细胞提取物沉淀用100 μL完全裂解缓冲液（步骤3.2.4中配制）通过反复吹打重悬，然后加入5 μL去垢剂以确保细胞完全裂解。将样品置于冰上孵育30分钟。
    2. 在最高转速下涡旋振荡30秒，然后以14,000 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。
    3. 将上清液转移至预冷的微量离心管中。这 全细胞裂解液 可保存于 -80 °C，直至需要进行后续分析。
      注意： 避免样本反复冻融。

4. 细胞亚组分的下游分析

注意： 在本方案中，使用标准方案通过蛋白质印迹法分析所获得的细胞组分，核组分和胞质组分每泳道上样等量细胞数（相当于约 10 µg 蛋白质）。

  1. 核质与胞质组分间蛋白质转运的定量分析： 使用免费的Western blot分析软件，通过信号强度定量或密度测定法进行定量Western blot分析。
  2. 导入图像： 由不同成像仪器生成的 Western 印迹图像必须以 JPG、PNG 或 TIFF 文件格式导入。建议使用 16 位深度的 RAW 文件。要导入图像，请点击软件图标并悬停于“Import”选项，然后点击“Third-Party Images”。选择图像文件并点击 打开.
  3. 显示图像： 在图像功能区中，单击 选择 按钮在 显示 组。该 调整显示 对话框将打开，以便在必要时进行进一步调整。实施额外的优化，包括 亮度 或 对比 使用可调节的滑块 图像查找表 标签。使用该 曲线 用于精细调节的选项卡。
  4. 数据分析（通道取消选择）：单击“分析”选项卡。若仅分析一个通道，请取消选择不参与分析的通道。在图像LUT中，单击相应通道的“不显示通道”缩略图，仅保留目标通道显示。以JPG、PNG或TIFF文件格式导入的图像可能需要取消选择多个不需要的RGB通道。
    1. 添加形状： 为了量化信号强度，请单击 添加矩形 在图像上添加一个矩形。单击某一特征的中心（例如，一条蛋白质条带），以在其周围放置一个矩形。或者，若要手动绘制形状，请选择 绘制矩形添加所有需要的图形后，单击 选择 将光标返回到选择工具。
      注意： 按逻辑顺序添加多个形状，因为数据是按照按顺序生成的 ID 号进行排序的。
    2. 背景扣除： 为消除背景噪声，请点击第一个按钮 背景 组和选择 中位数 从下拉菜单中选择。将边框宽度设置为 3 背景 对话并选择用于背景计算的片段。在选择片段时，应选取最能代表图像背景的片段。
      注意： 背景噪声可能影响信号的定量分析，因此必须将其扣除，以准确计算目标区域的信号。
    3. 裁剪信号和裁剪背景 - 可选： 以 JPG、PNG 或 TIFF 格式导入的文件可能出现像素饱和现象：蛋白质条带内出现高亮/明亮区域。 信号剪切 和 裁剪背景 （背景）从分析中移除饱和像素。要查看这些数值，请添加 Trim信号 和 背景修剪 点击表格 柱 表格视图右侧的按钮。
      注意： 像素饱和可能导致定量结果不可靠。仅当一个区域内饱和像素的比例低于5%时，才可将其移除。
  5. 导出数据： 点击 形状 表格上方的标签。进行密度测定法时，表格中的数值 信号 需要该列。信号值等于某一区域的像素强度总和（Total）减去背景值（Bkgnd）与面积（Area）的乘积。单击“报告”按钮。单击 另存为 或 启动电子表格.
    信号 = 总值 – (背景 × 面积)
    注意： “形状”选项卡提供了一个包含信号、总计、面积和背景等定量值的表格。
  6. 量化蛋白质表达： 在已保存的电子表格中，通过将目标蛋白的获得值除以相应条带或变量的内参蛋白值，计算每个条带或变量的目标蛋白标准化表达量 信号 目标蛋白 信号 用于相应的蛋白质上样对照条带。
    注意： 由于用于区分核组分与胞质组分的上样对照不同，因此不能直接比较核组分与胞质组分中目标蛋白的标准化含量。然而，在同一组分内进行比较（例如，药物处理后）是合理的。
  7. 导出图像用于出版或展示： 点击 图像 位于表格上方的标签，然后点击要导出的图像。如果将图像用于幻灯片演示或其他数字格式，请点击软件图标，将鼠标悬停在 导出 并点击 图像 用于 数字媒体根据需要将图像保存为 JPG、PNG 或 TIFF 文件。

结果

在设计针对原代CLL细胞的实验时，如果检测需要大量细胞（>50 × 106 细胞），优先使用新鲜分离的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞，而非需要解冻的冻存细胞，尽管这并不总是可行。这是因为冻融过程可能导致高达50%的CLL细胞死亡，但具体比例取决于样本。使用白细胞富集（WCC）进行CLL细胞富集 >40 x 106/mL，通过此处所述的密度梯度离心法（步骤1.3–1.5）可实现高细胞回收率，并获得高纯度（≥95%）的原代CLL细胞。在所示样本中，WCC = 177 × 106/mL：从30 mL血液样本中获得5 × 109 回收了细胞，占总细胞数的94%。通过流式细胞术分析该样品，结果显示CLL细胞纯度为 >经FSC/SSC设门后，DAPI阴性（活细胞）的单个细胞中CLL细胞标志物CD19和CD5双表面表达显示比例为95%图1).

通过在制备胞质组分期间使用不同比例的去垢剂（1:20 至 1:60）对亚细胞分级分离步骤进行了优化（步骤 3.4）。随后，制备核组分和全细胞裂解液（WCLs）（分别为步骤 3.5 和 3.6）。对慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞系 MEC1 所得的各组分进行免疫印迹分析图2A）以及原代CLL细胞（图2B）。通过检测核标记物Lamin A/C（核内；74/63 kDa）和细胞质标记物β-tubulin（细胞质内；55 kDa）来验证细胞分馏是否成功。分馏结果表明，MEC1细胞的最佳去垢剂稀释度为1:60图2A)，而慢性淋巴细胞白血病（CLL）原代细胞的最佳稀释度为1:30（图2B如组分中核蛋白富集而胞质蛋白缺乏，反之亦然. WCLs 代表总蛋白，可作为用于检测亚细胞组分的抗体的阳性对照。选择合适的蛋白质作为组分标记物至关重要： 图2C 显示了从MEC1细胞制备的核/胞质组分的免疫印迹结果，其中RNA聚合酶II（Rpb1 CTD；250 kDa）和Lamin A/C作为核组分标志物进行检测，而β-tubulin和γ-tubulin（50 kDa）则用作胞质标志物。结果清楚表明γ-tubulin在胞质中富集，但其在细胞核中亦有明显表达，与先前研究结果一致。9.

一旦实验条件得到优化，即可进行实验。在所示示例中，通过在存在或不存在mTORC1/2双抑制剂AZD8055的情况下刺激B细胞抗原受体（BCR），检测了MEC1细胞（图3A）和原代CLL细胞（图3B）中FOXO1在核与胞质组分中的亚细胞定位5,10。在这两个示例中，均成功获得了高度富集的核与胞质组分，表现为核组分中Lamin几乎专一性表达，而β-tubulin则仅在胞质组分中表达。在两种细胞类型中，与无药物对照（NDC）相比，经AZD8055处理后胞质中FOXO1表达水平降低，同时核内FOXO1表达增加，从而证明了蛋白的转位现象（图3）。为消除数据解读的主观性，对来自五个原代CLL样本的独立免疫印迹结果在亚细胞组分中进行了定量分析（步骤4；图4A），以各样本相应的核或胞质蛋白作为内部上样对照，并将每个组分归一化至未刺激（US）无药物对照（NDC）组。所得图表显示了FOXO1在核与胞质组分之间的迁移趋势：AZD8055降低了胞质中FOXO1的表达水平，同时增加了其在细胞核中的表达。此外，在BCR交联后，胞质中FOXO1的表达水平明显升高。

试管试管名称细胞/微珠抗原荧光素
1未染色细胞NANA
2单染微珠CD5FITC
3单染微珠CD19PE-Cy7
4单染微珠CD23APC
5单染微珠CD45APC-Cy7
6单染细胞活力DAPI
7CLL 染色细胞CD5、CD19、CD23、CD45 及活力FITC、PE-Cy7、APC、APC-Cy7 及 DAPI

表1：显示慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞流式细胞术所需理想样本管组合的表格。 每项实验必须包含所有适当的对照，以准确分析所获得的结果。

流式细胞术分析示意图；使用CD标记物鉴定淋巴细胞；散点图。
图1：慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本的代表性流式细胞术分析图。 从一名CLL患者的外周血中富集得到的单个核CLL细胞，首先通过FSC-A vs. SSC-A设门，随后利用FSC-A vs. FSC-H排除双联体（A）。使用未染色细胞（第1管）和补偿对照（第2–6管）对流式细胞仪进行设置，以识别细胞并完成荧光通道间的补偿，从而确保荧光信号被准确检测（B）。图中显示了CD19和CD5荧光通道中阴性染色（未染色细胞；第1管）的示例（C）。对活细胞（DAPI阴性）且CD45阳性的细胞进行设门后，进一步确定DAPI-CD45+细胞群体中CD19+CD5+细胞（95.5%）和CD19+CD23+细胞（91.2%）的比例（D）。请点击此处查看该图的放大版本。

Western blot 结果；核蛋白与胞质蛋白水平；Lamin、Tubulin；蛋白表达分析。
图 2：核/胞质分馏的优化。 从慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞系（A）MEC1 或（B）从患者外周血中富集的原代 CLL 细胞（如步骤 3 所述）的细胞沉淀（10 – 20 × 106 个细胞）中制备胞质和核组分以及全细胞裂解液（WCL）。通过在制备胞质组分时使用不同比例的去垢剂（1:20 至 1:60）（如步骤 3.4 所述）对亚细胞分馏条件进行优化。将所得样品进行免疫印迹，并用抗-Lamin A/C（核）和抗-β-tubulin（胞质）抗体探针检测，以确认分馏成功，并与 WCL 对照。分子量标记物显示在印迹左侧（M）。* 表示细胞裂解的最佳去垢剂条件。（C）MEC1 细胞在对照条件（NDC）或药物处理（8055）下，有或无刺激（分别表示为 + 或 – BCR 交联）时的核和胞质组分的免疫印迹。印迹使用抗-Rbp1 CTD（克隆 4H8；识别 RNA 聚合酶 II 亚基 B1）、抗-Lamin A/C、抗-β-tubulin 或抗-γ-tubulin（克隆 GTU-88）抗体进行探针检测，以鉴定亚细胞组分。请点击此处查看该图的放大版本。

核/胞质组分中BCR、FOXO1的Western印迹分析，以及Lamin A/C、β-Tubulin对照。
图3：亚细胞组分分离显示FOXO1在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中于细胞核与胞质之间的穿梭。（A）MEC-1细胞和（B）原代CLL细胞按所示，经100 nM AZD8055（8055）预处理30分钟或不作处理（NDC），随后进行BCR交联1小时或保持未刺激（US）。然后制备核与胞质组分并进行免疫印迹。通过抗-Lamin A/C（核）和抗-β-tubulin（胞质）抗体检测确认组分分离效果后，使用抗-FOXO1抗体评估药物处理和BCR交联对FOXO1蛋白表达的影响。M表示分子量标记物。请点击此处查看该图的放大版本。

FOXO1表达的蛋白质印迹及柱状图，包括细胞质和细胞核部分的密度分析。
图4：定量蛋白质印迹分析（密度测定）的示例。（A）使用在线可用的蛋白质印迹分析软件进行密度测定。简而言之，在“分析”工具栏中，围绕图像中的蛋白条带绘制矩形以计算信号强度。图中显示的是来自一名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本的代表性蛋白质印迹图像的密度测定结果，该样本经过了细胞质/细胞核分馏处理。细胞质和细胞核组分通过细胞质标志物（β-微管蛋白）和核标志物（Lamin A/C）的表达加以区分。特定条件下FOXO1的归一化表达可通过将FOXO1的信号强度除以相应细胞组分中β-微管蛋白或Lamin A/C的信号强度来计算。相对于未处理（US）载体对照的相对FOXO1表达，可通过将特定条件下的归一化FOXO1表达除以特定细胞组分中未处理载体对照的归一化FOXO1表达来计算。（B）图示在各细胞组分内相对于未处理-NDC（US-NDC）对照归一化的细胞质（左）或细胞核（右）组分中FOXO1的表达水平。图中的红点表示所示的计算示例。该数据显示了与US-NDC相比FOXO1表达的平均倍数变化（±SEM）。P值采用双尾配对Student t检验确定。n = 5个独立的CLL患者样本。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案提供了一种快速高效的方法，用于从原代慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中分离核与胞质组分，并在细胞受到刺激或药物处理后，定量分析蛋白质在核与胞质组分之间的转运情况。所展示的数据表明，在使用双重mTOR抑制剂AZD8055处理的同时，结合或不结合F(ab')2片段介导的B细胞受体（BCR）交联刺激，能够检测到特定蛋白（例如FOXO1）在核与胞质组分之间的转运（图3 和 图4）。将此类实验与来自单个CLL患者样本的Western blot定量结果相结合，可对所获得的数据进行客观分析，并验证该检测方法在量化来自患者队列的CLL细胞中蛋白质定位整体变化方面的稳健性（图4）。数据表明，在胞质组分中，约五个患者样本的平均结果接近显著性水平。鉴于CLL患者在临床上具有高度异质性11，通常应在更大规模的患者队列中开展此类分析，和/或聚焦于特定的预后亚组患者，以更全面地理解CLL细胞对特定药物治疗的细胞反应。

上述数据表明，选择仅存在于细胞质或细胞核组分中的蛋白质标记物至关重要，因为组分分离的纯度将通过这些标记物得以确认。本研究选用β-tubulin作为细胞质组分的验证标记，Lamin A/C作为细胞核标记。其他常用于识别细胞质组分的蛋白包括GAPDH和α-tubulin，而用于验证细胞核组分纯度的蛋白则包括Brg1（SMARCA4）、TFIID和RNA聚合酶II4,5。然而，在选择标记蛋白时必须谨慎，应避免使用在两种组分中均存在的蛋白，而应选择在特定组分中高度富集的蛋白（例如γ-tubulin）（图2C）9。事实上，尽管GAPDH和actin通常被视为细胞质蛋白，但它们也可定位于细胞核12,13，这凸显了在对细胞施加刺激或处理时，选择不会发生转位的组分标记物的重要性。此外，通过将全细胞裂解液（WCL）与亚细胞组分分离样品一同进行检测，以确认所选蛋白标记物在目标细胞中确实表达，这一步骤也十分重要。

在所示的代表性实验中，每种条件（刺激/药物处理）使用了相同数量的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞，随后立即制备分馏样品。每泳道上样10 µg分馏蛋白可为检测目标蛋白提供足够的材料。由于这些样品仅接受了短期药物处理和刺激（最长4小时），因此假设各样品中的蛋白水平保持不变，故未进行蛋白定量检测。然而，若细胞处理时间延长（18–72小时），细胞死亡或增殖的程度可能因所用药物或细胞刺激方式的不同而显著改变所提取蛋白的质量和数量，从而影响处理/刺激样品中的蛋白水平。在此类长期药物处理的情况下，建议在进行Western blot前，使用Bradford法或等效方法进行蛋白定量，以确保每个免疫印迹泳道中上样等量的蛋白。某些去垢剂可能干扰特定的蛋白定量检测14，可通过稀释细胞分馏蛋白样品来降低此类干扰。此外，应使用与待测样品相同稀释倍数的完整裂解缓冲液作为空白对照。

为了为本文所述结果提供支持性证据，可采用荧光显微镜进行平行实验，以分析FOXO1在慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞内的定位，从而直观展示这些发现5。此外，所获得的亚细胞组分还可用于后续下游分析中的酶活性测定或蛋白质组学分析。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Natasha Malik 博士对稿件的审阅。本研究由 Bloodwise 项目基金资助，授予 AMM（编号 18003）。FACS 分析设施由 Howat 基金会资助。MWM 获得了 Paul O’Gorman 白血病研究中心之友提供的博士生奖学金资助，JC 由 Paul O’Gorman 白血病研究中心之友资助，JH 获得 Bloodwise 项目基金（编号 18003）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Griener Bio one616201
3 mL巴斯德吸管格里纳生物一号612398
12 mm x 75 mm FACS 管Elkay2052-004
15 mL 离心管Griener Bio one188271
50 mL 离心管Griener Bio one227261
抗-CD5 FITC 抗体BD Biosciences555352表型表面标志物
抗-CD19 PE Cy7 抗体BD Biosciences557835表型表面标志物
抗-CD23 APC 抗体BD Biosciences558690表型表面标志物
抗-CD45 APC Cy7 抗体BD Biosciences557833表型表面标志物
抗-β-微管蛋白抗体细胞信号传导2146细胞质标记物
抗-γ微管蛋白小鼠抗体（克隆号 GTU-88）Sigma-AldrichT5326
抗-FoxO1（C29H4）兔抗体细胞信号转导2880
抗Lamin A/C抗体细胞信号传导2032核标记物
抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体细胞信号转导7076二抗
抗兔 IgG，HRP 标记抗体细胞信号传导7074二抗
抗Rpb1 CTD抗体（克隆4H8）细胞信号转导2629核标记物
BDFACS Canto IIBD Biosciences按需提供流式细胞仪
DAPI 溶液BD Biosciences564907活/死细胞鉴别剂
DMSOSigmaD2650
EDTASigma能量色散X射线光谱
胎牛血清Thermofisher10500064
GraphPad Prism 6GraphPad Software软件
Histopaque1077 密度梯度培养基SigmaH8889
HyperPAGE 10 - 190 kDa 蛋白分子量标准BiolineBIO-33066分子量标记物
Image Studio Lite（版本 5.2.5）LI-CORwww.licor.com软件
Labnet VX100Fisher Scientific涡旋震荡
核提取试剂盒Active Motif40010
OneComp eBeadsThermofisher01-111-42
台盼蓝溶液Thermofisher15250061
PageRuler Plus 预染蛋白质标准品赛默飞世尔科技26619分子量标记物
PBS 片剂Fisher ScientificBR0014G
RosetteSep 人B细胞富集试剂盒干细胞技术15064
Sigma 3-16PSciQuip离心
Sigma 1-15PKSciQuip离心

参考文献

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Western FOXO1 XPO1

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