研究肿瘤分泌性副体结扎对宏噬细胞活化的影响，使用可渗透膜支架共培养

最近的研究集中在癌细胞避免被免疫细胞检测、抑制局部免疫活化或在肿瘤微环境中产生耐受性肿瘤适应环境的能力。两大类肿瘤和免疫细胞相互作用已被描述，促进这些影响:接触介导相互作用或肿瘤分泌配体。肿瘤利用的接触介导免疫抑制的一个研究最充分和临床可治愈的机制是PD-L1的表达，它与T细胞上的PD-1相互作用，以抑制其激活和^{功能1，2。}对由多种活化免疫细胞表达的干扰素伽马（IFN®）作出反应，肿瘤细胞可以增加PD-L1的表达，导致PD-1表达活性T细胞的耗尽，从而阻止它们有效消灭肿瘤^细胞3。使用抗体来阻止PD-L1和PD-1之间的相互作用，目前用于治疗人类多种癌症^类型4。鉴于这一临床成功和其他，肿瘤衍生免疫抑制机制的鉴定和靶向越来越受到重视。

除了抑制适应性免疫外，肿瘤还已知会分泌抑制先天免疫细胞的亲炎反应的因素。肿瘤衍生或肿瘤诱导的分泌物，包括IL-6、IL-10、VEGF、IL-23和菌群刺激因子（CSF-1），已被证明能抑制肿瘤微环境中自然杀伤细胞（NK）、粒细胞和树突状细胞的抗肿瘤反应5、6、7。肿瘤细胞也可以分泌因子，扭曲肿瘤微环境中骨髓衍生细胞的招募和分化，促进抑制T细胞活^化8，9。

对肿瘤进展有深远影响的一种先天免疫细胞是巨噬细胞。多年来，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的存在一直被用作患者生存的负预^后10。免疫抑制性TAM抑制肿瘤免疫细胞介导清除的概念是在40^多年前提出的。最近，已经表明，巨噬菌体促进炎症反应可以降低调节，而亲肿瘤表型可以在肿瘤微环境中诱导。这些免疫抑制巨噬细胞有助于耐原反应，推动肿瘤进展和耐化学和免疫^治疗12。鉴于巨噬细胞往往是肿瘤最丰富的白细胞之一，恢复其肿瘤特异性免疫活性是抗癌治疗^{物13的潜在靶点。}

虽然肿瘤细胞和巨噬细胞之间的接触介导相互作用可以通过直接共培养进行建模，但使用渗透膜支持可以阐明哪些肿瘤分泌因子是免疫调节，而不会产生肿瘤-免疫细胞-细胞接触的潜在混淆影响。使用某种类似的方法，其他人已经证明了识别微胶质/神经元^{相互作用14}以及肿瘤细胞与中皮^细胞15分泌因子的潜力。我们还成功地利用这种共培养技术来描述肿瘤分泌蛋白Pros1的作用，这种蛋白质在用LPS和干扰素伽^马16刺激围层巨噬细胞后，作为促进炎症基因表达的抑制者的作用。在这里，我们描述了一个简单明了的方法，可以用来询问肿瘤分泌因子如何影响巨噬菌体活化。

与采集和使用鼠腹巨噬细胞有关的所有程序在北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC）进行，并经联合国哥伦比亚联合国委员会机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 巨噬菌体文化

注:本程序可以利用原发性围周巨噬细胞（如下所述）、骨髓衍生巨噬细胞或巨噬细胞系，如J774（ATCC）或RAW264（ATCC）。

1. 收获围膜巨噬细胞如前^{所述16，17}和板直接进入上腔0.4μm聚酯膜插入共培养6孔板（图1A）。
   注:每次分离的巨噬细胞的近似收率为1 x 10⁶个细胞，因此每孔的平均细胞数为±1.5±1.6 x 10⁵个细胞，在6孔板中。
2. 培养在Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM）/F12，10%胎儿牛血清（FBS），1x青霉素/链霉素，20纳克/mL巨噬细胞菌群刺激因子（M-CSF）3天在37°C，5%CO_2。
   注:上腔室包含1 mL培养基，下腔室填充1.5 mL。介质必须添加到每个腔室中。

2. 巨噬细胞肿瘤细胞的共培养

1. 在使用之前，按照ATCC推荐的组织培养方法，在各自的培养基培养上培养商用肿瘤细胞。
2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗粘附性肿瘤细胞一次，加入0.05%胰蛋白酶+乙烯二胺四乙酸（EDTA），并在37°C孵育，直到细胞分离。在含有培养基的FBS中重新悬浮细胞，使用血细胞计或细胞计数器定量化细胞总数，然后以220 x g向颗粒离心5分钟。
3. 在离心过程中，从含大噬细胞的可渗透膜支撑板的上下室吸气培养基，用新鲜的介质代替。
   1. 对于将镀肿瘤细胞的下腔，用1mL的培养基而不是1.5 mL填充，以允许增加细胞的足够体积。
4. 从DMEM/F12中的颗粒肿瘤细胞中吸收培养基，使用10%FBS、1x青霉素/链霉素和20纳克/mL M-CSF，浓度为3 x 10⁵细胞/mL。
5. 将0.5 mL的3 x 10⁵细胞/mL肿瘤细胞添加到所需井的下腔（图1B）。
   注:细胞可以立即治疗。

3. 共培养细胞的治疗

1. 为了诱导巨噬细胞亲炎基因表达，通过添加100纳克/mL IFN+和50纳克/mL LPS来单独或共同培养的巨噬细胞。
   1. 根据需要改变培养中治疗时间的持续时间。巨噬菌体活化发生在2小时内，一些肿瘤介导抑制发生8小时共培养24小时产生强健和一致的肿瘤衍生抑制。
      注:或者，通过添加白细胞介素-10（IL10）等因子，以及评估肿瘤分泌配体的效果，可以诱导巨噬细胞采用亲伤口愈合表型。
2. 作为一种负控制，文化巨噬细胞单独和离开未经治疗。作为一种正对照，使用100纳克/mL IFN+和50纳克/mL LPS单独培养的巨噬细胞。

4. 共培养细胞的下游分析

1. 所需孵育时间过后，根据需要分离细胞莱沙或条件培养基。
2. 为了分离细胞液化酶进行定量聚合酶链反应（qPCR）分析，从井的两腔中吸出介质，用2 mL的PBS清洗一次。将RNA液核酸缓冲液涂抹在含有巨噬细胞的顶室。轻轻刮擦膜以释放细胞解结，然后转移到收集管，以便根据RNA分离试剂盒制造商的协议进行进一步处理。

为了确定肿瘤分泌配体对巨噬菌体极化的影响，采用了所述程序。在没有肿瘤细胞的情况下培养的食管巨噬细胞被用作阴性（未经治疗=最左侧）和阳性（IFN+和LPS刺激=从左至左为2）对照（图2A）。或者，围肠巨噬细胞与B16F10黑色素瘤肿瘤细胞（ATCC）共同培养（图1A）。电镀后立即，细胞要么使用IFN®和LPS进行治疗，要么不进行治疗。在24小时培养后，采集巨噬细胞，制备RNA，并执行qRT-PCR，以测量亲炎基因的表达。使用此处描述的共同培养系统，我们表明，在B16F10肿瘤细胞存在的情况下共同培养的围膜巨噬细胞，但没有激活刺激（LPS + IFN®），不会增加亲炎相关基因的表达（图2A，B16F10膜/未经治疗）。这意味着肿瘤分泌配体本身不足以诱导亲炎基因表达，或者2）如果肿瘤分泌物有免疫活化，副体配体足以将其抑制到天真的水平。这种共培养方法表明，当由IFN®和LPS极化的巨噬细胞在肿瘤细胞存在的情况下培养时，对炎症相关基因表达的抑制减少多达60%（图2A，B16F10膜/IFN_LPS）。当鼠巨噬细胞系J774被取代围肠巨噬细胞时，观察到了相当水平的巨噬细胞亲炎基因抑制（图2B）。

我们以前的工作确定Pros1是一种肿瘤分泌因子，可以抑制巨噬菌体活化16。利用透膜支持共培养模型与ELISA结合使用，我们测定了24小时后在条件介质中的Pros1浓度。我们观察到，在IFN®和LPS治疗的条件介质中，B16F10黑色素瘤细胞Pros1在475纳克/mL= 120纳克/mL（图3）下表示。在相同条件下处理的食管巨噬细胞在61纳克/mL = 5纳克/mL时表示Pros1（图3）。有趣的是，当共同培养时，IFN+ 和 LPS 中处理良好的 Pros1 为 86 纳克/mL = 15 纳克/mL。这表明，1） 巨噬细胞消耗肿瘤分泌的Pros1或2）B16F10细胞分泌的Pros1量在巨噬细胞存在时大幅减少。图2和图3的结果都突出表明，当巨噬细胞与肿瘤细胞共同培养时，巨噬细胞活化和对羟基苯甲酰当谈到信号发生了深刻的变化。

图 1.渗透膜的架构支持肿瘤细胞与巨噬细胞的共同培养。正、负治疗控制可应用于单独培养的巨噬菌体井（A）。为了确定肿瘤分泌信号对巨噬细胞活化的影响，在渗透膜支持共培养板的上腔培养巨噬细胞，在下腔（B）培养的肿瘤细胞中培养。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2.肿瘤副体信号抑制巨噬菌体亲炎极化。炎症相关基因的巨噬细胞表达在未治疗或IFN+中通过qRT-PCR检测，LPS在肿瘤细胞存在或不存在的情况下刺激巨噬细胞。在通过渗透膜支持分离的肿瘤细胞存在时，在围膜巨噬细胞（A）或J774巨噬细胞系（B）中培养的亲炎基因的表达减少，从而通过副克原体可溶性配体传递该效应。*p < 0.05 相对于未经治疗， = p < 0.05 相对于 IFN+ 和 LPS 刺激。数据是均值 = SEM;p值由双尾学生考试计算。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3.肿瘤细胞和巨噬细胞的共培养导致在条件介质中发现的肿瘤分泌的副体配体量的变化。ELISA用于确定Pros1在肿瘤中单独、单独宏噬细胞或共培养的调节介质的浓度在24小时后。•p < 0.05 相对于未经治疗。p值由双尾学生考试计算。请点击此处查看此图的较大版本。

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