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方法文章

利用可渗透膜支持物共培养研究肿瘤分泌的旁分泌配体对巨噬细胞活化的影响

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DOI：

10.3791/60453

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2019年11月28日

 ,  , 
1Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 2O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham

本文内容

摘要

本文介绍一种利用可渗透膜支持物的方法，以促进研究肿瘤细胞通过非接触性旁分泌信号抑制免疫反应的机制。该系统适用于研究肿瘤分泌因子在抑制巨噬细胞活化中的作用。

摘要

肿瘤来源的旁分泌信号是局部免疫抑制中一个被忽视的重要组成部分，可导致有利于癌症持续生长和转移的微环境。旁分泌信号可能涉及不同类型细胞之间的直接接触，例如肿瘤细胞表面表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1直接相互作用，也可能涉及肿瘤细胞分泌配体以影响免疫细胞。本文介绍一种共培养方法，用于研究肿瘤分泌的配体对免疫细胞（巨噬细胞）活化的影响。该方法操作简便，使用市售的0.4 µm聚碳酸酯膜通透性支持物和标准组织培养板。在本方案中，巨噬细胞培养于上室，肿瘤细胞培养于下室。0.4 µm的物理屏障允许在排除细胞间直接接触干扰的情况下研究细胞间信号传递，同时使两类细胞共享培养基并暴露于相同的旁分泌配体环境中。该方法可与其他技术联合使用，例如通过基因改造巨噬细胞（如从基因敲除小鼠中分离巨噬细胞）或肿瘤细胞（如CRISPR介导的基因编辑），以研究特定分泌因子及其受体的功能。此外，该体系适用于常规分子生物学分析方法，如定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）或蛋白质印迹分析（Western blot），无需通过流式分选分离两种细胞群体。同样可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测分泌型配体的水平，以更深入理解多细胞类型背景下细胞信号动态交互过程。共培养时间也可根据研究需求灵活调整，以分析时间依赖性调控事件。该共培养体系是一种强有力的工具，有助于在免疫背景下深入研究肿瘤分泌的信号分子。

引言

近期研究聚焦于癌细胞逃避免疫细胞识别、抑制局部免疫活化，或在肿瘤微环境中形成具有免疫耐受性的促瘤环境的能力。已有研究描述了两类广泛的肿瘤细胞与免疫细胞相互作用，可促进上述效应：接触依赖性相互作用或肿瘤分泌的配体。其中，肿瘤所利用的接触介导免疫抑制机制中，研究最为深入且具有临床可行性的机制之一是PD-L1的表达，PD-L1可与T细胞上的PD-1相互作用，从而抑制T细胞的活化与功能1,2。在干扰素-γ（IFNγ）刺激下——该因子由多种活化的免疫细胞表达——肿瘤细胞可上调PD-L1的表达，诱导表达PD-1的活化T细胞发生耗竭，从而阻止其有效清除肿瘤细胞3。目前临床上已采用抗体阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用，用于治疗多种人类癌症4。鉴于此类临床成功及其他相关进展，识别并靶向肿瘤来源的免疫抑制机制正受到越来越多的关注。

除了抑制适应性免疫外，肿瘤还被证实会分泌多种因子，以抑制先天免疫细胞的促炎反应。肿瘤来源或肿瘤诱导产生的分泌物，包括IL-6、IL-10、VEGF、IL-23以及集落刺激因子（CSF-1），已被证明可抑制自然杀伤（NK）细胞、粒细胞和树突状细胞在肿瘤微环境中的抗肿瘤反应5,6,7。肿瘤细胞还可分泌因子，促使髓系来源细胞在肿瘤微环境中的募集和分化发生偏移，从而促进对T细胞活化的抑制8,9。

一种对肿瘤进展具有显著影响的天然免疫细胞是巨噬细胞。多年来，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的存在一直被用作患者生存预后的负面指标10。关于免疫抑制性TAMs会抑制免疫细胞介导的肿瘤清除作用的概念早在40多年前就已提出11。最近的研究表明，在肿瘤微环境中，巨噬细胞的促炎反应可被下调，同时可诱导其产生促肿瘤表型。这些免疫抑制性巨噬细胞可促进耐受性免疫反应，推动肿瘤进展并对化疗和免疫治疗产生抵抗12。鉴于巨噬细胞通常是肿瘤内最丰富的白细胞之一，恢复其针对肿瘤的免疫活性成为抗癌治疗的一个潜在靶点13。

虽然肿瘤细胞与巨噬细胞之间的接触介导相互作用可通过直接共培养进行建模，但使用通透性膜支持物可以揭示哪些由肿瘤分泌的因子具有免疫调节功能，同时避免肿瘤细胞与免疫细胞直接接触所带来的潜在干扰。采用类似的方法，已有研究展示了鉴定小胶质细胞/神经元相互作用14以及肿瘤细胞与间皮细胞相互作用15中分泌因子的潜力。我们此前也成功应用该共培养技术，证实了一种由肿瘤分泌的蛋白质Pros1在脂多糖（LPS）和干扰素-γ刺激腹腔巨噬细胞后，可抑制促炎基因表达的作用16。本文中，我们描述了一种简便的方法，可用于探究肿瘤分泌因子如何影响巨噬细胞的活化。

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方案

所有与小鼠腹腔巨噬细胞的收获和使用相关的操作均在北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC）进行，并经该校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 巨噬细胞培养

注意：本实验可使用原代腹腔巨噬细胞（下文将详细描述）、骨髓来源巨噬细胞，或巨噬细胞系，如 J774（ATCC）或 RAW264（ATCC）。

  1. 按照先前所述方法收获腹腔巨噬细胞16,17，并直接接种于0.4 µm聚酯膜插入式共培养6孔板的上室（图1A）。
    注意：每次分离获得的巨噬细胞数量约为1 × 106个细胞，因此在6孔板中每孔平均接种约1.5–1.6 × 105个细胞。
  2. 将收获的巨噬细胞在杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）/F12中培养，添加10%胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素和20 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），于37 °C、5% CO2条件下培养3天。
    注意：上室加入1 mL培养基，下室加入1.5 mL培养基，需分别为两个腔室添加培养基。

2. 肿瘤细胞与巨噬细胞的共培养

  1. 使用前，按照 ATCC 推荐的组织培养方法，在相应的培养基中培养 commercially available 肿瘤细胞。
  2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁肿瘤细胞一次，加入 0.05% 胰蛋白酶 + 乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 下孵育至细胞脱落。将细胞重悬于含胎牛血清（FBS）的培养基中，使用血细胞计数板或细胞计数仪定量总细胞数，然后在 220 × g 条件下离心 5 分钟以形成细胞沉淀。
  3. 离心过程中，吸去含巨噬细胞的可渗透膜支持板上下室中的培养基，并更换为新鲜培养基。
    1. 对于将要接种肿瘤细胞的下室，加入 1 mL 培养基而非 1.5 mL，以便为后续加细胞留出足够的体积空间。
  4. 吸去细胞沉淀中的培养基，将细胞重悬于含 10% FBS、1× 青霉素/链霉素和 20 ng/mL M-CSF 的 DMEM/F12 培养基中，调整细胞浓度为 3 × 105 个细胞/mL。
  5. 向目标孔的下室中加入 0.5 mL 浓度为 3 × 105 个细胞/mL 的肿瘤细胞（图 1B）。
    注意：细胞可立即进行处理。

3. 共培养细胞的处理

  1. 为诱导巨噬细胞促炎基因表达，可通过加入 100 ng/mL IFNγ 和 50 ng/mL LPS 处理单培养或共培养的巨噬细胞。
    1. 根据需要调整培养中的处理时间。巨噬细胞激活在 2 小时内发生，而某些肿瘤介导的抑制效应在 8 小时内出现。共培养 24 小时可获得显著且稳定的肿瘤来源抑制效应。
      注： alternatively，可通过添加白细胞介素-10（IL10）等因子诱导巨噬细胞转化为促伤口愈合表型，并评估肿瘤分泌配体的作用。
  2. 作为阴性对照，将巨噬细胞进行单培养且不予处理。作为阳性对照，用 100 ng/mL IFNγ 和 50 ng/mL LPS 处理单培养的巨噬细胞。

4. 共培养细胞的下游分析

  1. 在完成所需的孵育时间后，根据检测需求，收集细胞裂解液或条件培养基。
  2. 若需提取细胞裂解液用于定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，吸除孔中两个腔室的培养基，并用 2 mL PBS 洗涤一次。向含有巨噬细胞的上层腔室加入RNA裂解缓冲液。轻轻刮取膜以释放细胞裂解液，并转移至收集管中，按照RNA提取试剂盒制造商的说明书进行后续处理。

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结果

为确定肿瘤分泌的配体对巨噬细胞极化的影响，采用了上述实验方法。将未与肿瘤细胞共培养的腹腔巨噬细胞作为阴性对照（未处理组 = 最左侧）和阳性对照（IFNγ与LPS刺激组 = 第二列）nd 从左至右）对照组（图 2A）。或者，将腹腔巨噬细胞与B16F10黑色素瘤细胞（ATCC）共培养（图1A）。铺板后立即用IFNγ和LPS处理部分细胞，其余细胞不作处理。培养24小时后，收集巨噬细胞，提取RNA并进行qRT-PCR，以检测促炎基因的表达水平。利用本研究所述的共培养系统，我们发现，在无激活刺激物（LPS + IFNγ）的情况下，与B16F10肿瘤细胞共培养的腹腔巨噬细胞并未上调促炎相关基因的表达图2A，B16F10细胞膜/未处理）。这表明肿瘤分泌的配体本身：1）不足以诱导促炎基因表达，或2）即使肿瘤分泌物引起免疫激活，旁分泌配体也足以将其抑制至初始水平。该共培养方法表明，当经IFNγ和LPS极化的巨噬细胞与肿瘤细胞共同培养时，炎症相关基因表达的抑...

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讨论

本文介绍的共培养实验方法是对已有实验方法的改进，可用于研究肿瘤细胞分泌因子对免疫细胞活化的影响。尽管已知细胞间的直接接触可引起免疫活性的变化，但肿瘤分泌的配体对免疫活化调控的作用机制仍了解较少。本文描述的方法不同于直接共培养，能够排除细胞接触介导信号传导的干扰，专门用于探究肿瘤来源的分泌因子如何影响免疫细胞的活化。鉴于肿瘤分泌配体在免疫抑制中的潜在临床重要性，该方法提供了一种简便易用的工具，可用于研究直接共培养无法解决的此类机制问题。

该共培养方法的核心是将巨噬细胞（原代细胞：腹腔驻留细胞、骨髓来源细胞或巨噬细胞系）与肿瘤细胞（细胞系或原代细胞）在无物理接触的条件下进行共同培养。关键在于，需将巨噬细胞培养于孔径为0.4 µm的聚酯膜插入式培养小室上，以允许肿瘤细胞分泌的配体自由通透，同时防止巨噬细胞可能通过滤膜发生迁移。此外，向上下两层培养室中加入指定体积的培养基也至关重要，以确保细胞获得充分的覆盖面积。实验设计时还需考虑设置仅含一种细胞类型的对照组，这是共培养实验规划中的另一个关键因素。其他若干因素（下文将详细描述）也可能影响检测结果，因此在研究设计过程中必须充分考虑每一项因素。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Eric Ubil 的部分经费来自美国癌症协会博士后奖学金（128770-PF-15-216-01-LIB）。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助（R01-CA205398）以及乳腺癌研究基金会（BCRF-18-041）授予 HSE 的奖项支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B16-F10ATCCATCC CRL-6475
cDNA合成试剂盒PromegaA3500
DMEM/F12培养基ThermoFisher Scientific- Gibco11320033
胎牛血清MilliporeTMS-013-B
J774A.1ATCCATCC TIB-67
大肠杆菌O111:B4脂多糖Sigma-AldrichL5293-2ML
小鼠M-CSFProspecCYT-439
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）ThermoFisher Scientific- Gibco15140122
Pros1 ELISA试剂盒MyBioSourceMBS2886720
RAW264.7ATCCATCC TIB-71
重组小鼠IFNγBioLegend575302
Sensimix SYBR Low-ROX试剂盒BiolineQT625-05
Transwell可渗透支持膜Fisher Scientific07-200-170
胰蛋白酶-EDTAThermoFisher Scientific- Gibco25200056

参考文献

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旁分泌信号传导肿瘤分泌配体共培养方法可渗透膜支持肿瘤免疫抑制蛋白S蛋白质印迹干扰素γ促炎基因
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