方法文章

光遗传学调控心肌细胞活性的机电评估

DOI：

10.3791/60490

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2020年3月5日

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1Institute for Experimental Cardiovascular Medicine, University Heart Center Freiburg-Bad Krozingen, Medical Center-University of Freiburg, 2Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Faculty of Biology, University of Freiburg

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提出了一种评估GtACR1激活在兔心肌细胞中机电效应的实验方案。本文详细介绍了细胞分离、培养与腺病毒转导，以及采用膜片钳和碳纤维技术进行的功能实验。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在过去的二十年中，光遗传学工具已被确立为调控可兴奋组织（包括心脏）中特定细胞类型活性的有力手段。虽然通道视紫红质-2（ChR2）常用于去极化心肌细胞（CM）的膜电位，从而可能引发动作电位（AP），但长期以来一直缺乏一种能够可靠抑制CM活性的有效工具。已有研究建议使用阴离子通道视紫红质（ACR）实现光遗传学抑制。本文介绍了一种评估天然ACR蛋白GtACR1（来源于Guillardia theta）在培养的兔心肌细胞中激活效应的实验方案。主要检测指标包括电生理全细胞膜片钳记录以及对心肌细胞收缩的光学追踪，两者均在施加不同模式的光照刺激条件下进行。该方案涵盖从兔心脏分离心肌细胞、细胞接种与培养（最长4天）、通过编码光控氯离子通道的腺病毒进行转导、膜片钳与碳纤维装置的准备、数据采集与分析等步骤。采用全细胞构型的膜片钳技术，可在电压钳模式（V-clamp）下实时记录光激活电流，或在电流钳模式（I-clamp）下记录动作电位（AP）。除膜片钳实验外，我们还开展收缩力测量，以在不干扰细胞内环境的前提下对心肌细胞功能活性进行评估。具体方法是利用碳纤维对细胞施加机械预负荷，并通过追踪肌节长度和碳纤维间距的变化来记录收缩情况。数据分析包括从I-clamp记录中评估动作电位持续时间、从V-clamp记录中测定峰值电流，以及基于碳纤维测量结果计算收缩力。本方案可用于测试不同光遗传效应分子对心肌细胞活性的生物物理效应，这是深入理解光遗传学在心脏组织及完整心脏中作用机制的前提。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

首次在单细胞绿藻的眼点中记录到由ChR介导的光电流1,2。在对Chlamydomonas reinhardtii的ChR1和ChR2进行基因克隆并实现异源表达后不久，ChR即被用作通过光调控非洲爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞膜电位的工具3,4。这种对阳离子无选择性的ChR可使静息膜电位负于ChR反转电位的细胞膜发生去极化。因此，ChR可用于在可兴奋细胞（包括神经元和心肌细胞）中诱发动作电位（AP），从而实现光学起搏5,6。

与阳离子通道视紫红质（ChR）相补充，光驱动的质子泵、氯离子泵和钠离子泵7,8,9 已被用于抑制神经元活动10,11,12。然而，这些泵存在局限性，需要高强度光照和持续照射，因为每个吸收的光子仅转运一个离子。2014年，Wietek 等人和 Berndt 等人分别独立报道了通过通道孔区域的突变将阳离子传导型 ChR 转变为阴离子通道视紫红质（ACR）13,14。一年后，天然 ACR 在隐藻 Guillardia theta（GtACR）中被发现15。由于工程化 ACR 仍表现出残余的阳离子电导，因此被天然 ACR 所取代，后者具有较大的单通道电导和高光敏感性15。GtACR 通过将膜电位极化至氯离子的反转电位来实现神经元活动的沉默16,17。Govorunova 等人将 GtACR1 应用于培养的大鼠心室心肌细胞（CM），并在低光强下实现了高效的光抑制，该光强不足以激活此前可用的抑制工具（如质子泵 Arch）18。我们课题组近期报道，GtACR1 介导的心肌细胞光抑制机制基于去极化，因此 GtACR1 也可用于心肌细胞的光学起搏19。

本文介绍了一种研究GtACR1光激活对培养的兔心室心肌细胞（CM）电生理和机械效应的实验方案。我们首先描述了细胞分离、培养和转导过程。采用全细胞膜片钳记录技术测量电生理效应，在电压钳模式下评估特定膜电位下的光介导电流。在电流钳模式下，通过电刺激或光刺激心肌细胞来测量膜电位动态变化。通过持续光照应用测试光抑制对电触发动作电位（AP）的影响。机械效应通过碳纤维结合基于成像的肌节长度追踪技术进行测量。为此，将可进行光刺激的细胞通过在细胞两端相对的质膜附近附着两根碳纤维实现机械预负荷。在光刺激或电刺激过程中记录肌节长度的变化。最后，在细胞电场刺激过程中测量光抑制效应，并分析所产生的力。

该方案包括以下步骤，如图1流程图所示：兔深麻醉、戊硫喷妥过量注射、心脏切除、Langendorff灌注及组织消化、机械分离组织以释放细胞、心肌细胞得率的显微镜分析、心肌细胞培养、用5型腺病毒转导，随后进行孵育和功能实验。

兔心肌细胞分离过程、Langendorff灌流、腺病毒转导、孵育
图1：获取可电刺激和光刺激心肌细胞（CM）的实验流程图。 从9-10周龄的兔体内取出心脏，利用Langendorff装置进行灌流并同时消化心脏组织。通过机械振荡使细胞释放。在显微镜下计数获得的CM数量。将CM进行培养，使用5型腺病毒进行转导，并在转导后48-72小时开展功能实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

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所有兔类实验均依照欧洲议会关于用于科学目的动物保护的第2010/63/EU号指令中的规定进行，并已获得德国巴登-符腾堡州（弗莱堡政府地区管理局，X-16/10R）当地主管部门的批准。

1. 细胞分离溶液

  1. 根据以下要求（表1）以及 表2 中列出的离子组成，使用水配制细胞分离所需的溶液。
    注意：CaCl2 和 MgCl2 从 1 M 储存液中添加。
水的要求
电导率 [µS/cm]（25 °C 时）0.055
内毒素 [EU/mL]< 0.001
颗粒物（尺寸 > 0.22 µm）[个/mL]≤ 1
总有机碳 [ppb]< 5
微生物 [CFU/mL]≤ 1
RNase [ng/mL]< 0.01
DNase [ng/mL]< 4

表1：水的需求量。

生理盐水溶液（1）低钙高钾溶液（2）酶溶液（3）封闭溶液
NaCl [mM]137137137137
KCl [mM]4141414
HEPES [mM]10101010
Creatine [mM]10101010
Taurine [mM]20202020
Glucose [mM]10101010
MgCl2 [mM]1111
Adenosine [mM]5555
L-Carnitine [mM]2222
CaCl2 [mM]1-0.10.1
Na-Heparin [IU/L]5000---
EGTA [mM]-0.096
Collagenase type 2, 315 U/mg [g/L]--0.6-
Protease XIV [g/L]--0.03-
Bovine serum albumin [%]---0.5
Osmolarity [mOsmol/L]325 ± 5345 ± 5345 ± 5345 ± 5

表2：心肌细胞分离用溶液。

  1. 将所有溶液调节至37 °C时pH为7.4，并检测渗透压。
    注意：在心脏切除前直接溶解酶（胶原酶II型和蛋白酶XIV）。使用前对所有溶液进行氧合。

2. 兰格多夫灌流装置的准备

注意：所使用的装置为定制装置。如图2所示，该装置由三个带水套的储液罐（1-3）、一个螺旋式逆流热交换器（4）以及一个带水套的灌流容器（5）组成。

氧气吸收实验装置；用于气体交换分析的化学仪器示意图。
图 2：优化用于兔心细胞分离的兰格多夫灌流装置。 （1-3）带水套的储液罐，分别盛装（1）生理盐水溶液、（2）低钙高钾溶液和（3）含酶的心脏停搏液。（4）螺旋逆流热交换器和（5）带水套的收集罐。水套系统的流入端为螺旋热交换器（经热交换器末端灌流套管流出的溶液温度应恒定在 37 °C），随后连接灌流容器及三个储液罐。所有溶液均经过氧合（虚线所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 启动水浴泵，使水在换热系统中以 38 °C 循环，并将所有溶液预热至 37 °C。
    注意：（4）出口处的温度必须控制在 37 °C 并保持恒定。
  2. 将三种溶液分别加入三个储液罐中，并用相应的溶液冲洗每条管路（黑色）。最后使用溶液（1）将主（蓝色）管路充满，确保无气泡。从储液罐（3）到旋塞的管路中填充低钙、高钾溶液。
    注意：在使用前（10 分钟）及使用过程中需对溶液进行氧合。
  3. 准备缝线，用于在插管处围绕主动脉结扎心脏。

3. 细胞分离

  1. 准备以下注射器：
    1. 用于镇静/麻醉：按 0.5 mL/kg 体重取盐酸艾司氯胺酮（25 mg/mL），按 0.2 mL/kg 体重取盐酸赛拉嗪（2%），混合使用。
    2. 用两个注射器各抽取 12 mL 氯化钠溶液（0.9%）。
    3. 准备 6 mL 浓度为 12.5 mg/mL 的硫喷妥钠溶液，用 0.9% 氯化钠溶液溶解。
    4. 在注射器中抽取 0.2 mL 盐酸艾司氯胺酮（25 mg/mL）。
    5. 将 0.2 mL 肝素钠（5,000 IU/mL）用 1 mL 0.9% 氯化钠溶液稀释（终浓度为 1,000 IU/mL）。
  2. 通过肌肉注射盐酸艾司氯胺酮和盐酸赛拉嗪（步骤 3.1.1）对兔子（9–10 周龄，新西兰白兔，雌性或雄性，体重约 2 kg）进行镇静/麻醉。
    注意：兔子至少需要 10 分钟才能完全麻醉；确切时间取决于其体重。通过翻正反射消失确认麻醉效果。
  3. 剃除胸部及耳部静脉所在区域的毛发。
  4. 将柔性导管插入耳缘静脉，用胶带固定，并用 0.9% 氯化钠溶液冲洗导管。
  5. 静脉注射 1 mL 肝素钠溶液，并用 0.9% 氯化钠溶液冲洗。
  6. 注射 0.2 mL 盐酸艾司氯胺酮，再次用 0.9% 氯化钠溶液冲洗，随后注射硫喷妥钠直至呼吸停止。
    注意：兔子应无足底回缩反射反应。
  7. 从左侧打开胸腔并去除心包膜。
  8. 心脏离体后立即启动计时器，并用生理盐水溶液清洗心脏两次。
    注意：使用圆头剪刀以避免意外损伤心肌组织。
  9. 将主动脉插入盛有生理盐水溶液的浴槽中，并保持所有组织浸没于溶液中。启动 Langendorff 灌流系统（生理盐水溶液（1），流速 24 mL/min）。
  10. 将心脏转移至 Langendorff 灌流装置，将主动脉连接至灌流液喷嘴，并用缝线将心脏紧固在导管上（围绕主动脉结扎）（< 1 分钟）。
    注意：在转移前预先充满导管内的生理盐水溶液，确保从插管位置到 Langendorff 装置的运输过程中无气泡进入导管，连接时应无气泡。
  11. 持续灌流心脏，直至血液完全冲洗干净（2–3 分钟）。
  12. 切换至低钙、高钾溶液（2），待心脏停止跳动后再灌流 2 分钟，随后切换至酶解溶液。
  13. 从消化开始 2 分钟后，将酶解溶液开始循环回储液器。消化 5 分钟后，将流速降低至 16 mL/min。
  14. 当组织呈现柔软状态（消化 40–50 分钟后），将心脏从导管上剪下，并分离左心室。
  15. 在阻断溶液中通过机械解离释放细胞（使用移液器轻轻撕开组织，同时用精细镊子夹持组织）。
  16. 将细胞悬液通过滤网（孔径 1 mm2）过滤，并在 22 × g（重力加速度）下离心 2 分钟。
  17. 弃去含有非心肌细胞的上清液，将心肌细胞（CM）重新悬浮于阻断溶液中。

4. CM 的培养

注意：以下步骤需在无菌条件下进行。

  1. 将层粘连蛋白（来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基底膜，1 mg/mL）用无钙无镁的无菌磷酸盐缓冲液按1:10比例稀释2+/毫克2+) 至终浓度为 100 µg/mL。
  2. 在 M199 培养基中加入如上所述的补充物，配制培养液 表3.
M199 培养基中的细胞培养液
肌酸 [mM]5
L-肉碱盐酸盐 [mM]2
牛磺酸 [mM]5
丙酮酸钠 [mM]1
胰岛素（牛胰腺）[U/L]0.25
胞嘧啶-β-D-阿糖呋喃苷 [mM]0.01
庆大霉素 [mg/mL]0.05

表3：细胞培养基。

  1. 将溶液经无菌滤器（0.22 µm）过滤，并添加5%胎牛血清。
  2. 用于膜片钳实验时，将直径16 mm、厚度0号的盖玻片进行高压灭菌，并在接种培养前直接用100 µg/mL层粘连蛋白（laminin）包被。
  3. 用于碳纤维实验时，用聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（poly-HEMA，0.12 g/mL溶于95:5 EtOH:H2O）包被培养皿表面，待其凝固。
    注意：细胞不会黏附于poly-HEMA包被的培养皿表面；这一点对于细胞力学研究中实现无摩擦收缩至关重要。
  4. 心肌细胞（CM）重悬后静置约10–15分钟，待其沉降后吸除上清液，再用培养基重悬心肌细胞。
  5. 使用Neubauer计数板对心肌细胞进行计数，并以17,500个细胞/mL的目标密度接种于层粘连蛋白包被的盖玻片或poly-HEMA包被的培养皿中。
  6. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养3–4小时，随后更换接种于盖玻片上的细胞的培养基（37 °C）。
  7. 加入编码GtACR1-eGFP的腺病毒（5型），感染复数（MOI）为75，在转导48小时后开始功能实验。
    注意：转导后需将细胞置于避光环境中。操作蓝光或绿光激活蛋白时应使用红光照明。本实验采用商业化的腺病毒递送系统（见材料表），将编码GtACR1-eGFP的基因克隆至腺病毒载体中。目的插入片段（此处为GtACR1-eGFP）通过PCR扩增后，与包含CMV启动子的腺病毒载体在IN-Fusion克隆反应中连接。CMV（人巨细胞病毒）启动子常用于驱动外源基因在哺乳动物细胞中的过表达。eGFP是源自Aequorea victoria的增强型绿色荧光蛋白，激发波长最大值为488 nm，发射波长最大值为507 nm。腺病毒（5型）由柏林夏里特医学院药理学研究所（Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin）Michael Schupp教授博士团队外部制备。
    注意：腺病毒转导操作属于生物安全二级（BSL-2）实验，依法须采取相应的安全防护措施。

5. 功能实验

注意：使用倒置荧光显微镜进行记录。在聚光镜中使用红色带通滤光片（630/20 nm）过滤透射光，以避免共激活 GtACR1。

  1. 膜片钳装置
    1. 使用放大器与模数转换器联用。使用数据采集软件记录电流和电压数据（参见材料表）。
      注意：记录的数据以 10 kHz 采样，5 kHz 滤波。
  2. 碳纤维装置
    1. 使用相机通过追踪光学对比度的变化来检测碳纤维位置和肌节长度（碳纤维表现为较暗的结构，叠加在细胞的横纹图案上）。装置的示意图见图3。
      注意：肌节长度通过快速傅里叶变换（FFT）对横纹图案的功率谱进行实时计算。

荧光显微镜装置示意图：场刺激、相机、数据采集、LED激发。
图3：碳纤维测量实验装置示意图。（示意图未按比例绘制）。将两根碳纤维附着于细胞上，并通过压电定位器控制其位置。起搏器用于电场刺激。多色LED通过倒置显微镜的落射荧光接口耦合，用于照射物平面上的细胞。LED的功率通过专用控制盒进行调节，该控制盒通过数模转换器（DAC）的数字输出接收数字脉冲。DAC通过模拟输出与荧光系统接口通信。用于细胞成像的黑白相机（774像素 × 245行）连接至计算机，用于追踪肌节长度和碳纤维弯曲情况。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 定时照明
    1. 通过外部定制的LED控制盒提供荧光显微镜成像及光控离子通道激活所需的光照，该控制盒包含三种不同颜色的LED（460 nm、525 nm、640 nm，参见材料表）。
    2. 修改控制盒的微控制器和图形用户界面（GUI）代码，使其可通过数据采集软件协议生成的外部TTL脉冲（Time to Live pulses）控制LED（参见材料表）。通过数模转换器将TTL脉冲传输至LED控制盒。
    3. 通过GUI驱动LED并设定脉冲数量。当接收到GUI指令后，微控制器将在一个新的核心上启动一个进程，在该进程中持续检测TTL输入信号以及由GUI设置的控制开关状态。
    4. 当TTL输入为高电平时，微控制器开启LED，随后继续监测TTL输入。一旦TTL信号回落至零，微控制器关闭LED，并将剩余脉冲数减一。若在任意时刻控制开关为关闭状态或剩余脉冲数为零，微控制器将终止该进程，直至接收到新的GUI指令。
    5. 将LED直接耦合至显微镜的后端接口。
  2. 物平面光照强度的测定
    1. 使用载物台测微尺测量照明区域（物镜放大倍数40倍，A = 0.8 mm2）。
    2. 使用光学功率计（参见材料表）。
    3. 设定实验参数：激发波长（525 nm）、物镜放大倍数（40倍）、激发滤光片（530/20 nm）或反射镜，并在不同LED输入电压下读取光功率[W]。
    4. 通过将光功率[W]除以照明面积[mm2]（此处为0.8 mm2）计算光强度[W/mm2]。
      注：在步骤5.6中使用相应协议测量实际光功率，以确认10 ms的短光脉冲是否达到设定值，以及长时间照射是否能维持设定强度（补充图1）。
  3. 膜片钳实验的准备工作
    1. 配制以下外部和内部溶液（表4；用水要求参见表1）。
    2. 用葡萄糖调节渗透压至300 ± 5 mOsmol/L。将内液分装后于-20 °C保存。
      注：记录当天将内液置于冰上保存，外液保持室温。此处描述的膜片钳溶液基于先前使用的配方，且Cl-浓度已调整为更低、更生理性的水平7。为表征特定光遗传致动器的离子选择性，建议在细胞外和细胞内溶液中调整主要离子（如Cl-、Na+、K+、H+）的浓度19。
    3. 从移液管支架上取下记录电极，用极细砂纸去除银丝表面的氯化银层。
      注：每天测量开始时执行此步骤。
    4. 将银丝连接至1.5 V电池的正极，并浸入3 M KCl溶液中进行氯化处理10分钟。
      注：电池负极连接另一根作为参考电极的银丝，并一同浸入3 M KCl溶液中。
    5. 准备测量室：在测量室框架上涂抹硅脂，将盖玻片（直径：50 mm，厚度No. 0）置于框架顶部，确保测量室密封。
    6. 将参比银/氯化银颗粒电极放入浴液中，并与前置放大器头级相连。
    7. 使用微电极拉制仪（参见材料表）从钠钙玻璃毛细管（外径：1.55 mm，内径：1.15 mm）拉制1.7 - 2.5 MΩ的膜片钳移液管。
    8. 启动数据采集软件，并设置膜测试参数（脉冲：10 mV，持续15 ms，基线：0 mV）。
外部灌流液内液移液管溶液
NaCl [mM]140-
KCl [mM]5.411
CaCl2 [mM]1-
MgCl2 [mM]22
葡萄糖 [mM]10-
HEPES [mM]1010
K-天冬氨酸 [mM]-119
Mg-ATP [mM]-3
EGTA [mM]-10
pH7.4 (NaOH)7.2 (KOH)
渗透压（用葡萄糖调节）[mOsmol/L]300 ± 5300 ± 5

表4：膜片钳溶液。

  1. 膜片钳测量实验方案
    1. 在电压钳模式下，于 -74 mV 的保持电位记录光激活协议。使用持续 300 ms 的光脉冲。
      注：建议在接近培养心肌细胞（CM）静息膜电位的条件下进行电压钳记录（通过电流钳模式确定；本实验室测得转导与非转导 CM 的静息膜电位均介于 -79 mV 至 -77 mV 之间19）。新鲜分离的细胞平均静息膜电位为 -79 mV（补充图 2，所有数值均已校正液接电位）。
    2. 在电流钳模式下，于 0 pA 记录动作电位（AP）。
      1. 进行电刺激起搏时，注入持续 10 ms 的电流脉冲（在 10 ms 内从 0 pA 线性上升至设定值），频率为 0.25 Hz，并确定引发动作电位的阈值。以比阈值高 50% 的电流强度进行电流注入并记录动作电位。
      2. 进行光刺激起搏时，使用持续 10 ms、频率为 0.25 Hz 的光脉冲，光强为可稳定引发动作电位的最低强度。
    3. 在电流钳模式下，于 0 pA 记录光抑制效应。按照步骤 5.6.2.1 所述方法引发动作电位，并在 15 次电刺激触发的动作电位之后，施加持续 64 秒、强度为 4 mW/mm2 的光照。
      注：图 6F 展示了一种光抑制实验方案，在持续光照期间施加了更高的电流注入。电流从阈值的 1.5 倍（此处为 0.7 nA）开始，以 0.1 nA 为步长递增，直至最终值 2.2 nA。在所有测试的电流强度下，持续光照均抑制了动作电位的产生。
      1. 作为对照实验，在无光照条件下暂停电刺激 64 秒。
  2. 膜片钳实验
    注：以下实验均需在黑暗环境中进行（可使用红光照明，适用于蓝光/绿光激活工具）。
    1. 将带有细胞的盖玻片放入含外部溶液的测量室中，并选择荧光标记的 CM。
      注：可通过蓝色 LED（460 nm）结合带通激发滤光片（450 nm - 490 nm）、510 nm 二向色镜和 515 nm 长通发射滤光片检测 eGFP 阳性细胞。若使用其他荧光标签，则应采用相应的 LED 与荧光滤光片组合。若转导效率较高（本实验室使用 GtACR1 腺病毒时转导效率 >99%），可在功能实验前省略 eGFP 荧光检测，以避免 GtACR1 的预激活。
    2. 用内部溶液填充膜片钳电极，确保尖端无气泡。
    3. 将电极固定于电极夹持器中，并将记录用的镀氯化银银丝插入内部溶液。
    4. 达到细胞贴附构型后，在数据采集软件中切换至全细胞模式，保持电位设为 -74 mV。通过轻柔施加负压破裂细胞膜，以进入全细胞构型。此过程可通过电容测量值的立即上升来确认。
    5. 运行第 5.6 节所述的实验方案。
  3. 碳纤维技术
    1. 制备碳纤维。
      1. 使用以下参数的玻璃毛细管：外径 2.0 mm，内径 1.16 mm，长度 100 mm（参见 材料表）。使用微电极拉制仪将玻璃毛细管拉制成两根长度相等的电极（总锥形长度约 11 mm，图 5），最终内径约为 30 µm。
        注：首次与第二次拉制的设定值分别为 85.2% 和 49.0%（相对于拉制仪最大输出的比例，具体数值取决于拉制仪型号、灯丝类型及老化程度）。
      2. 使用自制微型锻烧装置（设定为 12 V，24 A）将电极弯曲至最多 45°（电极弯曲装置细节见 图 4）。
        1. 将毛细管（2）沿取向圆（5）上的红线对齐，并保持其位置恒定，使弯曲部分在取向圆中心（半径 4.5 mm）处长度一致。
        2. 通过下压毛细管尖端（使用弯折器（3））并加热灯丝（4），直至毛细管在移除弯折器后仍保持 45° 弯曲角度（绿色线）。
      3. 在体视显微镜下，将碳纤维（由 Jean-Yves Le Guennec 教授提供）插入玻璃毛细管的细端。使用末端带有软管的精细镊子，以增强抓握力并降低纤维损伤风险。
        注：这些纤维具有微结构，可增加纤维与细胞之间的接触表面积，从而增强粘附性20。
      4. 将碳纤维截断至 2 mm 长度，并使用超级胶水（氰基丙烯酸酯）将纤维固定于毛细管前端。
        注：纤维越长，在相同作用力下弯曲程度越大。
    2. 校准碳纤维。
      1. 使用灵敏度为 0.05 mN/V、力测量范围为 0 - 0.5 mN 的力传感器对碳纤维进行校准（参见 材料表）。
        注：该装置为定制设计，用于测量“压”力而非“拉”力。
      2. 将装有碳纤维的毛细管固定于由微操纵器和压电马达控制的夹持器上。
      3. 将纤维尖端轻触力传感器，但不施加任何力，随后以 10 µm 为步长（总移动 60 µm）推动压电马达靠近传感器，并读取测得的电压（E，单位：V）。
        注：确保力传感器仅与碳纤维自由端的最尖端接触。
      4. 重复上述测量三次。
      5. 使用公式 1 计算每个压电位置对应的力（ΔΕ静力平衡，ΣFx=0，力平衡原理与条件示意图。 表示压电马达步进间测得电压的差值）：
        静力平衡公式 F=uN，ΔE=V，物理测量中的灵敏度/增益公式。
        注：力传感器的灵敏度取决于其型号（此处为 0.05 mN/V = 50 µN/V）。增益可在控制器上设定。
      6. 绘制力 [µN] 与压电位置的关系图。曲线斜率即为纤维刚度 [µN/µm]。
    3. 记录 CM 收缩力。
      注：以下实验均需在黑暗环境中进行（可使用红光照明，适用于蓝光/绿光激活工具）。
      1. 用聚HEMA包被测量室表面。向测量室中加入外部灌流液，并滴入少量培养的细胞悬液（步骤 4.9）。
      2. 将装有碳纤维的毛细管固定于显微镜载物台的微操纵器上。通过短时间绿光脉冲刺激引发收缩的能力，筛选表达 GtACR1 的 CM。将碳纤维大致水平地对齐于测量室表面。
      3. 将第一根纤维轻柔地压至细胞表面。在 CM 的另一端平行放置第二根纤维。理想对齐方向应接近垂直于细胞轴线。
        注：通过轻压细胞使其贴附于底部表面。在安装第二根纤维前释放压力。安装第二根纤维时不得拉伸细胞。
      4. 两根纤维均附着于细胞后，抬起纤维，使细胞不再接触测量室表面，从而实现无摩擦收缩。
      5. 在数据采集软件中聚焦肌节（参见 材料表），并在两根纤维之间设置肌节长度追踪窗口（图 7A I (3)）。
        注：所得 FFT 功率谱（图 7A I (2)）理想情况下应呈现一个尖锐的主峰，代表平均肌节长度。
      6. 使用边缘检测模块追踪纤维弯曲。在红色和绿色窗口中设置检测区域，并在光强迹线的一阶导数上设定阈值（红色和绿色水平线）（图 7A III）。
      7. 开始以 0.25 Hz 对细胞进行光刺激起搏（若条件允许，可尝试更高频率），并同步追踪肌节长度与纤维弯曲。
        注：纤维夹持器位置、LED 触发信号和电刺激脉冲均由数据采集软件控制（参见 材料表）。
      8. 记录至少 15 次光刺激引发的收缩后，对细胞进行电场刺激（参见 材料表）。确定引发收缩的阈值，并以 1.5 倍阈值电压进行记录。
      9. 在抑制实验中，先施加电刺激以引发收缩，随后暴露于持续 64 秒的光照（不同光强条件下）。

使用量角器测量静态平衡的光学装置；用于角度和力分析的示意图。
图4：移液管弯曲装置。 （1）左侧的显微操作器用于控制毛细管的位置，右侧的第二个显微操作器用于弯曲毛细管。（2）毛细管。（3）弯曲装置。（4）微型熔接仪。（5）取向圆盘。请点击此处查看该图的放大版本。

微移液管尖端成型示意图；精密玻璃塑形与测量；2 mm 尺度参考。
图 5：带碳纤维的移液管。 请点击此处查看此图的放大版本。

6. 数据分析

  1. 膜片钳记录
    注意：实验结束后，需根据液接电位校正所有记录和指令电压。使用数据采集软件中的液接电位计算器工具确定液接电位（根据表4中所述膜片钳溶液：在21 °C时为14.4 mV）。从记录/指令电压中减去液接电位。
    1. 对于电流钳动作电位（AP）记录，需检查电刺激与光刺激的效果。使用自编脚本计算复极化20%和90%时的动作电位时程（APD）（补充材料）。测定静息膜电位和动作电位幅度。
      注意：APD的测定方法参见Wang K. 等人21。用于加载.abf文件的脚本可通过以下链接获取：https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload。至少取6个动作电位的APD平均值。
    2. 对于电压钳光激活实验，检查基线是否处于0 pA。若非如此，应将基线调整至零。分析在-74 mV下由300 ms光脉冲触发的记录电流。将数据导入数据分析软件，并测定峰值电流和平均稳态电流。
  2. 碳纤维实验
    1. 光刺激期间的收缩记录：将记录数据导入数据采集软件，读取碳纤维弯曲和肌节长度变化的基线值与最大值。
      注意：取稳定记录中10次收缩的平均值。
    2. 测量细胞宽度，并假设横截面为椭圆形，计算细胞的横截面积（图7B II）。
      注意：椭圆面积公式为 A = π·a·b（公式2），其中a为中心到顶点的距离，b为中心到共轭顶点的距离。在本例中，a =（细胞宽度）/2，b =（细胞厚度）/2。根据Nishimura 等人22的研究，心肌细胞（CM）的厚度可估计为细胞宽度的三分之一，因此 A = π·(1/2)·宽度·(1/2)·厚度 = π·(1/4)·宽度·(1/3)·宽度 = π·(1/12)·宽度2。
    3. 计算收缩末期力（F）：
      细胞力学中的力计算公式，公式表示为 F[μN/mm²]=(基线-峰值)·刚度/面积。
    4. 计算收缩末期细胞形变（ESD）：
      肌节长度的ESD方程，用于描述收缩动力学分析的公式。
      注意：可进一步分析其他收缩参数：静息肌节长度、达峰时间、90%舒张时间、肌节缩短分数、收缩与舒张的最大速度（参见软件采集手册）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在培养的兔CM细胞中表达GtACR1-eGFP（图6 插入）并使用膜片钳技术测量光电流。在-74 mV时，GtACR1的光激活显示出较大的内向电流。在 图6A 峰值电流我P) 在 4 mW/mm²2 为245 pA。动作电位通过电刺激（图6B）或光学方式（图6C）分别施加1.5倍阈值的电流刺激或10 ms的短促去极化光脉冲。分析动作电位时程（APD）数值，电刺激起搏的心肌细胞（CM）的APD20为0.24 ± 0.08 s，APD90为0.75 ± 0.17 s；而光刺激起搏的心肌细胞的APD20为0.31 ± 0.08 s，APD90为0.81 ± 0.19 s（标准误，n = 5，N = 2；本示例中所示的APD20电的 = 0.17 秒；APD 20光学 = 0.27 秒和 APD90电的 = 0.61 秒；动作电位时程 90（APD 90）光学 = 0.68 s 图6D光刺激起搏的心肌细胞表现出较慢的动作电位起始（图6D）。持续照射（64 秒，4 mW/mm²）抑制了 CM 的激活。2）通过使膜电位向氯离子的反转电位（此处为 -58 mV）极化，图6E）。高于阈值1.5倍的电流刺激不会引发动作电位产生（图6F）。通过碳纤维弯曲测定生成的峰值力（图7B、C、E。条件培养基产生的力为 232 µN/mm2 电刺激起搏时图7B）和 261 µN/mm2 光学起搏后（图7C）。长时间的绿光脉冲抑制收缩（图7E）。在光学抑制 64 秒后，重新出现的收缩产生的收缩力降低，经过约 10 次收缩后，收缩力数值恢复至基线水平（以 0.25 Hz 频率起搏， 图7D) 与兔心肌细胞舒张期钙流失情况一致。

Optogenetic stimulation results; electrophysiology traces; 525 nm wavelength; voltage-clamp analysis.
图6：电刺激与光刺激起搏/抑制心肌细胞的代表性膜片钳记录 (A在 -74 mV 下使用持续 300 ms、功率 4 mW/mm² 的光脉冲测得的典型光电流2. 我P 表示峰值电流。插图显示一个 GtACR1-eGFP 阳性细胞。（B) 使用10 ms、0.6 nA的电流斜坡在0 pA下进行电刺激心肌细胞的代表性动作电位记录。C使用10 ms、0.4 mW/mm²光脉冲在0 pA条件下记录的动作电位代表性结果2. (D上方图表显示了10条曲线的叠加th 电刺激（蓝色）与光刺激（绿色）激活的心肌细胞动作电位。动作电位按膜电位最大变化率（dV/dt max）对齐。下图显示光刺激与电刺激触发的动作电位之间膜电位的差异。E光学-E电的). (E电刺激触发的动作电位在持续 64 秒、4 mW/mm² 的光照下受到抑制2. (F在持续光照下，动作电位（AP）可被高于阈值1.5倍的电流注入（从0.7 nA开始，以0.1 nA为步长递增至2.2 nA）所抑制。 请点击此处以查看此图的放大版本。

肌节长度分析；肌节与碳纤维距离图；力测量数据。
图7：光学与电刺激/抑制心肌细胞的碳纤维记录代表性数据。（A）数据采集软件中的显示界面。图像（I）显示被测心肌细胞及用于计算肌节长度的分析窗口。细胞宽度以橙色标注。（1）相关频率范围。（2）快速傅里叶变换（FFT）功率谱显示细胞上肌节间距的频率，平均肌节长度由峰值频率计算得出。（3）肌节长度追踪窗口。（4）强度轨迹。（5）强度轨迹乘以汉明窗后得到加窗强度轨迹。示意图（II）显示细胞的椭圆形横截面，橙色表示宽度，虚线蓝色表示厚度。图像（III）显示碳纤维的位置及其对应的检测框，左侧为红色，右侧为绿色。（6）强度轨迹。（7）强度轨迹的一阶导数（参见数据采集软件手册）。（B）电刺激引发收缩的代表性曲线。图（I）显示肌节长度缩短，图（II）显示两根碳纤维之间的距离变化。（C）光学刺激引发收缩的代表性曲线（525 nm，0.25 Hz，10 ms，6 mW/mm2）。图（I）显示肌节长度缩短，图（II）显示两根碳纤维之间的距离变化。（D）在动作电位生成被抑制导致暂停后，第1至第11次收缩产生的峰值力。（E）持续光照下光学抑制收缩的代表性曲线（525 nm，64 s，6 mW/mm2）。图（I）显示肌节长度缩短，图（II）显示两根碳纤维之间的长度变化。请点击此处查看该图的放大版本。

A面积
ACR阴离子通道视紫红质
AP动作电位
APD动作电位时程
CFU菌落形成单位
ChR通道视紫红质
CM心肌细胞
eGFP增强型绿色荧光蛋白
ESD收缩末期细胞形变
EU内毒素单位
F力
FFT快速傅里叶变换
GtACRGuillardia theta 阴离子通道视紫红质
GUI图形用户界面
I-clamp电流钳
IU国际单位
MOI感染复数
poly-HEMA聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)
V-clamp电压钳

表5：缩略语列表。

光强随时间变化图、光激发测量、光子实验结果示意图。
补充图1：使用光功率计进行的光强测量。（A）在4 mW/mm2条件下对10 ms光脉冲的测量。（B）在4 mW/mm2条件下持续照射64 s的测量。请点击此处查看该图的高清版本。

电生理测量；动作电位图；肌节长度示意图；显微镜图像。
补充图2：新鲜分离心肌细胞的特性及其在培养中的结构适应性。（A）新鲜分离心肌细胞的动作电位记录（APD20为1.11 ± 0.34 s，APD90为1.96 ± 0.32 s，n = 7，N = 2）。平均静息膜电位为-79.3 ± 0.8 mV（n = 7，N = 2）。（B）电刺激下新鲜分离心肌细胞的碳纤维记录。平均峰值力为205 ± 78 µN/mm2（n = 7，N = 2）。（C）新鲜分离心肌细胞的共聚焦图像（I）；培养48小时后的未转导（II）和转导心肌细胞（III）。请点击此处查看该图的放大版本。

补充材料：用于测定动作电位时程和静息膜电位的MatLab脚本。 请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管光遗传学工具能够以非侵入性方式调控可兴奋细胞的电生理活动，但仍需在不同类型的细胞（例如心肌细胞）中对其进行充分表征，以便为特定实验设计选择最合适的工具。膜片钳技术是评估细胞电生理特性的标准方法。在全细胞构型下，该技术可用于记录光激活后跨质膜的电流，或光刺激/抑制后膜电位随时间的变化。光遗传学对电兴奋性的调控也会影响心肌细胞的收缩。我们采用肌节追踪和碳纤维辅助的力测量方法，定量分析光学干预对心肌细胞机械活动的影响。

我们描述了一种用于表征光控氯离子通道GtACR1在心肌细胞（CM）中基本效应的实验方案。作为模型系统，我们选择了兔心肌细胞，因为其电生理特性（如动作电位形态和不应期）比啮齿类动物的心肌细胞更接近人类心肌细胞。此外，兔心肌细胞可在体外培养数天，时间足以完成腺病毒介导的GtACR1-eGFP递送与表达。值得注意的是，分离的心肌细胞在培养过程中会随时间发生结构特性的改变，包括细胞末端变圆以及横纹、T管系统和小凹的逐渐丧失23,24。与此相一致，已有研究报道培养心肌细胞存在功能上的改变：静息膜电位去极化、动作电位时程延长以及细胞内Ca2+处理能力的变化。有关细胞在培养条件下适应性变化的综述，请参见Louch等人的文献25。补充图2展示了采用本方案所获得的新鲜分离心肌细胞的动作电位和收缩测量示例，可用于与培养心肌细胞的结果（图6、图7）进行比较。

全细胞膜片钳记录技术能够以高时间分辨率直接测量光流特性（例如幅度和动力学）以及光诱导的膜电位变化或动作电位特性的改变。然而，这种记录方法存在若干局限性：首先，在全细胞记录过程中，细胞质会被移液管溶液取代，这虽然有利于控制离子的电化学梯度，但其固有的缺点是会洗脱细胞内的细胞器、蛋白质及其他化合物，从而可能影响细胞的电生理反应。其次，由于非生理性长时间去极化（例如光门控离子通道的缓慢时间常数）可能引发额外离子通道的激活等副作用，而本方法仅能检测动作电位时程（APD）的变化，无法对电生理相关细胞区室中的离子浓度进行直接测量，因此这类副作用难以评估。此类测量可通过荧光指示剂（例如Ca2+传感器）或离子选择性电极实现。进一步的表征还可包括光强滴定实验、pH依赖性测定、在不同膜电位下光流动力学分析，以及重复光刺激期间的恢复动力学研究。

与膜片钳记录相比，单细胞力测量技术能够在不干扰完整心肌细胞胞内环境的情况下，分析其细胞收缩。通过测定产生的力的幅度和动态特性（例如，收缩和舒张的最大速度；此处未分析），可间接评估离子浓度（如 Ca2+）的继发性影响。相较于自由收缩的细胞，采用碳纤维技术进行力测量的优势在于，可直接获取预负荷细胞中被动和主动力的信息（即更接近体内或原位条件下的状态）。在分析细胞收缩功能时，机械预负荷尤为重要，因为拉伸会影响力的产生和舒张过程26,27。

光遗传学方法能够对单个心肌细胞（CM）和完整心脏组织中的细胞膜电位实现时空精确操控。传统上，光门控非选择性阳离子通道ChR2被用于膜电位的去极化，而光驱动的质子和/或氯离子泵则用于膜电位的超极化。这两类光遗传效应分子均需要高水平表达，因为ChR2具有固有的低单通道电导率28，而光驱动泵每吸收一个光子最多只能转运一个离子。此外，在心肌细胞中长时间激活ChR2可能导致Na+和/或Ca2+超载，而光驱动泵可能改变跨肌膜的H+或Cl-梯度29,30。为了寻找可用于调控心肌细胞活动的替代性光遗传工具，我们近期测试了天然阴离子通道视紫红质GtACR1，其单通道电导率和光敏感性均优于阳离子型ChR（如ChR2）。我们发现，GtACR1的激活可使心肌细胞去极化，并可根据光脉冲的时序和持续时间实现光学起搏或抑制。与使用阳离子型ChR相比，使用ACR的另一优势在于Cl-的反转电位更负，相较于Na+，可减少人为引入的离子电流。正如我们此前所展示的，使用GtACR1进行光学起搏可能因GtACR1通道关闭过程中的缓慢组分而导致动作电位（AP）延长，这一问题可通过使用更快动力学的GtACR1突变体来克服19。然而，当采用较低且更接近生理水平的细胞内Cl-浓度时，动作电位延长现象显著减轻（见图6）。此外，通过持续光照由GtACR1介导的抑制会导致显著的膜去极化，这可能再次激活继发性的Na+和Ca2+内流，从而改变电压门控通道的活性。在我们的测量中发现，在1分钟光照抑制结束后40秒内，动作电位和收缩参数即可恢复至基线水平（参见Kopton等，2018年，图6，图7）。光门控K+通道则为在不影响心肌细胞静息膜电位的前提下实现心肌细胞沉默提供了有力的替代方案31。

未来，我们希望对不同光遗传学工具在抑制心脏活动方面的潜力进行定量比较。为此，我们将测试多种光控离子通道，包括ACR、ChR2以及红移型ChR变体32，同时也将测试超极化效应器，例如卤视紫红质或光控腺苷酸环化酶bPAC与钾离子通道SthK联用的系统（PAC-K）31。

本文所介绍的方案可用于心肌细胞（CM）机电特性深入表征。该方法原则上也适用于来自其他物种的CM，以及从病变心肌中分离得到的CM。在碳纤维收缩实验中，可通过光刺激以不同频率起搏CM，并测试不同的预负荷条件。一项有意义的实验是采用低强度光照诱导低于阈值的去极化，以模拟静息膜电位的渐进性升高，这种现象在疾病进展过程中心肌组织重构时可被观察到。最后，功能性测量可与Ca2+成像相结合，以进一步揭示兴奋-收缩耦联机制，或结合药理学干预手段，评估不同药物对CM活性的影响。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢Stefanie Perez-Feliz提供的出色技术协助，感谢Jonas Wietek博士（德国柏林洪堡大学）提供pUC57-GtACR1质粒，感谢Michael Schupp教授（德国柏林夏里特医学院药理学研究所）提供腺病毒制备支持，以及感谢Anastasia Khokhlova博士（乌拉尔联邦大学）分享其专业知识，以优化细胞分离方案并重新设计移液管拉制装置。本项目由德国研究基金会（SPP1926：SCHN 1486/1-1；Emmy-Noether奖学金：SCHN1486/2-1）和欧洲研究理事会高级资助项目CardioNECT资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>设备 - 细胞分离/培养/转导
Adeno-X 腺病毒系统 3 CMV美国加利福尼亚州芒廷维尤市，TaKaRa，Clontech Laboratories, Inc.
主动脉插管Radnoti4.8 OD × 3.6 ID × 8-9 L mm
盖玻片 ø 16 毫米，厚度编号 0VWR International GmbH，比利时鲁汶631-0151硼硅酸盐玻璃
Griffin Silk，黑色，2 米长，3 号，0.5 毫米Samuel Findings，英国伦敦TSGBL3
培养箱新不伦瑞克，艾本道夫，施ö嫩布赫，瑞士Galaxy 170S
朗根多夫灌流装置Zitt-Thoma 实验室玻璃器皿供应äserei，德国弗赖堡定制
朗根多夫泵Ismatec，实验室技术分析，Glattbrugg-Zürich，瑞士ISM444
网膜：尼龙 Monodur 滤布Cadisch Precision Meshes Ltd800 µm个孔，1米宽
血细胞计数板VWR国际有限公司，比利时鲁汶717806
新西兰白兔查尔斯河实验室菌株编号：052
剪刀Aesculap AG，德国图特林根BC774R直角剪 18厘米
无菌滤器，0.22 µm默克，德国达姆施塔特SLGP033RB
<强>设备——膜片钳
放大器Axon Instruments，联合市，加利福尼亚州，美国Axopatch 200B
盖玻片 ø 50 毫米，厚度1号VWR International GmbH，比利时鲁汶631-0178硼硅酸盐玻璃
Axon Digidata 数字转换器Molecular Devices，圣何塞é美国加利福尼亚州1550A
滤光片（530/20）徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔11513878BZ:00
滤光片（630/20）美国佛蒙特州贝尔斯福斯，Chroma Technology公司227155
前置放大器AxonInstruments，尤宁城，加利福尼亚州，美国CV203BU
界面英国乌克菲尔德，Scientifica公司1U 机架，352036
LED 525 nmLuminus Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔PT-120-G
LED 控制软件Essel 研发公司，加拿大多伦多
LED 控制系统定制
微移液管拉制仪日本东京Narishige公司PP-830
倒置显微镜德国韦茨拉尔，徕卡显微系统公司DMI4000B
电动显微操作器英国乌克菲尔德，Scientifica公司PatchStar
光功率计Thorlabs，新泽西州纽顿，美国PM100D
硅脂RS Components，科比，英国494-124
银丝A-M Systems，Sequim，WA，美国787500银，裸线 0.015 英寸，涂层线 0.0190 英寸，长度 25 英尺
苏打石灰玻璃毛细管Vitrex Medical A/S，Vasekaer，丹麦160213 BRIS, ISO127721.55 毫米外径 × 1.15 毫米内径 × 75 毫米长度
软件 Axon pClampMolecular Devices，圣何塞é美国加利福尼亚州版本 10.5
软件 MatLab2017The MathWorks, Inc.
载物台测微尺Graticules Optics LTD，英国汤布里奇1 mm
<强>设备 - 碳纤维
碳纤维由 Jean-Yves Le Guennec 教授提供BZ:00
Axon Digidata 数字转换器Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔1550B
滤光片（530/20）德国韦茨拉尔，徕卡显微系统公司11513878
滤光片（630/20）美国佛蒙特州贝洛斯福尔斯，Chroma Technology公司227155
荧光系统接口IonOptix，美国马萨诸塞州米尔顿FSI-8002.0 OD × 1.16 ID × 100 L mm
力传感器系统Aurora Scientific Inc.，安大略省，加拿大406A
用于力测量的玻璃毛细管哈佛仪器公司，霍利斯顿，马萨诸塞州，美国GC200F-10
国家仪器接口匈牙利布达佩斯国家仪器公司BNC-2110
LED 525 nmLuminus Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔PT-120-G
LED 控制箱Essel 研发公司，多伦多，加拿大
LED 控制系统定制的
微控制器Parallax Inc.，美国加利福尼亚州洛克林螺旋桨
微移液管拉制仪日本东京Narishige公司PC-10
倒置显微镜徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔DMI4000B
MyoCam-S 相机IonOptix，爱尔兰都柏林
MyoCam-S 相机电源IonOptix，马萨诸塞州米尔顿，美国MCS-100
MyoPacer 电场刺激器IonOptix 公司，马萨诸塞州米尔顿，美国MYP100
压电马达Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG，德国卡尔斯鲁厄E-501.00
硅脂RS Components，科比，英国494-124
软件 Axon pClampMolecular Devices，圣何塞é美国加利福尼亚州版本 10.5
软件 IonWizardIonOptix，爱尔兰都柏林版本 6.6.10.125
软件 MatLab2017The MathWorks, Inc.
阶段测微尺Graticules Optics LTD，英国汤布里奇1 mm
<强>化学品
腺苷Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A9251-100G
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A7030-50G
CaCl2Honeywell Fluka，美国密歇根州马斯基根21114-1L
L-肉碱盐酸盐Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯C9500-25G
胶原酶 II 型，315 U/mg美国新泽西州莱克伍德沃辛顿公司LS004177
肌酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯C0780-50G
胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯C1768-100MG
EGTA卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄3054.3
盐酸艾司氯胺酮，Ketanest S 25 mg/mL辉瑞制药 PFE 有限公司，德国柏林PZN-07829486
胎牛血清Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯F9665
庆大霉素 50 mg/mLGibco，Life Technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆15750-037
葡萄糖Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯G7021-1KG
肝素钠，5,000 IU/mLBraun Melsungen AG，德国美尔森PZN-03029843
HEPESSigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯H3375-1KG
胰岛素（牛胰腺）Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯I6634-50MG
K-天冬氨酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A6558-25G
KClVWR International GmbH，比利时鲁汶26764.2601 mg/mL
KOHHoneywell Fluka，美国密歇根州马斯基根35113-1L
Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜来源的层粘连蛋白Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯L2020-1MG
M199培养基Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯M4530
Mg-ATPSigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A9187-1G
MgCl2Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯63069-500ML
NaCl英国莱斯特郡拉夫堡，Fisher Scientific公司10428420
0.9% 氯化钠溶液，等渗生理盐水ö0.9% sungBraun Melsungen AG，德国美尔森3200950
NaOHAppliChem GmbH，德国达姆施塔特A6579无钙2+/毫克2+
Na-丙酮酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯P2256-100MG
磷酸盐缓冲液Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯D1408-500ML
聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)Sigma，英国普尔192066
灰色链霉菌蛋白酶XIVSigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯P5147-1G
牛磺酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯T0625-500G
硫喷妥钠 Inresa 0.5 g德国弗赖堡 Inresa Arzneimittel GmbH公司PZN-11852249
盐酸赛拉嗪，Rompun 2%Bayer Vital GmbH，德国勒沃库森PZN-01320422

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis. Nature. 271, 476-478 (1978).
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  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
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