Cytofast 是一种用于分析聚类结果的可视化工具。Cytofast 可用于比较两种聚类方法：FlowSOM 和 Cytosplore。Cytofast 能够快速生成质谱流式细胞数据的定量与定性概览，并突出显示不同聚类算法之间的主要差异。
方法文章
利用 Cytofast 与上游聚类方法 FlowSOM 和 Cytosplore 对高维细胞流式数据进行可视化与定量分析
本文内容
摘要
摘要
质谱流式细胞术产生的数据复杂性 necessitated 快速可视化分析结果的新工具。诸如 Cytosplore 或 FlowSOM 等聚类方法被用于细胞簇的可视化与鉴定。在后续分析中，一种新开发的 R 软件包 Cytofast 可对聚类方法的结果进行快速可视化。Cytofast 考虑了细胞簇的表型特征，计算细胞簇的丰度，并对不同组别进行定量比较。本实验方案阐述了 Cytofast 在质谱流式数据中的应用，该数据基于肿瘤微环境（即自然杀伤 [NK] 细胞反应）中免疫系统调节的研究，实验设计包括肿瘤攻击后进行免疫治疗（PD-L1 阻断）。文中展示了 Cytofast 与 FlowSOM 和 Cytosplore 联用的有效性。Cytofast 能快速生成与组别相关的免疫细胞簇的可视化图谱，以及其与免疫系统组成的相关性。在聚类分析中可观察到差异，且两种聚类方法均能清晰显示组间分离。Cytofast 直观地呈现了 PD-L1 治疗诱导的模式，包括活化 NK 细胞亚群的丰度更高，且表达更高强度的活化标志物（如 CD54 或 CD11c）。
引言
质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）能够检测数百万个单细胞中多种细胞内或细胞外生物标志物。由于质谱流式数据具有高维特性，因此需要特定的分析工具，例如细胞聚类技术，如 SPADE1、FlowMaps2、FlowSOM3、Phenograph4、VorteX5 和 scaffold maps6。此外，已开发出多种基于降维的技术（例如主成分分析 [PCA]7、t-分布随机邻域嵌入 [t-SNE]8、分层随机邻域嵌入 [HSNE]9、统一流形逼近与投影 [UMAP]10 以及扩散图谱11），以提高高维数据集的分析速度、解释性和可视化效果。
高维流式细胞术和质谱流式细胞术数据的下游分析通常缺乏对聚类频率及与临床结果关联进行统计检验的自动化流程。此前，我们开发了一种基于R语言的工作流程，称为Cytofast12，可实现对Cytosplore或FlowSOM聚类方法结果的可视化与定量下游分析。
本文所述方案阐明了如何在 R 中使用 Cytofast，并展示了如何生成定量和定性的热图及图表。此外，该方案有助于确定观察到的免疫表型与临床结局之间的关联。本报告还描述了利用两种不同聚类方法——FlowSOM 和 Cytosplore——对特定质谱流式细胞术数据集进行分析的过程。通过将 Cytofast 与这两种聚类方法结合使用，结果表明 NK 细胞的活化表型受到 PD-L1 免疫检查点阻断的影响。
方案
所有动物实验均经莱顿大学医学中心（LUMC）动物实验委员会批准，并依照莱顿大学医学中心的动物实验指南执行，符合荷兰和欧洲委员会的指导方针。
注意：实验设置中，将C57BL/6小鼠在右侧 flank 皮下接种鼠源结肠肿瘤MC38，接种浓度为0.3 × 106 个细胞/200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）。接种10天后，当肿瘤可触及时，小鼠接受PD-L1阻断抗体（克隆号MIH-5，每只小鼠200 µg，腹腔注射）治疗，或进行模拟治疗。PD-L1注射后3天切除肿瘤，进行体外处理，并利用38种标记物通过CyTOF质谱流式细胞术进行分析13。
1. 数据分析所需的设备与软件
注意：使用一台配备 I5 处理器（2.4 GHz 或同等性能）及以上、安装内存 RAM 6 GB、并具有 10 GB 可用硬盘空间的计算机（Windows 7 或更高版本）。R 软件包 Cytofast 使用了现有函数：主要是 flowCore、pheatmap 和 ggplot。在 R 中执行的命令行已包含在本方案中。R 操作指令的相关资源可访问 https://education.rstudio.com/。
- 安装 Cytofast 软件包时，启动 R（版本 "3.6"），并通过输入以下代码安装 Bioconductor 版本 3.9：
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("cytofast") - 通过运行以下命令，确保在目标环境中已加载该软件包：
library(cytofast)
2. 创建簇
注意：为了展示 Cytosplore 和 FlowSOM 两种聚类方法与 Cytofast 的结合应用，本文分析了 PD-L1 治疗 3 天后肿瘤微环境中自然杀伤细胞（CD161+）的特征。
- 通过 Cytosplore 进行聚类
- 下载并安装托管于 <www.Cytosplore.org> 的 Cytosplore 软件后，点击 Cytosplore 中的 文件 | 打开 FCS 文件，上传 .fcs 文件（补充文件 1.1–1.8 [Cytosplore 输入文件]）。当系统提示时，点击 将唯一样本标签添加为通道，并为双曲反正弦变换选择一个共因子（默认值为 5）。
- 选择 运行 H-SNE，执行第 3 级 HSNE 分析，并等待图谱生成。
注意：此步骤所需时间取决于分析的细胞数量和所选 HSNE 级别。 - 在第一级 HSNE 图上，检查 CD161 阳性的细胞。选择 CD161+ 细胞，右键点击 放大至所选区域。在第二级重复该操作，进入仅包含 CD161+ 事件的第三级图谱。
- 当最后一张 tSNE 图生成后，右键点击 tSNE 图并选择 保存聚类，以保存 Cytosplore 定义的聚类。根据 Cytosplore 的提示选择输出文件目录，并记录该路径，因为该目录将用于后续在 R 中加载 .fcs 文件。
注意：可通过更改 sigma 值手动调整子集数量。sigma 值默认设置为 30；然而，实际子集数量取决于输入数据。此处，Cytosplore 检测到 10 个不同的子集，每个文件代表一个子集。 - 重命名输出文件时使用简单名称（仅使用字符），以便于识别和后续处理。选择 保存 以保存输出文件。
注意：保存后，Cytosplore 将创建一个包含 .fcs 文件的文件夹，每个文件对应 Cytosplore 中识别的聚类。下一步是使用 Cytofast 将这些文件加载到 R 中。此处生成的输出文件已提供于 补充文件 2.1–2.10（Cytosplore 输出文件）。 - 使用指定函数 readCytosploreFCS 将 Cytosplore 生成的输出文件加载到 R 中。
dirFCS <- "C:\\Users\\username\\Desktop\\tostudy"
cfData <- readCytosploreFCS(dir = dirFCS, colNames = "description") - 通过移除如 "Time" 和 "Background" 等参数来清理数据。检查与无关参数对应的列位置，并从矩阵中将其移除。
colnames(cfData@expr)
cfData@expr <- cfData@expr[,-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)]
注意：通过读取生成矩阵的列名可识别无关列。再次运行 colnames(cfData@expr)，确认仅保留所需参数。 - 重新排序标记，使谱系标记优先显示，随后为功能标记。
cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,
29,40,5,30,33,11,34,14,19,
32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,
21,22,24,25,26,27,38,39)]
注意：步骤 2.1.8 为可选步骤。 - 通过上传包含临床信息的电子表格元数据文件（补充文件 3），将元数据文件与 Cytosplore 生成的数据关联。
library(readxl)
meta <- read_excel("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")
cfData@samples <- data.frame(meta)
注意：Cytosplore 执行的聚类现已完成。Cytosplore 的另一种聚类替代方案是 FlowSOM，其描述见第 2.2 节。完成两种聚类方法之一后，进入可视化步骤（第 3 节）。
- 通过 FlowSOM 进行聚类
- 首先在 R 中运行以下命令安装 FlowSOM：
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("FlowSOM")
library(FlowSOM) - 使用类似方法安装 flowCore 包，并在环境中加载：
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("flowCore")
library(FlowSOM) - 使用 read.flowSet 函数在 R 中加载 补充文件 4.1–4.8（FCS FlowSOM 输入）中提供的原始数据，这些数据此前已对 CD161+ 事件进行过门控。
fcs_raw <- read.flowSet(path="C:\\Users\\username\\Desktop\\tocluster", pattern = ".fcs", transformation = FALSE, truncate_max_range = FALSE, seed=123) - 通过选择适当的列并以 arcsinh5 方式对数据进行变换（如下代码所示），选择相关生物学标记（移除 "Background" 或 "Time"）（此处移除不对应任何生物学标记的第 1、2、4、5、6、17、21、24、25、34、35、37、38、51 列）。在下方函数中选择 cofactor=5，应用与 Cytosplore 之前相同的共因子 5。
fcs_raw <- fsApply(fcs_raw, function(x, cofactor=5){
colnames(x) <- fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc
expr <- exprs(x)
expr <- asinh(expr[,-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51)]/ cofactor)
exprs(x) <- expr
return(x)}) - 使用 FlowSOM 函数对数据进行聚类。为比较 FlowSOM 与 Cytosplore，选择将数据聚类为 10 个子集，与 Cytosplore 之前的输出一致。
fsom <- FlowSOM(fcs_raw, transformFunction = FALSE, scale = FALSE,
scaled.center = FALSE, scaled.scale = FALSE, silent = FALSE, colsToUse = c(1:37),
nClus = 10, maxMeta = 10, importance = NULL, seed = 123)
注意：用户可手动更改此设置。 - 将每个细胞分配至其识别的子集和样本 ID。
subset_id <- as.factor(fsom$FlowSOM$map$mapping[,1])
levels(subset_id) <- fsom$metaclustering
head(subset_id) - 在 R 中加载包含分组信息的元数据文件（见 补充文件 5），并将其与 .fcs 文件关联。
sampleid <- read_excel("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")
sampleid <- na.omit(sampleid)
sampleid$sampleID <- as.factor(sampleid$sampleID)
sampleid$group <- as.factor(sampleid$group)
sampleid$CSPLR_ST <- as.factor(sampleid$CSPLR_ST)
sampleid <- as.data.frame(sampleid)
names(sampleid)[3] <- "sampleID"
sampleID <- lapply(fsom$FlowSOM$metaData, function(x){rep(x[1], each = length(x[1]:x[2]))})
attr(sampleID, 'names') <- NULL
sampleID <- as.factor(unlist(sampleID))
sampleid <- data.frame(sampleid)
levels(sampleID) <- paste("ID", 1:dim(sampleid)[1], sep="_")
df <- data.frame(subset_id, sampleID, fsom$FlowSOM$data[, c(1:37)])
rename <- data.frame(colpar=fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc)
colnames(df) <- c("clusterID", "sampleID", rename$colpar[c(1:37)])
df$ clusterID <- as.factor(df$ clusterID)
df$sampleID <- as.factor(df$sampleID) - 通过运行以下脚本，基于从 FlowSOM 获得的数据框创建 cfList：
cfData <- cfList(samples = sampleid,
expr = df) - 重新排序标记，使其显示顺序与 Cytosplore 分析的输出一致。
cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,34,36,37,10,23,24,31,22,
38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,
14,33,17,20,21,18,25,29,13,
30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]
注意：FlowSOM 的聚类现已完成。接下来，对聚类输出进行可视化。
- 首先在 R 中运行以下命令安装 FlowSOM：
3. 可视化：聚类分析的后期处理
注意：此步骤是两种聚类方法共有的操作。因此，无论使用 FlowSOM 还是 Cytosplore 进行聚类，均可在此之后执行该步骤。
- 在生成热图之前，使用如下代码所示的 cellCounts 函数为每个样本生成计数表。由于某些簇包含的细胞数量少于其他簇，需通过指定参数对每个簇的数据进行标准化处理 "scale = TRUE" 在函数 cellCounts 内部，以便于直观显示样本间的离散程度。
cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = TRUE)
注意数据现在可以进行可视化。 - 使用热图进行可视化。
注意该软件包的主要功能之一是 cytoHeatmaps，用于可视化所创建聚类的表型及其在样本间的异质性。
cytoHeatmaps (cfData, group="组"，图例=TRUE） - 使用箱线图进行可视化
注意: 可通过调用函数 cytoBoxplots 以定量方式展示数据。该函数的输出表示每个样本在各个聚类中的比例。- 按照步骤3.1的方法生成细胞数量，但不要对数据进行标准化以获得每个簇的频率。
cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE)
cytoBoxplots(cfData, group = "组")
- 按照步骤3.1的方法生成细胞数量，但不要对数据进行标准化以获得每个簇的频率。
- 中位强度信号直方图可视化
注意数据还可以通过中位数强度信号直方图进行可视化。- 可视化三种标志物的表达强度：CD45、CD11c 和 CD54。
- 通过调用以下代码行来核对所需标记物的名称。记录标记物名称，并将其包含在 msiPlot 函数中。
names(cfData@expr)
注意重点关注 CD45、CD11c 和 CD54。请核对这些标志物的拼写是否准确，并根据需要进行调整：
msiPlot(cfData, 标记 = c("89Y_CD45", "167Er_CD11c","164Dy_CD54"），按组分组='group'）
结果
Cytofast 的工作流程（图1）旨在对最初由分析软件（如 FlowSOM 或 Cytosplore）聚类的数据提供定量和定性的整体概览。Cytofast 可生成多种可能的输出结果，包括基于标志物表达水平的所有已识别聚类的热图（图2 和 图3）。顶部的树状图表示已识别聚类之间的层次相似性。上方面板显示另一个热图，展示每个样本中相应细胞亚群的相对数量。右侧的树状图显示样本之间的相似性，其基于样本间欧氏距离进行层次聚类所得结果。图2 展示了 FlowSOM 后接 Cytofast 的联合热图结果，图3 展示了 Cytosplore 后接 Cytofast 的联合热图结果。Cytofast 还可用于定量呈现数据，并通过箱形图（使用 cytoBoxplots 函数）展示结果，如 图4 和 图5 所示。
两种不同方法之间发现了相似的聚类（例如，来自方法一的聚类8与 Cytosplore 对应于第10簇 FlowSOM），并且两种方法中仍可观察到部分抑制性标志物（如 PD-1 和 LAG-3）的共表达。两种聚类方法均可实现 PD-L1 的区分 与PBS处理的小鼠。相比之下，两种方法之间的一些差异值得关注。 FlowSOM 鉴定出 2 个簇（MHC-II）+，而 Cytosplore 仅显示一个簇（MHC-II）+dim）。这是由于最初的设门策略中，NK细胞在CD161上进行了人工设门+ 细胞，然后进一步处理 FlowSOM。然而， Cytosplore 自动门控的CD45阳性细胞+ 第一层HSNE中的群体随后在更高层次的层级中进行了聚类。因此， Cytosplore 比手动设门聚焦于CD161更精确地定义了NK细胞亚群。然而，样本的层级聚类结果仍然保持一致，如右侧的树状图所示，表明两组（PD-L1和PBS）之间的分离不依赖于所选择的聚类方法。
可通过这两种方法手动定义聚类数量。Cytofast 能够帮助用户评估其数据的异质性，并为如何选择将数据划分的聚类数量提供参考。Cytofast 软件包还包含其他功能，例如 msiPlot 函数（步骤 3.4.2），可显示每组中每个标记物的中位信号强度（MSI）图（图6 和 图7）。该函数可用于检测整体变化，例如在 PD-L1 处理组的 NK 细胞中 CD54 或 CD11c 表达水平的升高。此外，可在 Cytofast 软件包中加入可选功能，例如以柱状图或其他数据展示方式显示数据。后者需要添加由 R 生成的 ggplot 工具。
图 1：Cytofast 软件包的工作流程。 数据来源于免疫治疗处理或未处理 3 天后的肿瘤组织，通过质谱流式细胞术获得。比较了两种不同的聚类分析方法：Cytosplore 和 FlowSOM。Cytofast 用于可视化展示这两种方法之间的差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：经 Cytosplore 分析后，由 Cytofast 得出的聚类概览及各组中聚类的丰度。 热图展示了所有自然杀伤（NK）细胞聚类（CD161+ 细胞由 Cytosplore 自动定义），这些聚类在免疫治疗（PD-L1）后第3天被鉴定出来。所示数据基于 Cytosplore 的聚类结果，并整合了未处理组与PD-L1处理组的数据。ArcSinh5转换后的标志物表达水平以彩虹色标显示。在下方图示中，各样本的相对丰度以绿色到紫色的色标表示。右侧的系统发育树表示基于细胞亚群频率的样本间相似性。频率标尺代表均值的离散程度，较低或较高的频率分别以绿色或紫色表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：经 Cytofast 分析 FlowSOM 聚类后的簇群概览及各组簇群丰度。 所有自然杀伤（NK）细胞簇群的热图（预设门控于 CD161+ 事件），这些簇群在免疫治疗（PD-L1）后第 3 天被鉴定。数据基于 FlowSOM 聚类分析，并整合了未处理组与 PD-L1 处理组的结果。ArcSinh5 转换后的标志物表达水平以彩虹色标显示。下方面板中，各样本的相对丰度以绿色至紫色的色标表示。右侧的系统发育树表示基于亚群频率的样本间相似性。频率标尺反映均值的离散程度，低频率或高频率分别以绿色或紫色表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：Cytosplore 定义的聚类在 Cytofast 中以箱线图形式展示。 每个聚类的频率以箱线图表示，并分为两组（PBS 和 PD-L1）。每个单独的圆点代表一只小鼠。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5：Cytofast 对 FlowSOM 定义的聚类结果以箱线图形式展示。 每个聚类的频率以箱线图表示，并分为两组（PBS 和 PD-L1）。每个单独的圆点代表一只小鼠。请点击此处查看该图的高清版本。
图 6：Cytosplore 自动设门的自然杀伤细胞信号强度分布图。 三个特定标记物 CD45、CD11c 和 CD54 的信号强度分布以直方图形式展示。请点击此处查看该图的高清版本。
图 7：由 FlowSOM 自动设门的自然杀伤细胞信号强度分布图。 以直方图形式展示三个特定标志物（CD45、CD11c 和 CD54）的信号强度分布，按 PBS 组和 PD-L1 组进行分组。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件 1.1–1.8。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。
补充文件 2.1–2.10。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。
补充文件 3。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。
补充文件 4.1–4.8。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。
补充文件 5。 请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。
讨论
Cytofast 是一种快速计算工具，通过突出显示和量化特定处理的细胞亚群，实现对细胞计量数据的快速全局探索。本方案旨在使用 Cytosplore 或 FlowSOM 进一步处理聚类分析。其他聚类分析工具也可与 Cytofast 配合使用，但需通过 Cytofast 将每个细胞分配至相应的亚群。然而，Cytofast 本身并非聚类方法，因此在使用前必须先完成聚类分析步骤。
本研究的分析结果表明，肿瘤微环境中某些 CD161+ NK 细胞亚群对 PD-L1 阻断治疗敏感。这一结论通过使用 Cytosplore 和 FlowSOM 两种聚类方法观察其表型和丰度的变化得以证实。两种方法均识别出主要的 NK 细胞簇（CD11b+ NKG2A+），但频率略有差异（Cytosplore 为 15%–20%，FlowSOM 为 30%–40%）。尽管丰度及该近似值存在差异，但并未影响整体模式，因为 图 2 和 图 3 右侧面板中显示的两个树状图均呈现出相似的结果。因此，通过使用 Cytofast，无论选择何种聚类方法，均可基于 NK 细胞簇的表型和丰度分析，有效区分接受 PD-L1 治疗与未接受治疗的小鼠。
根据所记录的参数，需要对实验方案进行相应修改。具体而言，在进行聚类分析时，必须去除时间、背景等特定参数。此外，确保每个细胞都被分配到一个亚群中至关重要。cfData 函数会将每个样本中每个聚类的原始细胞计数直接添加到 cfList 中。从这一步开始，可按照第 3 节所述方法构建细胞热图。
Cytofast 已成功用作可视化和定量分析工具，用于比较不同的聚类方法13。该 R 软件包还兼容多种高级功能，例如 globaltest14，可用于利用临床变量检测不同聚类组之间的关联性。未来，globaltest 工具及其他算法可与 Cytofast 进一步整合，以实现更深入的可视化与定量分析。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢欧洲委员会根据提案编号675743（ISPIC）提供的H2020 MSCA项目资助。感谢Tetje van der Sluis和Iris Pardieck对本实验方案的测试。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 计算机 | Dell | NA | NA |
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重印与许可
