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方法文章

体外刺激与可视化分化人单核细胞来源巨噬细胞的胞外诱捕网释放

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DOI：

10.3791/60541

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2019年11月1日

 ,  ,  , 
1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用显微镜和荧光染色在活细胞培养中检测巨噬细胞胞外诱捕网（MET）生成的实验方案。该方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色来检测特定的MET蛋白标志物。

摘要

中性粒细胞释放胞外诱捕网（ETs）已被确认为慢性炎症相关疾病发展的一个促成因素。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）由DNA、组蛋白以及多种颗粒蛋白（如髓过氧化物酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶G）构成的网状结构组成。其他免疫细胞（包括巨噬细胞）也能产生ETs；然而，这种现象在体内的发生程度以及巨噬细胞胞外诱捕网（METs）是否参与病理机制，目前尚未得到深入研究。为了更好地理解METs在炎症性疾病中的作用，已建立了一种用于体外可视化人原代巨噬细胞释放METs的实验方案，该方案也可应用于免疫荧光实验。这有助于进一步表征这些结构，并将其与中性粒细胞释放的ETs进行比较。人单核细胞来源的巨噬细胞（HMDM）在分化为M1型促炎表型后，经不同炎症刺激可产生METs。METs的释放可通过显微镜观察，使用一种不能穿透活细胞的绿色荧光核酸染料（如SYTOX Green）进行检测。使用新鲜分离的原代巨噬细胞（如HMDM）有助于模拟与潜在临床应用相关的体内炎症事件。该方案也可用于研究人单核细胞系（如THP-1）在经佛波酯（PMA）或其他诱导剂分化为巨噬细胞后，或其它巨噬细胞系（如小鼠巨噬细胞样J774A.1细胞）的MET释放过程。

引言

中性粒细胞释放胞外诱捕网（ETs）最初被确认为由细菌感染引发的一种先天免疫反应1。ETs由DNA骨架组成，其上结合了多种具有抗菌特性的颗粒蛋白，包括中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶2。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的主要功能是捕获病原体并促进其清除3。然而，除了在免疫防御中的保护作用外，越来越多的研究还发现ETs在疾病发病机制中发挥作用，尤其是在炎症驱动性疾病（如类风湿关节炎和动脉粥样硬化4）的发展过程中。ETs的释放可由多种促炎细胞因子触发，包括白细胞介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNFα）5,6，局部ETs的积聚可加重组织损伤并诱发促炎反应7。例如，ETs已被证实参与动脉粥样硬化的发生发展8，促进血栓形成9，并可预测心血管风险10。

目前公认，除了中性粒细胞外，其他免疫细胞（如肥大细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞）在受到微生物或促炎刺激时也能释放胞外诱捕网（ETs）11,12。这一点在巨噬细胞中可能尤为重要，因为巨噬细胞在慢性炎症性疾病的发生、调控及消退过程中发挥着关键作用。因此，深入理解巨噬细胞释放ETs与炎症相关疾病发展之间的潜在关联具有重要意义。近期研究已在完整的人体动脉粥样硬化斑块和组织化血栓中检测到巨噬细胞胞外诱捕网（METs）和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的存在13。类似地，METs也被认为通过调控炎症反应参与驱动肾损伤14。然而，与中性粒细胞相比，关于METs由巨噬细胞形成的机制研究仍较为有限。近期利用人源体外METs形成模型的研究显示，不同类型细胞参与的通路存在一些差异（例如，巨噬细胞中不存在组蛋白瓜氨酸化）6。然而，也有研究指出，即使在无组蛋白瓜氨酸化的情况下，仍可发生NETs的释放15。

本实验方案的总体目标是提供一种简单直接的方法，用于在具有临床相关性的巨噬细胞模型中评估MET的释放。目前已有多种体外巨噬细胞细胞模型被用于研究MET（例如，THP-1人单核细胞系和多种小鼠巨噬细胞系）16。然而，这些模型存在一定的局限性。例如，将THP-1单核细胞分化为巨噬细胞通常需要一个预刺激步骤，如添加佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA），而PMA本身会激活蛋白激酶C（PKC）依赖性通路。该过程已被证实可触发ET的释放4，并导致THP-1细胞的基础MET释放水平较低。其他研究还指出，与体内巨噬细胞产生的生物活性和炎症反应相比，PMA处理的THP-1细胞存在一些差异17。

同样，不同小鼠类巨噬细胞系的行为和炎症反应并不能完全代表原代人巨噬细胞的反应谱18。因此，在临床背景下研究巨噬细胞胞外诱捕网（ET）形成时，原代人单核细胞来源的巨噬细胞（HMDMs）被认为比单核细胞系或小鼠类巨噬细胞系更为适用。

已证实，M1极化的人类单核细胞来源巨噬细胞（HMDMs）在暴露于多种不同炎症刺激物后可释放胞外诱捕网（ET），这些刺激物包括髓过氧化物酶衍生的氧化剂次氯酸（HOCl）、佛波酯（PMA）、肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素-8（IL-8）6。本文描述了一种将HMDMs极化为M1表型并可视化其在上述炎症刺激下释放巨噬细胞胞外诱捕网（MET）的实验方案。使用PMA作为MET释放的刺激物，以便与先前采用中性粒细胞的研究进行比较。重要的是，还使用HOCl、IL-8和TNFα来诱导MET释放，这些刺激物被认为更能模拟体内真实的炎症环境。用于可视化ET释放的显微镜方法涉及在活细胞培养物中使用SYTOX Green对胞外DNA进行染色，这是一种不可渗透细胞膜的绿色荧光核酸染料，已在先前的中性粒细胞研究中成功应用。该方法可快速定性评估ET的释放情况，但不适合作为单独手段用于量化ET释放的程度。若需比较不同处理条件或干预措施下ET释放的程度，则应采用其他适合的定量方法。

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方案

人单核细胞来源的巨噬细胞（HMDM）从血液中心提供的经悉尼地方卫生区伦理批准的人类血沉棕黄层制备物中分离获得。

1. HMDM 培养

  1. 使用市售的淋巴细胞分离试剂，从健康人外周血制备的血沉棕黄层中分离单核细胞，随后通过逆流离心淘析法进一步纯化19,20。
  2. 通过细胞离心涂片并使用改良的吉姆萨染色法染色，确认单核细胞的存在，以进行单核细胞表征19。
  3. 在无菌条件下，用不含血清的RPMI-1640培养基将单核细胞密度调整至1 × 106 个细胞/mL。将1 mL该细胞悬液加入12孔组织培养板的每个孔中。在37 °C、含5% CO2的细胞培养箱中培养2小时，以促进细胞贴附于培养板表面。
  4. 在无菌条件下，移除原有培养基，并更换为含有10%（v/v）混合人血清和20 mM L-谷氨酰胺的完全RPMI-1640培养基。
  5. 将细胞在37 °C、含5% CO2的细胞培养箱中继续培养8天，每2天更换一次培养基。

2. HMDM 的极化

  1. 在无菌条件下，通过向完全RPMI-1640培养基中添加干扰素γ（IFNγ；20 ng/mL）和脂多糖（LPS；1 μg/mL）来制备M1极化培养基。通过向完全RPMI-1640培养基中添加白细胞介素4（IL-4；20 ng/mL）来制备M2极化培养基。
  2. 在无菌条件下，吸除已按第1节所述接种并培养的人源单核细胞来源巨噬细胞（HMDM）所在组织培养板孔中的培养基。
  3. 用1 mL无菌PBS（预热至37 °C）小心洗涤细胞孔，重复3次。
  4. 向含有HMDM的每个孔中加入1 mL M1或M2极化培养基（根据实验需要选择合适的一种）。
  5. 将细胞置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。

3. 刺激HMDM以诱导MET释放

  1. 在无菌条件下，向完全 RPMI-1640 培养基中加入不同 MET 释放刺激物（根据实验需要选择适当的刺激物）：PMA（25 nM）、人重组 TNFα（25 ng/mL）或人重组 IL-8（50 ng/mL）。
  2. 对于使用HOCl刺激的实验，在加入细胞前立即用预热至37 °C的HBSS配制HOCl（200 μM）。确保不要在完全培养基中配制HOCl。
    注意： 通过测量溶液在292 nm处的紫外吸光度及pH = 11的条件，定量分析次氯酸（HOCl）储备液的浓度6 并使用消光系数350 M-1cm-1 21.
  3. 在完成第2节所述的极化处理后，吸出每个孔中的细胞培养基，并用1 mL预热至37 °C的无菌PBS（用于PMA、TNFα和IL-8）或HBSS（用于HOCl）小心洗涤细胞3次。
  4. 对于使用PMA、TNFα或IL-8的实验：在最后的洗涤步骤中去除PBS后，加入1 mL含有PMA、TNFα或IL-8的完全培养基。
  5. 对于 TNFα 实验，在 5% CO₂ 条件下，于 37 °C 将细胞孵育 6 小时2 在细胞培养箱中孵育。对于PMA和IL-8实验，在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞24小时。2 在细胞培养箱中。
  6. 在使用 HOCl 的实验中，于最后洗涤步骤去除 HBSS 后，加入 1 mL HOCl 的 HBSS 溶液。然后在 5% CO₂ 条件下于 37 °C 孵育细胞 15 分钟。2 在细胞培养箱中。
    1. 小心吸除细胞上清液，并按照步骤 3.3 中所述，用 1 mL 等份的 HBSS 洗涤细胞 3 次。
    2. 在完成最后一次洗涤步骤并移除HBSS后，加入1 mL完全RPMI-1640培养基。随后，在37 °C、5% CO₂条件下将细胞培养24 h。2 在细胞培养箱中。

4. 活细胞培养中MET的可视化

  1. 用HBSS配制浓度为40 μM的SYTOX Green染料。
  2. 在第3节所述处理结束时，直接向每孔含HMDM的培养孔中加入25 μL的40 μM染料，以诱导MET释放。
  3. 将细胞在室温（RT）避光孵育5分钟。
  4. 将含HMDM的组织培养板置于倒置荧光显微镜的载物台上，进行成像。
  5. 显微镜操作步骤
    1. 打开宽谱荧光光源、明场光源，以及配备高分辨率彩色数码相机的倒置显微镜（参见材料表）。
    2. 将滤光轮旋转至“2号”位置，用于绿色荧光成像（激发波长 = 504 nm，发射波长 = 523 nm），以对组织培养孔中的绿色染色样本进行成像。
    3. 使用5倍物镜，先通过显微镜的粗调焦旋钮，再用细调焦旋钮进行对焦，直至通过显微镜目镜观察时图像清晰、锐利。
    4. 将显微镜切换至相机模式。
    5. 启动配套软件。
    6. 在软件中选择采集选项卡。
    7. 点击播放按钮预览图像，并调节显微镜上的细调焦旋钮，直至软件预览窗口中的图像清晰、锐利。
    8. 点击采集按钮。
      注意：采集的图像将自动显示在配套软件中。
    9. 在软件中，点击文件 | 另存为，选择所需的图像文件格式保存。
    10. 在显微镜上，将滤光轮旋转至“5号”位置，用于明场成像，并重复步骤4.5.2–4.5.9，以获取相应的明场图像。
    11. 根据需要，重复步骤4.5.2–4.5.10进行后续图像采集。

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结果

显示HMDM在细胞分化刺激下形态变化的明场图像见图1。在用IFNγ和LPS处理HMDM的实验中，M1极化巨噬细胞呈现细长的纺锤形细胞形态，如图1（中间图）中的黑色箭头所示。作为对比，HMDM经IL-4处理48小时后，M2极化巨噬细胞的形态通常呈圆形且扁平，如图1（最右侧图）中的黑色箭头所示。

通过SYTOX green染料进行活细胞荧光成像，观察不同分化状态的HMDM表型释放METs的能力，结果如图2所示。图2A展示了各HMDM表型在未添加任何促炎刺激物的条件下培养24小时后的对照数据。在此情况下，绿色荧光染色极少，这与预期一致，因为该染料不能穿透完整细胞膜。图2B显示了M1型HMDM在暴露于HOCl、PMA、IL-8或TNFα...

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讨论

利用M1极化的HMDM生成并可视化MET的形成，代表了一种新的体外模型，可能有助于研究这些巨噬细胞结构在慢性炎症条件下潜在的病理作用。该方法为刺激原代人巨噬细胞释放METs提供了可靠的实验方案，也可应用于涉及人单核细胞或小鼠巨噬细胞系的相关研究。成功实施该方案以诱导HMDM形成METs，依赖于精细的细胞培养与操作，以维持良好的细胞活力，从而提高所观察到的METs的数量和质量。为了提供更优的细胞营养，维持HMDM所用的RPMI培养基应包含人血清而非胎牛血清，以及L-谷氨酰胺。该完全RPMI培养基的每批储存液应在1周内使用完毕。培养基的正确保存也至关重要，应避光保存于4 °C环境中。

此外，在培养人源巨噬细胞（HMDM）期间，通过显微镜定期观察和监测细胞的形态和形状至关重要。在添加IFNγ和LPS或IL-4（用于巨噬细胞极化）之前，若观察到细胞形态出现任何异常或意外变化，可能提示细胞存活率下降。HMDM应为贴壁细胞，且不增殖。因此，在常规的8天培养期间，必须密切监测细胞形态、细胞密度或贴壁能力是否发生改变。分离后前两天内若细胞密度显著下降，提示所获得的HMDM可能不足以用于后续实验。使...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了Perpetual IMPACT基金（IPAP201601422）和诺和诺德基金会生物医学项目基金（NNF17OC0028990）的支持。YZ还获得了悉尼大学澳大利亚研究生奖学金。我们感谢Pat Pisansarakit先生和Morgan Jones女士在单核细胞分离和组织培养方面提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
120Q 宽谱荧光光源EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canadax-cite 系列
Corning CellBIND 多孔培养板（12 孔）Sigma-AldrichCLS3336用于细胞培养
快速差异染色试剂盒（改良吉姆萨染色）Polysciences Inc.24606单核细胞表征
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）Thermo-Fisher14025050用于洗涤步骤和次氯酸处理
次氯酸（HOCl）Sigma-Aldrich320331用于 MET 刺激
干扰素 γThermo-FisherPMC4031用于 M1 极化
白细胞介素 4Integrated Sciencesrhil-4用于 M2 极化
白细胞介素 8Miltenyl Biotec130-093-943用于 MET 刺激
L-谷氨酰胺Sigma-Aldrich59202C添加至培养基中
脂多糖Integrated Sciencestlrl-eblps用于 M1 极化
LymphoprepAxis-Shield PoC AS1114544用于单核细胞分离
Olympus IX71 倒置显微镜Olympus, Tokyo, Japan
佛波酯 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）Sigma-AldrichP8139用于 MET 刺激
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD5652用于洗涤步骤
RPMI-1640 培养基Sigma-AldrichR8758用于细胞培养
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020用于 MET 可视化
TH4-200 明场光源Olympus, Tokyo, Japanx-cite 系列
肿瘤坏死因子 αLonza300-01A-50用于 MET 刺激

参考文献

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