线粒体运输和形态异常与多种神经退行性疾病相关。本方案利用诱导性多能干细胞分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中的线粒体运输和形态。该方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于推动神经退行性疾病的机制研究。
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摘要
摘要
神经元具有极高的能量需求，以维持其正常功能。在人类神经元中已观察到轴突内线粒体运输受损的现象，这可能在多种疾病状态下导致神经退行性变。尽管在活体人神经中研究线粒体动态变化具有挑战性，但此类研究范式对于探讨线粒体在神经退行性变中的作用至关重要。本文所述是一种用于分析源自人诱导性多能干细胞（iPSCs）的前脑神经元轴突中线粒体运输及线粒体形态的实验方案。采用成熟的方法将iPSCs分化为端脑谷氨酸能神经元。使用MitoTracker CMXRos对神经元中的线粒体进行染色，并利用配备细胞培养孵育系统的活细胞成像显微镜捕获轴突内线粒体的运动过程。通过软件对时间序列图像进行分析，以 "多线Kymograph", "Bioformat 导入器"，以及 "宏" 插件生成线粒体运输的显微轨迹图（kymograph），并从图中读取顺向和逆向运输的线粒体平均速度。关于线粒体形态学分析，使用ImageJ获取线粒体的长度、面积和长宽比。综上所述，该实验方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于神经退行性疾病的相关研究。
引言
线粒体的运动与分布对于满足极化神经元中多变且特化的能量需求具有重要作用。神经元可通过形成突触，延伸出极长的轴突以连接靶细胞，而这一过程需要大量能量用于 Ca2+ 缓冲和离子电流。线粒体从胞体向轴突的运输对于维持轴突和突触功能至关重要。线粒体在空间和时间上的动态移动依赖快速轴突运输实现，其速度可达每秒数微米1。
具体而言，马达蛋白或衔接蛋白（如驱动蛋白和动力蛋白）参与线粒体沿微管的快速运输，从而调控线粒体的运动2,3。正常的神经元活动需要将新组装的线粒体从神经元胞体有效运输至远端轴突（顺向轴突运输），以及将线粒体从远端轴突逆向运回胞体（逆向运输）。近期研究表明，线粒体分布异常与神经元功能缺陷及运动神经元变性疾病密切相关4,5。因此，为了阐明线粒体在神经变性过程中的作用，建立可在活体培养神经元中检测轴突上线粒体运动的方法至关重要。
在研究和分析线粒体运动轨迹时，主要存在两个挑战：（1）从每帧图像的背景中识别出线粒体；（2）分析并建立各帧之间的连接关系。为解决第一个挑战，通常采用荧光标记方法将线粒体与背景区分开来，例如使用Mi....
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方案
1. 由iPSCs生成端脑谷氨酸能神经元
注意：维持诱导多能干细胞（iPSCs）及其向端脑谷氨酸能神经元分化的详细方案与先前报道的方法类似18。本文将介绍并重点强调人多能干细胞分化过程中的关键步骤。
- 在添加成纤维细胞生长因子（bFGF，4 ng/mL）的人胚胎干细胞（hESC）培养基中，将iPSCs培养于小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上。
- 用dispase（1 mg/mL）孵育3分钟后，将iPSCs解离成小团块，随后在hESC培养基中以悬浮培养方式培养4天。将iPSCs开始悬浮培养的时间点记为第1天（D1），并在此期间每天更换培养基。
- 在D5时，将iPSC聚集体以200 x g离心2分钟，收集后转入神经诱导培养基（NIM）中培养3天。以悬浮方式培养3天，每2天更换一半培养基。在NIM培养基中添加DMH-1（2 μM）和SB431542（2 μM）以提高神经诱导效率。
- 在D8时，将iPSC聚集体以200 x g离心2分钟，收集后接种于6孔板中（每孔约20–30个聚集体），在含10% FBS的NIM培养基中过夜培养使其贴壁（或使用层粘连蛋白包被的培养板）。次日去除旧培养基，此后每2天更换一次NIM培养基，直至D17。
注：在此阶段可观察到神经上皮细胞的生成，表现为形成具有玫瑰花环结构的柱状细胞。<....
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结果
本研究将人iPSCs分化为端脑谷氨酸能神经元，并通过Tbr1和βIII微管蛋白标记物的免疫染色对其进行鉴定（图1A）。为观察线粒体的轴突运输，对这些细胞进行红色荧光染料染色，并进行延时成像。由于ImageJ易于获取且使用方便，因此进一步采用“MultiKymograph”和“Macros”ImageJ插件对线粒体运输进行分析，结果如图1所示。
线粒体运动存在三种状态，分别为静止、顺向运动和逆向运动（图1B,C）。单个线粒体可在轴突内保持静止，或进行顺向或逆向移动，此处沿线粒体运动轨迹绘制分段线以测定其运动速度（图1D）。线粒体沿轴突的运动速度如图1E所示.......
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讨论
本文介绍了一种利用红色荧光染料和ImageJ软件分析神经元轴突中线粒体运输和形态的方法，这两种工具为研究神经退行性疾病中的轴突变性和线粒体形态提供了独特的平台。该实验方案包含多个关键步骤，包括线粒体染色、活细胞成像以及图像分析。在本方法中，使用荧光染料对线粒体进行染色。由于人iPSC来源的神经元容易从培养皿上脱落，因此在操作过程中需在培养皿中保留部分溶液，并轻柔地加入Neurobasal培养基。洗涤步骤可重复三至四次以彻底去除染料。此外，也可使用其他报告分子标记线粒体，以检测其在轴突中的运输情况，例如与荧光蛋白融合的线粒体靶向蛋白6。在长期示踪中，多种探针（如NPA-TPP、2,1,3-苯并噻二唑[BTD]荧光衍生物以及特异性拉曼探针）在长期线粒体追踪和线粒体动力学分析方面表现出巨大潜力23,24,25。各类探针的优缺点详见表1。
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由痉挛性截瘫基金会、布莱泽基金会和美国国立卫生研究院（NIH，项目编号R21NS109837）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accutase 细胞解离液 | 创新细胞技术 | AT104 | |
| 生物安全柜 | Thermo Scientific | 1300 系列 A2 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A-7906 | |
| 脑源性神经营养因子（BDNF） | Peprotech | 450-02 | |
| 离心 | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| 盖玻片 | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| 环磷酸腺苷（cAMP） | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| 含F12营养混合物的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM/F12） | 康宁 | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| 成纤维细胞生长因子2（FGF2，bFGF） | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free 无生长因子还原型基底膜基质 | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex无血清补充剂 | Gemini | 400-160 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' 玻璃移液管 | VWR | 14673-043 | |
| 胶质细胞源性神经营养因子（BDNF） | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| 肝素 | Sigma | H3149 | |
| 胰岛素样生长因子1（IGF1） | Invitrogen | M7512 | |
| 敲除血清替代物 | Gibco | A31815 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L-6274 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle 无血清培养添加剂 | 双子座 | 400-163 | |
| 奥林巴斯显微镜 IX83 | 奥林巴斯 | IX83-ZDC2 | |
| PBS | 康宁 | 21-031-CV | |
| 相差显微镜 | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6孔板 | 康宁 | 353046 | |
| 24孔板 | 康宁 | 353047 | |
| 盐酸多聚-L-鸟氨酸（polyornithine） | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| 无菌 50 ml 一次性真空过滤系统 0.22 μm Millipore Express® Plus膜 | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 抗体（1:2000） | Chemicon | AB9616 | |
| 胰蛋白酶抑制剂 | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml 离心管 | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml 离心管 | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 培养瓶（未处理） | VWR | 10861-572 | |
| 软件插件 | |||
| Bio-formats 软件包 | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji 软件 | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph 插件 | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
参考文献
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along micro....
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重印与许可
