分析遗传性痉挛性截瘫患者来源的人诱导多能干细胞衍生神经元中的线粒体运输与形态

摘要

线粒体运输和形态异常与多种神经退行性疾病相关。本方案利用诱导性多能干细胞分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中的线粒体运输和形态。该方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于推动神经退行性疾病的机制研究。

摘要

神经元具有极高的能量需求，以维持其正常功能。在人类神经元中已观察到轴突内线粒体运输受损的现象，这可能在多种疾病状态下导致神经退行性变。尽管在活体人神经中研究线粒体动态变化具有挑战性，但此类研究范式对于探讨线粒体在神经退行性变中的作用至关重要。本文所述是一种用于分析源自人诱导性多能干细胞（iPSCs）的前脑神经元轴突中线粒体运输及线粒体形态的实验方案。采用成熟的方法将iPSCs分化为端脑谷氨酸能神经元。使用MitoTracker CMXRos对神经元中的线粒体进行染色，并利用配备细胞培养孵育系统的活细胞成像显微镜捕获轴突内线粒体的运动过程。通过软件对时间序列图像进行分析，以 "多线Kymograph", "Bioformat 导入器"，以及 "宏" 插件生成线粒体运输的显微轨迹图（kymograph），并从图中读取顺向和逆向运输的线粒体平均速度。关于线粒体形态学分析，使用ImageJ获取线粒体的长度、面积和长宽比。综上所述，该实验方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于神经退行性疾病的相关研究。

引言

线粒体的运动与分布对于满足极化神经元中多变且特化的能量需求具有重要作用。神经元可通过形成突触，延伸出极长的轴突以连接靶细胞，而这一过程需要大量能量用于 Ca²⁺ 缓冲和离子电流。线粒体从胞体向轴突的运输对于维持轴突和突触功能至关重要。线粒体在空间和时间上的动态移动依赖快速轴突运输实现，其速度可达每秒数微米¹。

具体而言，马达蛋白或衔接蛋白（如驱动蛋白和动力蛋白）参与线粒体沿微管的快速运输，从而调控线粒体的运动^2,3。正常的神经元活动需要将新组装的线粒体从神经元胞体有效运输至远端轴突（顺向轴突运输），以及将线粒体从远端轴突逆向运回胞体（逆向运输）。近期研究表明，线粒体分布异常与神经元功能缺陷及运动神经元变性疾病密切相关^4,5。因此，为了阐明线粒体在神经变性过程中的作用，建立可在活体培养神经元中检测轴突上线粒体运动的方法至关重要。

在研究和分析线粒体运动轨迹时，主要存在两个挑战：（1）从每帧图像的背景中识别出线粒体；（2）分析并建立各帧之间的连接关系。为解决第一个挑战，通常采用荧光标记方法将线粒体与背景区分开来，例如使用MitoTracker染料，或转染带有荧光蛋白融合的线粒体靶向蛋白（如mito-GFP）^6,7,8。为分析帧间关联，已有多个算法和软件工具在先前的研究中被描述⁹。在最近的一项研究中，研究人员比较了四种不同的自动化工具（如Volocity、Imaris、wrMTrck和Difference Tracker）用于量化线粒体运输。结果显示，尽管这些工具在轨迹长度、线粒体位移、运动持续时间和速度方面存在一定差异，但它们均适用于评估处理后的运输差异¹⁰。除上述工具外，ImageJ中一个由Rietdorf和Seitz编写的集成插件"Macros"也已被广泛用于分析线粒体运输¹¹。该方法可生成用于分析线粒体运动的明图（kymograph），包括顺向和逆向运动的速度。

线粒体是高度动态的细胞器，其数量和形态会随着生理和病理条件的变化而不断改变。线粒体分裂与融合过程严格调控着线粒体的形态和稳态。线粒体分裂与融合之间的失衡可导致线粒体网络异常缩短或延长，进而损害线粒体功能，引发神经元活动异常及神经退行性病变。线粒体运输和形态的异常参与多种神经退行性疾病的发生发展，例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及遗传性痉挛性截瘫（HSP）^12,13,14,15。遗传性痉挛性截瘫是一组异质性的遗传性神经系统疾病，其特征为皮质脊髓束退变，继而导致下肢肌肉控制功能障碍^16,17。本研究利用诱导多能干细胞（iPSC）分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中线粒体的运输和形态。该方法为在活细胞培养体系中研究神经元轴突内线粒体动态变化提供了独特的实验范式。

方案

1. 由iPSCs生成端脑谷氨酸能神经元

注意：维持诱导多能干细胞（iPSCs）及其向端脑谷氨酸能神经元分化的详细方案与先前报道的方法类似¹⁸。本文将介绍并重点强调人多能干细胞分化过程中的关键步骤。

1. 在添加成纤维细胞生长因子（bFGF，4 ng/mL）的人胚胎干细胞（hESC）培养基中，将iPSCs培养于小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上。
2. 用dispase（1 mg/mL）孵育3分钟后，将iPSCs解离成小团块，随后在hESC培养基中以悬浮培养方式培养4天。将iPSCs开始悬浮培养的时间点记为第1天（D1），并在此期间每天更换培养基。
3. 在D5时，将iPSC聚集体以200 x g离心2分钟，收集后转入神经诱导培养基（NIM）中培养3天。以悬浮方式培养3天，每2天更换一半培养基。在NIM培养基中添加DMH-1（2 μM）和SB431542（2 μM）以提高神经诱导效率。
4. 在D8时，将iPSC聚集体以200 x g离心2分钟，收集后接种于6孔板中（每孔约20–30个聚集体），在含10% FBS的NIM培养基中过夜培养使其贴壁（或使用层粘连蛋白包被的培养板）。次日去除旧培养基，此后每2天更换一次NIM培养基，直至D17。
   注：在此阶段可观察到神经上皮细胞的生成，表现为形成具有玫瑰花环结构的柱状细胞。
5. 在D17时，通过机械法（在克隆中心施加轻微压力直接挑取）或酶解法（使用dispase处理）分离克隆中心的神经上皮细胞。将分离后的神经上皮细胞转移至未包被的组织培养T25培养瓶中，瓶内含8 mL NIM培养基，并添加B27（1x）、cAMP（1 µM）和IGF（10 ng/mL）。
   注：悬浮培养可使细胞形成富含皮层投射神经前体细胞的神经球。
6. 自D35起，将神经球接种于已包被多聚鸟氨酸和LDEV-free低生长因子基底膜基质（材料表）的35 mm玻璃底培养皿中，以诱导生成端脑谷氨酸能神经元（皮层投射神经元）。接种前，将神经球在37 °C下用1 mg/mL细胞解离液孵育2分钟，使其解离为小簇。
7. 通过离心去除细胞解离液，将细胞重悬于1 mL神经分化培养基（NDM）中。将细胞以小簇形式接种于玻璃底培养皿中（每皿约5个簇，100 µL培养基），使其贴壁。随后加入NDM（每皿1 mL），并在含B27（1x）、cAMP（1 µM）、IGF（10 ng/mL）、hBDNF（10 ng/mL）和GDNF（10 ng/mL）的NDM中继续培养。
   注：选择接种小簇是因为其存活率高，并可发育为长投射神经元。也可将细胞完全解离后以约20,000个细胞/皿的密度接种，以获得更好的细胞分离效果。
8. 通过免疫染色检测Tbr1和βIII-微管蛋白标志物，对端脑谷氨酸能神经元进行表征。

2. 端脑谷氨酸能神经元轴突中线粒体运输的检测

1. 将NDM预热，并开启荧光显微镜的培养箱，设置温度为37 °C、5% CO₂。
2. 为观察前脑神经元轴突中的线粒体，将神经元在NDM中加入50 nM红色荧光染料（如MitoTracker CMXRos）孵育3分钟，以标记活细胞中的线粒体，温度保持在37 °C。随后，用预热的NDM洗涤细胞2次。神经元继续在NDM中孵育。
3. 为记录轴突中线粒体的运输过程，使用40倍物镜的荧光显微镜采集线粒体运动的时间序列图像。
   注意：为稳定培养状态，在线粒体染色后，待细胞在培养箱中孵育20分钟后再进行活细胞成像。
4. 在相差视野下，根据形态学特征识别轴突（直接从神经元胞体发出、细长且无分支的突起）。线粒体在轴突中沿顺行方向（从胞体向远端轴突）和逆行方向（从轴突末端向胞体）移动。为区分线粒体沿轴突移动的方向，需清晰辨认神经元的胞体。此步骤中，使用相差视野对轴突进行对焦，以减少光漂白。
5. 在区分出胞体与轴突后，调整轴突中线粒体的曝光时间和焦平面。随后，每5秒采集一次轴突内线粒体运输图像，持续5分钟，共获得60帧图像。每个培养皿随机采集至少五个位置，并对每组重复3次。

3. 皮层神经元中线粒体运输与形态的数据分析

注意：使用图像分析软件（例如 ImageJ 或 MetaMorph¹⁹）分析收集到的线粒体运输数据。由于 ImageJ 易于获取，可使用配备 MultiKymograph、Macros 和 Analyze particles 插件的 ImageJ 进行线粒体运输和形态分析。

1. 使用 ImageJ 分析线粒体运输
   1. 捕获线粒体运动的延时图像后，使用 MultiKymograph 插件分析线粒体的速度和运动。图像以 .tiff 格式文件保存，并按照先前报道的方法²⁰通过 Fiji 软件进行分析。
   2. 下载 Fiji 软件。从 kymograph 分析所需插件中下载 Bio-formats Package 和 Kymograph Plugin，以及以下四个 .class 插件：包括 MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class 和 WalkingAverage.class（材料表）。将这些文件移至 Fiji 插件文件夹中。将 “tsp050706.txt” 插件下载至插件文件夹。当文件移至插件文件夹后，重启 Fiji 软件。
   3. 打开 Fiji 软件。选择 plugins，然后通过 Bio-Formats 下的 Bio-Formats Importer 导入 .tiff 系列图像。确保在 Stack viewing 中选择 Standard ImageJ，选择 Open all series，勾选 Autoscale，然后点击 OK。注意图像顶部显示的帧数和以像素为单位的图像尺寸。
      注：每幅图像取 60 帧。
   4. 可考虑通过 Image 菜单下的 亮度/对比度 调整，使所有 60 帧图像更清晰。
   5. 右键单击线条工具，选择 分段线，从细胞体开始，沿轴突末端绘制一条分段线。通过选择 Plugins 下的 MultipleKymograph 生成 kymograph。选择 MultipleKymograph 后会提示选择线宽。确保该值为奇数。线宽选择 1。此步骤完成后将生成 kymograph。
      注：可从 kymograph 中读取若干重要信息。kymograph 的 y 轴表示 60 帧的持续时间（5 分钟），x 轴表示所选轴突的位置。
   6. 使用 kymograph 中的对角线判断线粒体的运动方向（顺行、逆行或静止）。例如，沿 y 轴向右下方倾斜的线表示顺行运动，向左下方倾斜的线表示逆行运动。垂直线表示线粒体无运动。
   7. 使用 Fiji 软件中的 Macros 插件测量运动线粒体的距离、时间值和速度。进入 Plugins | Macros | Install | tsp050607.txt。在 kymograph 上线粒体运动轨迹处绘制一条分段线，并始终从上方到下方区域（y 轴）绘制该线。
   8. 绘制完线条后，进入 Plugins | Macros | read velocities from tsp。由于已沿轨迹绘制了分段线，插件将读取与该线对应的分段速度。
      注：所有数据的单位均为像素。dy sum 表示从起点所消耗的时间，dx sum 表示线粒体在 x 轴方向移动的距离。dy now 和 dx now 分别表示每一段的时间周期和移动距离。actual speed 表示每一段的速度（dx now/dy now）。average speed 表示线粒体移动的平均速度（dx sum/dy sum）。
   9. 通过测量标尺，将 dx now 的单位从像素转换为 µm，以确定像素与 µm 的比例。通过测量图像中的标尺，将距离单位从像素转换为 µm。使用线条工具沿标尺绘制一条线，并通过选择 Analyze 下的 “Measure” 测量该线长度。将时间从像素转换为秒，本实验中 1 像素 = 5 秒。
   10. 在电子表格文件中计算平均速度，并相应地标记逆行或顺行运动。对顺行或逆行运动速度取平均值。
   11. 从 kymograph 中确定静止和运动线粒体的百分比。在整个时间段内向前或向后移动超过 5 µm 的线粒体定义为顺行或逆行运动的线粒体²¹。在 5 分钟内移动不超过 5 µm 的线粒体视为静止。
2. 使用 ImageJ 分析线粒体形态
   注：通过 ImageJ 测量线粒体长度、面积和长宽比来确定线粒体形态。请按以下步骤操作。
   1. 为分析轴突内的线粒体长度和面积，请从 ImageJ 网站下载 Straighten_.jar 插件（见 材料表），并将其移至 plugins 文件夹。重启 ImageJ 软件。
   2. 通过 File 下的 open 功能打开图像，并使用 Image 下的 Type 将 32 位图像转换为 8 位。
   3. 沿轴突绘制一条 分段线。选择 Plugins 下的 Straighten，并将 Width of Filament/Wide Line 设置为 50 像素。这将生成一条拉直的轴突。
   4. 在 Image 下调整阈值，并在 Analyze 中选择 “Area | Perimeter | Fit ellipse | Shape descriptors” 设置测量参数。
   5. 使用线条工具测量标尺，并在 Analyze 中填写 distance in pixel、known distance 和 the unit of length 以设置比例。然后选择 Global 以应用此比例设置。
   6. 使用 Analyze 下的 Analyze Particles 确定面积。提示参数为：size (pixel^2) = 0.20–infinity，circularity = 0.00–1.00，show = ellipses。选择 Display results。
      注：测量将得到多个线粒体形态参数结果，包括面积、周长、长度（长轴）、宽度（短轴）和长宽比（AR）。相应的线粒体数量也将列出。
   7. 通过线粒体数量除以轴突长度，计算每根轴突（µm）的线粒体数量。

结果

在此，人iPSCs被分化为端脑谷氨酸能神经元，并通过Tbr1和βIII微管蛋白标记物的免疫染色进行表征（图1A）。为观察线粒体的轴突运输，对这些细胞用红色荧光染料进行染色，并进行延时成像。由于ImageJ易于获取，因此进一步使用“MultiKymograph”和“Macros”ImageJ插件对线粒体运输进行分析，结果如图1所示。

线粒体运动存在三种状态，分别为静止、顺向运动和逆向运动（图1B,C）。单个线粒体可在轴突内保持静止，或进行顺向或逆向移动，此处沿线粒体运动轨迹绘制分段线以测定其运动速度（图1D）。沿线突运动的线粒体速度如图1E所示，对应于Im...

讨论

本文介绍了一种利用红色荧光染料和ImageJ软件分析神经元轴突中线粒体运输和形态的方法，这两种工具为研究神经退行性疾病中的轴突变性和线粒体形态提供了独特的平台。该实验方案包含多个关键步骤，包括线粒体染色、活细胞成像以及图像分析。在本方法中，使用荧光染料对线粒体进行染色。由于人iPSC来源的神经元容易从培养皿上脱落，因此在操作过程中需在培养皿中保留部分溶液，并轻柔地加入Neurobasal培养基。洗涤步骤可重复三至四次以彻底去除染料。此外，也可使用其他报告分子标记线粒体，以检测其在轴突中的运输情况，例如与荧光蛋白融合的线粒体靶向蛋白⁶。在长期示踪中，多种探针（如NPA-TPP、2,1,3-苯并噻二唑[BTD]荧光衍生物以及特异性拉曼探针）在长期线粒体追踪和线粒体动力学分析方面表现出巨大潜力^23,24,25。各类探针的优缺点详见表1。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase 细胞解离液	创新细胞技术	AT104
生物安全柜	Thermo Scientific	1300 系列 A2
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A-7906
脑源性神经营养因子（BDNF）	Peprotech	450-02
离心	Thermo Scientific	Sorvall Legend X1R/ 75004261
盖玻片	Chemiglass Life Sciences	1760-012
环磷酸腺苷（cAMP）	Sigma-Aldrich	D0627
Dispase	Gibco	17105-041
Dorsomorphin	Selleckchem	S7146
含F12营养混合物的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM/F12）	康宁	10-092-CV
FBS	Gibco	16141-002
成纤维细胞生长因子2（FGF2，bFGF）	Peprotech	100-18B
Geltrex LDEV-Free 无生长因子还原型基底膜基质	Gibco	A1413201
Gem21 NeuroPlex无血清补充剂	Gemini	400-160
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0.170-14-C
9'' 玻璃移液管	VWR	14673-043
胶质细胞源性神经营养因子（BDNF）	Sigma-Aldrich	D0627
GlutaMAX-I	Gibco	35050-061
肝素	Sigma	H3149
胰岛素样生长因子1（IGF1）	Invitrogen	M7512
敲除血清替代物	Gibco	A31815
层粘连蛋白	Sigma	L-6274
2-巯基乙醇	Sigma	M3148-100ML
MitoTracker CMXRos	Invitrogen	M7512
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
非必需氨基酸	Gibco	11140-050
N2 NeuroPle 无血清培养添加剂	双子座	400-163
奥林巴斯显微镜 IX83	奥林巴斯	IX83-ZDC2
PBS	康宁	21-031-CV
相差显微镜	Olympus	CKX41/ IX2-SLP
6孔板	康宁	353046
24孔板	康宁	353047
盐酸多聚-L-鸟氨酸（polyornithine）	Sigma-Aldrich	P3655
SB431542	Stemgent	04-0010
无菌 50 ml 一次性真空过滤系统 0.22 μm Millipore Express® Plus膜	Millipore	SCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF	Millipore	SCGVU10RE
Tbr1 抗体（1:2000）	Chemicon	AB9616
胰蛋白酶抑制剂	Gibco	17075029
50 ml 离心管	Phenix	SS-PH50R
15 ml 离心管	Phenix	SS-PH15R
T25 培养瓶（未处理）	VWR	10861-572
软件插件
Bio-formats 软件包	http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji 软件	https://fiji.sc/
Kymograph 插件	https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.class	https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.class	https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.class	https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.class	https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jar	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txt	https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html