在气液界面暴露培养的人肺细胞评估空气颗粒物的急性吸入毒性

摘要

我们介绍一种稳定、可转移且具有预测性的体外暴露系统，通过在气液界面（ALI）暴露培养的人肺细胞，用于筛选和监测空气颗粒物的急性肺部细胞毒性。

摘要

本文介绍了一种专门设计的模块化体外暴露系统，该系统可实现培养的人肺细胞在气液界面（ALI）对气体、颗粒物或复杂大气环境（如香烟烟雾）的均匀暴露，从而为人体肺泡区域的顶面提供接近生理条件的空气暴露。与采用线性气溶胶导引的顺序暴露模型相比，这种径向流动系统的模块化设计满足了测试大气持续生成与输送至细胞、颗粒物均匀分布与沉降以及大气持续排出的所有要求。该暴露方法主要用于细胞对空气传播颗粒物的暴露，但根据气溶胶生成方法及暴露模块材料的不同，也可适用于液态气溶胶以及高毒性与强反应性气体的暴露。

在最近完成的一项验证研究框架内，该暴露系统已被证实为一种可转移、可重复且具有预测性的筛选方法，可用于定性评估空气颗粒物的急性肺细胞毒性，从而有可能减少或替代通常用于此类毒理学评估的动物实验。

引言

吸入有毒的空气颗粒物是公共卫生领域的一大关切，已在全球范围内导致多种健康风险，并造成每年数以百万计的死亡^1,2。气候变化、持续的工业发展以及对能源、农产品和消费品日益增长的需求，导致近年来肺部疾病不断增加^3,4,5,6。了解和评估可吸入物质的急性吸入毒性，是进行危害评估和风险管理的基础，但目前仍缺乏大量此类物质的相关信息^7,8。自2006年起，欧盟化学品法规REACH（化学品的注册、评估、授权和限制）要求所有已存在或新上市的产品在投放市场前，必须进行包括吸入途径在内的毒理学表征。因此，REACH强调采用替代方法和非动物测试手段，推动实施"3R"原则（减少、优化和替代动物实验），并使用适当的体外模型⁹。近年来，已开发出多种有效且非动物的吸入毒性测试模型（例如体外细胞培养、芯片上肺模型、精确切割肺组织切片（PCLS）），用于评估空气颗粒物的急性吸入毒性^....

方案

注意：一次暴露实验的方案涵盖三天时间。

第1天

1. 细胞的常规准备与培养

注意：本实验使用人肺腺癌上皮细胞系 A549 进行暴露实验。细胞操作必须在无菌条件下进行。其他适合在气液界面（ALI）培养的细胞系也可使用。

1. 配制培养基（含10%胎牛血清（FBS）和5 µg/mL庆大霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM））和暴露用培养基（含5 µg/mL庆大霉素、终浓度为100 mM HEPES的DMEM）。
2. 在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中，用生长培养基培养A549细胞。
3. 在75 cm²（T-75）细胞培养瓶中加入14 mL生长培养基，将细胞培养至融合度达80–90%后进行传代（每2–3天一次），传代次数不超过35代。
4. 计算细胞悬液体积以及所需细胞培养插件数量（包括三个作为培养箱对照的插件、用于洁净空气和颗粒物暴露的插件）和细胞培养板数量。
5. 在消化和接种细胞前，向6孔板的每孔中加入2.5 mL预温的生长培养基。小心地将无细胞的细胞培养插件放入各孔中，并向每个插件中加入1 mL生长培养基。将6孔板置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）孵育至少30分钟。

结果

CULTEX RFS 是一种专门设计的模块化体外暴露系统，可实现细胞在气液界面（ALI）的直接且均一的暴露。在之前的一项预验证研究中，已成功证明了该暴露系统的普遍适用性及其可转移性、稳定性和可重复性。在德国联邦教育与研究部资助的一项最新研究项目中，该暴露系统已成功通过验证，并被确立为用于预测受试化合物急性吸入危害的预测模型（PM）。由于在预验证研究中发现洁净空气对照的质量是一个关键参数，因此在验证研究初期实施了多项方案和方法优化（例如更换细胞培养插件、通过将 HEPES 浓度提高至 100 mM 来稳定暴露培养基的 pH 值），从而在所有三个实验室中均获得了高度稳定且可重复的结果，并显著改善了洁净空气对照的细胞活力数据（图4）。随后，在三个独立实验室中，A549 细胞在气液界面（ALI）暴露于 20 种预先选定并编码的测试物质，每种物质设置三个不同的暴露剂量（25、50 和 100 µg/cm²），并将细胞毒性（作为毒性的指标）与相应的培养箱对照进行比较。其中，13 种编码物质进行了三次重复.......

讨论

近年来，为了获取有关可吸入颗粒物急性吸入危害的信息，并根据3R原则减少和替代动物实验，已开发出多种非动物吸入毒性测试模型²⁵.

在细胞培养模型方面，细胞暴露可在浸没条件下或气液界面（ALI）进行。在浸没条件下暴露细胞可能影响测试物质的理化性质，从而影响其毒性特征¹²。然而，体外ALI吸入模型比浸没暴露更接近人体实际暴露情况，具有更高的生物学和生理学相似性，因此更适合用于分析空气中颗粒物的急性吸入毒性。CULTEX RFS与其他现有暴露模块相比的重要意义不仅在于其可在ALI条件下进行细胞暴露，还在于能够实现颗粒物高度均匀的分布与沉降。与采用线性气溶胶导引的顺序式暴露模型不同，该暴露方法的模块化设计实现了径向供气，从而使颗粒物在细胞表面的沉降更加均匀¹⁷。

成功开展暴露实验最重要的要点是洁净空气对照组的质量必须稳定且一致。必须特别注意确保洁净空气对照组的细胞活力不会随时间推移而下降，并且应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞
A549	ATCC	CCL-185
细胞培养基与耗材
DMEM	Biochrom, Berlin, Germany	FG 0415	用作生长培养基
DMEM	Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany	22320	用作暴露培养基
FBS superior	Biochrom, Berlin, Germany	S 0615
庆大霉素（10 mg/mL）	Biochrom, Berlin, Germany	A 2710
HEPES 1 M	Th. Geyer, Renningen, Germany	L 0180
PBS	Biochrom, Berlin, Germany	L 1825
胰蛋白酶/EDTA（0.05%/0.02%）	Biochrom, Berlin, Germany	L 2143
细胞培养材料
CASY 杯	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651794
细胞培养板	Corning, Wiesbaden, Germany	3516	6­-孔板
Corning Transwell 细胞培养小室	Corning, Wiesbaden, Germany	3450	24 mm 小室；6-­孔板；0.4 µm 孔径
化学试剂
CASYton	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651808001
压缩空气（DIN EN 12021）	Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany	2290152
WST-1	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab155902
仪器与设备
CASY 细胞计数仪	Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
循环恒温器	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline RE 100
CULTEX HyP - 液压压片机	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX 插入套管	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - 径向流系统 II 型（颗粒暴露模块）	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - 径向流系统 II 型（洁净空气暴露模块）	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX 供应系统
流量控制器 0–30 mL/min（IQ-Flow）	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
流量控制器 0–1.5 L/min（EL-Flow）	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
滤膜（大尺寸）	Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany	LP-050	Munktell 无菌滤膜；颗粒截留效率 > 99.999%
滤膜（小尺寸）	Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany	9933-05-DQ	Balston 一次性滤膜
培养基泵	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	Ismatec IPC 高精度多通道分配器	数字式蠕动泵
无限 M200 Pro 多功能酶标仪	Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
真空泵	KNF, Freiburg, Germany	N86 KT.18
Vögtlin 质量流量控制器 0.2–10 L/min	TrigasFI GmbH	Vögtlin red-y compact 调节器，型号：GCR-C3SA-BA20
水浴锅	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline Staredition RE 104