本文介绍了一种基于96孔板中钼蓝反应的筛选方法，用于筛选来自Thermotoga maritima的膜结合型焦磷酸酶抑制剂。
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方法文章
筛选 Thermotoga maritima 膜结合型焦磷酸酶抑制剂
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
膜结合型焦磷酸酶（mPPases）是一类存在于细菌、古菌、植物以及原生生物寄生虫中的二聚体酶。这些蛋白可将焦磷酸裂解为两个正磷酸分子，并同时驱动质子和/或钠离子跨膜转运。由于动物和人体内不存在同源蛋白，mPPases 是设计潜在药物靶点的良好候选。本文介绍了一种利用钼蓝反应在96孔板系统中筛选 mPPase 抑制剂的详细实验方案。我们以嗜热菌 Thermotoga maritima 的膜结合型焦磷酸酶（TmPPase）作为模型酶。该方案操作简便、成本低廉，结果稳定且重复性好。从实验开始到完成吸光度测定，整个活性检测过程仅需约一小时。由于本实验产生的蓝色产物在较长时间内保持稳定，因此可在前一批样品完成后立即开始下一批检测，所有批次的吸光度可统一在后期一次性测定。该方案的缺点是需手动操作，可能较为耗时，并对移液技术和时间控制能力有较高要求。此外，本实验所用的亚砷酸盐-柠檬酸溶液含有剧毒的亚砷酸钠，操作时应采取必要的安全防护措施。
引言
大约25%的细胞总蛋白为膜蛋白，其中约60%是药物靶点1,2。膜结合型焦磷酸酶（mPPases）是一种潜在的药物靶点3，属于二聚体酶类，可通过将焦磷酸水解为两个正磷酸盐，驱动质子和/或钠离子跨膜转运4。mPPases存在于多种生物体中5，如细菌、古菌、植物和原生生物寄生虫，但人类和动物中不存在4。在原生生物寄生虫中，例如Plasmodium falciparum、Toxoplasma gondii和Trypanosoma brucei，mPPases对寄生虫的致病性至关重要6，若在这些寄生虫中敲除该蛋白的表达，则会导致其在外界碱性pH环境下无法维持细胞内pH稳态7。由于mPPases具有重要功能且在脊椎动物中无同源蛋白，因此可被视为治疗原生生物性疾病潜在的药物靶点3。
本研究中体外筛选mPPase抑制剂基于TmPPase模型系统。TmPPase是一种来自T. marit....
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方案
1. 蛋白质制备
注意：TmPPase 的表达与纯化方法已在其他文献中描述13。
- 配制10 mL重激活缓冲液，其中含有20 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）pH 6.5、3.5%（v/v）甘油、2 mM二硫苏糖醇（DTT）和0.05%十二烷基麦芽糖苷（DDM）。
- 配制10 mL反应混合液，其中含有200 mM Tris-Cl pH 8.0、8.0 mM MgCl2、333 mM KCl和67 mM NaCl。
注意：Mg2+用于螯合焦磷酸盐（mPPase的底物），K+可增强酶活性，因为TmPPase是一种依赖钾离子的膜结合型焦磷酸酶，而Na+则在TmPPase介导的钠离子转运过程中对酶活性具有必要作用。 - 制备30 mg/mL脂质体用于酶重激活。
- 将0.3 g大豆来源的L-α-磷脂酰胆碱加入10 mL含1 mM DTT的20 mM Tris-HCl pH 8.0溶液中。
- 将脂质体置于冰上，以1秒脉冲间隔超声处理1分钟，暂停1分钟，重复操作直至溶液变为透明黄色。
- 分装脂质体，液氮中速冻后于-80 °C保存备用。
- 进行酶的重激活。 <....
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结果
在本实验方案中，测试了八种化合物（1−8）（图2A），同时以焦磷酸酶常用抑制剂IDP作为阳性对照。每种化合物均在三个不同浓度（1 µM、5 µM 和 20 µM）下进行三复孔测试。筛选流程如图1所示，从样品与试剂准备开始，直至在860 nm处进行吸光度测定。
在本实验方案结束时，加入溶液A+B以及亚砷酸盐-柠檬酸盐后，由于磷酸根离子与钼酸盐形成复合物，溶液会呈现出稳定的蓝色，在709 nm和860 nm处具有最大吸收峰14，该现象可被观察到，并表明酶促反应的发生。在本实验中，我们采用860 nm处的吸光度来测定释放的Pi量，因为相较于709 nm处的吸光度，其检测限更低且灵敏度更高15。蓝色在室温孵育30分钟后完全显色，并至少在5小时内保持稳定14。该检测方法的灵敏度可达Pi浓度.......
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讨论
本文报道了一种基于Vidilaseris等人14方法的详细实验方案，用于在96孔板体系中简便筛选来自T. maritima的膜结合型焦磷酸酶抑制剂。该方法成本低廉，基于正磷酸盐与钼酸盐在酸性条件下生成12-磷钼酸，并被还原为具有明显蓝色的磷钼酸还原物12。相较于其他方法（如灵敏度更高的孔雀绿法16），本方法具有优势，因为在TmPPase复活所需的高磷脂浓度条件下，本方法不会产生干扰信号14。
筛选流程的工作流程如图1所示，整个过程可在1小时内完成。本方案针对TmPPase优化，其最适工作温度为71 °C，反应时间为5分钟。由于在此温度下反应混合物中的水会蒸发，因此使用粘性密封膜（裁剪至合适尺寸以覆盖排管）防止蒸发14，蒸发的水分可通过离心重新收集。选择5分钟的孵育时间，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了Jane和Aatos Erkko基金会以及英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，项目号BB/M021610）向Adrian Goldman提供的资助，芬兰科学院向Keni Vidilaseris（项目号308105）、Henri Xhaard（项目号310297）和Jari Yli-Kauhaluoma（项目号265481）提供的资助，以及赫尔辛基大学研究基金向Gustav Boije af Gennäs提供的资助。作者感谢Bernadette Gehl在项目期间提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 粘性密封膜 | Thermo Scientific | AB0558 | |
| 四水合七钼酸铵 | Merck | F1412481 636 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96孔多联培养皿 | Thermo Scientific | 130188 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Merck | 1167431000 | |
| 8联PCR管条（0.2 ml，无盖，120个） | Nippon genetics | FG-028 | |
| 十二烷基麦芽糖苷（DDM） | Melford | B2010-100G | |
| 乙醇 | Merck | 1009901001 | |
| 冰醋酸 | Merck | 1000631011 | |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| 亚氨基三磷酸钠盐 | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| 大豆卵磷脂来源的L-α-磷脂酰胆碱 | Sigma | 429415-100GM | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| 96孔PCR板（多联板） | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent（型号750） | Labsystems | ||
| 聚苯乙烯培养皿（尺寸150 mm × 15 mm） | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| 氯化钾 | Merck | 104936 | |
| Prism 6 软件 | GraphPad | ||
| QBT2 加热模块 | Grant Instruments | ||
| 偏亚砷酸钠 | Fisher Chemical | 12897692 | |
| 磷酸氢二钠（Pi） | Sigma | S0876-1KG | |
| 焦磷酸氢二钠 | Fluka | 71501-100G | |
| 二水合柠檬酸三钠 | Fluka | 71404-1KG |
参考文献
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8),....
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重印与许可
