本文介绍了一种基于96孔板中钼蓝反应的筛选方法，用于筛选来自Thermotoga maritima的膜结合型焦磷酸酶抑制剂。
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方法文章
筛选 Thermotoga maritima 膜结合型焦磷酸酶抑制剂
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
膜结合型焦磷酸酶（mPPases）是一类存在于细菌、古菌、植物以及原生生物寄生虫中的二聚体酶。这些蛋白可将焦磷酸裂解为两个正磷酸分子，并同时驱动质子和/或钠离子跨膜转运。由于动物和人体内不存在同源蛋白，mPPases 是设计潜在药物靶点的良好候选。本文介绍了一种利用钼蓝反应在96孔板系统中筛选 mPPase 抑制剂的详细实验方案。我们以嗜热菌 Thermotoga maritima 的膜结合型焦磷酸酶（TmPPase）作为模型酶。该方案操作简便、成本低廉，结果稳定且重复性好。从实验开始到完成吸光度测定，整个活性检测过程仅需约一小时。由于本实验产生的蓝色产物在较长时间内保持稳定，因此可在前一批样品完成后立即开始下一批检测，所有批次的吸光度可统一在后期一次性测定。该方案的缺点是需手动操作，可能较为耗时，并对移液技术和时间控制能力有较高要求。此外，本实验所用的亚砷酸盐-柠檬酸溶液含有剧毒的亚砷酸钠，操作时应采取必要的安全防护措施。
引言
大约25%的细胞总蛋白为膜蛋白，其中约60%是药物靶点1,2。膜结合型焦磷酸酶（mPPases）是一种潜在的药物靶点3，属于二聚体酶类，可通过将焦磷酸水解为两个正磷酸盐，驱动质子和/或钠离子跨膜转运4。mPPases存在于多种生物体中5，如细菌、古菌、植物和原生生物寄生虫，但人类和动物中不存在4。在原生生物寄生虫中，例如Plasmodium falciparum、Toxoplasma gondii和Trypanosoma brucei，mPPases对寄生虫的致病性至关重要6，若在这些寄生虫中敲除该蛋白的表达，则会导致其在外界碱性pH环境下无法维持细胞内pH稳态7。由于mPPases具有重要功能且在脊椎动物中无同源蛋白，因此可被视为治疗原生生物性疾病潜在的药物靶点3。
本研究中体外筛选mPPase抑制剂基于TmPPase模型系统。TmPPase是一种来自T. maritima的钠离子泵型、钾离子依赖性mPPase，其最适活性温度为71 °C8。该酶的优势包括易于表达与纯化、良好的热稳定性以及高比活性。TmPPase不仅与原生生物mPPase在催化残基的位置和身份上完全保守且具有高度相似性3,9，还与已解析的绿豆（Vigna radiata）10 mPPase结构高度相似。TmPPase在不同构象下的可用结构也为基于结构的药物设计实验（如虚拟筛选和从头设计）提供了便利。
本文报道了一种在96孔板中筛选TmPPase抑制剂的详细方案（图1）。该方案基于钼蓝比色法，最初由Fiske和Subbarow建立11。该方法的原理是在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸盐反应生成12-磷钼酸，随后被还原生成呈特征蓝色的磷钼酸复合物12。
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方案
1. 蛋白质制备
注意：TmPPase 的表达与纯化方法已在其他文献中描述13。
- 配制10 mL重激活缓冲液，其中含有20 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）pH 6.5、3.5%（v/v）甘油、2 mM二硫苏糖醇（DTT）和0.05%十二烷基麦芽糖苷（DDM）。
- 配制10 mL反应混合液，其中含有200 mM Tris-Cl pH 8.0、8.0 mM MgCl2、333 mM KCl和67 mM NaCl。
注意：Mg2+用于螯合焦磷酸盐（mPPase的底物），K+可增强酶活性，因为TmPPase是一种依赖钾离子的膜结合型焦磷酸酶，而Na+则在TmPPase介导的钠离子转运过程中对酶活性具有必要作用。 - 制备30 mg/mL脂质体用于酶重激活。
- 将0.3 g大豆来源的L-α-磷脂酰胆碱加入10 mL含1 mM DTT的20 mM Tris-HCl pH 8.0溶液中。
- 将脂质体置于冰上，以1秒脉冲间隔超声处理1分钟，暂停1分钟，重复操作直至溶液变为透明黄色。
- 分装脂质体，液氮中速冻后于-80 °C保存备用。
- 进行酶的重激活。
- 将40 µL脂质体溶液与22.5 µL 20% DDM混合。
- 在55 °C加热15分钟，随后冷却至室温。
- 加入36.5 µL重激活缓冲液，混匀，再加入1 µL浓缩蛋白（13 mg/mL），使终浓度达到0.13 mg/mL。
注意：蛋白通常在纯化后以10 µL分装冷冻保存，使用前置于冰上解冻。
- 取20 µL重激活后的酶液加入1,480 µL反应混合液中，轻轻混匀。
注意：重激活后的酶液应在使用前立即加入反应混合液中。
2. 化合物制备
- 根据化合物的可获得性，将化合物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成50−200 µL、25−100 mM的储备液。
注意：本实验所用的所有化合物（图2A）此前已有报道9。若化合物溶解度较低，可相应调整储备液浓度。 - 将每种化合物用水配制三种不同浓度。
注意：反应体系中的终浓度分别为：易溶化合物1、5和50微摩尔，难溶化合物1、5和20微摩尔。- 在微量离心管中，用蒸馏水将储备液稀释至1 mL，得到易溶化合物浓度为2 µM、10 µM和100 µM，或难溶化合物浓度为2 µM、10 µM和40 µM。
- 稀释后立即涡旋振荡化合物溶液，确保充分混匀。
- 使用浊度计检测化合物是否发生聚集。
注意：该实验在96孔板中进行，每种浓度设三个重复，浓度分别为1 µM、5 µM和20 µM，并以空白对照组进行归一化处理。- 使用多通道移液器将75 µL反应混合液加入各孔中。
- 向各孔中加入75 µL不同浓度的化合物溶液（空白对照孔加入75 µL水），并通过上下吹打5次混匀。
- 使用微孔板浊度计在300 V条件下测定各孔的浊度值。
3. 检测准备所需的试剂
- 配制亚砷酸盐-柠檬酸盐溶液。
- 称取 5 g 亚砷酸钠和 5 g 柠檬酸三钠二水合物。
警告：亚砷酸钠具有毒性，因此须使用适当的防护装备并特别小心操作。作为预防措施，在未阅读并理解所有必要的安全注意事项之前，请勿进行操作。仅可在通风橱中操作，以避免吸入该化合物或其溶液的粉尘/蒸气。若不慎吸入，请立即转移至空气新鲜处并寻求医疗救助。佩戴合适的化学防护护目镜、防护手套和防护服，避免吞食及眼睛或皮肤接触。若不慎吞咽，请立即联系中毒控制中心或医生。若接触皮肤或眼睛，请用大量清水冲洗，并立即就医。 - 溶于100 mL水中。
- 加入5 mL冰醋酸，混匀，加水至250 mL。
- 室温避光保存。
注意：该溶液可稳定保存一年以上。
- 称取 5 g 亚砷酸钠和 5 g 柠檬酸三钠二水合物。
- 配制溶液A和溶液B。
- 将10 mL冰冻的0.5 M HCl加入0.3 g抗坏血酸中，配制成溶液A。通过涡旋振荡溶解抗坏血酸。
- 对于溶液B，将1 mL冰水加入70 mg四水合七钼酸铵中，涡旋振荡至溶解。
注意：两种溶液均需在使用前置于冰上保存。为保证检测结果的一致性，两种溶液在冰上保存的时间最长不得超过一周。
- 制备磷酸盐（Pi标准品的浓度 0 µM, 62.5 µM, 250 µM 和 500 µM 用于校准。
- 添加 0 µL, 25 µL, 50 µL，以及 100 µL 5 mM Na2HPO4 二水合物至四个含有 370 µL 反应混合物的
- 加水至1 mL。
单个96孔板的活性检测实验
注意：参见图1以了解该检测方法的示意图工作流程。
- 将1 mL溶液B加入10 mL溶液A中，涡旋混匀，并将溶液置于冰上保存。
注意：该溶液应为透明黄色。溶液A + B在使用前需在冰上保存至少30分钟。但应在3小时内使用，因长期储存会导致溶液变质。 - 使用多通道移液器，将0 µM、62.5 µM、250 µM和500 µM的Pi标准品各40 µL以每组三个复孔的方式加入管条中。
注意：未添加Pi的反应混合物将作为空白对照。 - 使用多通道移液器向管条中加入25 µL化合物溶液。
注意：每种化合物设置三个不同浓度，每个浓度设三个复孔，足以初步估算半数最大抑制浓度（IC50）。如需更精确测定IC50，可使用八个不同浓度。对于未抑制的酶，用等体积水替代化合物溶液。阳性对照使用2.5 µM、25 µM和250 µM的咪唑二磷酸钠盐（IDP）。 - 使用多通道移液器向管条中加入15 µL mPPase溶液混合物（Pi标准品管除外）。
- 用粘性封口膜密封管条。将封口膜剪开，使每条管条相互分离。
- 将样品在71 °C预孵育5分钟。将各管条以20秒间隔依次放置于加热块上，以尽量减少后续步骤中的时间差异。
- 对每条管条，打开粘性封口膜，使用多通道移液器加入10 µL 2 mM焦磷酸二钠溶液，并上下吹打5次混匀。再次使用同一封口膜密封管条。
注意：此步骤最初可能难以在20秒内完成，但经过几次实验后会变得更容易。 - 在71 °C孵育5分钟。
- 将各管条以20秒间隔依次放置于冷却装置上。冷却10分钟，但在冷却5分钟后对每条管条短暂离心，以去除封口膜下方的冷凝水珠，然后放回冷却装置并移除封口膜。
注意：冷却装置可通过将一个96孔PCR板置于盛有水的聚苯乙烯培养皿（尺寸150 mm × 15 mm）中，冷冻至少1小时制得。实验开始前约5分钟应将装置从冰箱中取出。切勿在样品冷却前立即取出冷却装置，否则会导致反应混合物冻结，影响显色。 - 冷却10分钟后，向每条管条中加入60 µL溶液A + B，上下吹打5次混匀，并将管条继续置于冷却装置上10分钟。
- 加入90 µL亚砷酸盐-柠檬酸溶液，在室温下静置至少30分钟，以产生稳定的蓝色。
注意：由于亚砷酸钠具有毒性，所有含亚砷酸钠的溶液均需始终格外小心操作。因此，亚砷酸盐-柠檬酸溶液的添加应在通风橱中进行。 - 将各反应混合物180 µL分别转移至透明的96孔聚苯乙烯微孔板中。
- 使用微孔板分光光度计在860 nm波长下测定每孔的吸光度。
5. 结果分析
- 对每个样本的三个重复值取平均值，并计算 Pi 标准品。然后减去空白对照以消除背景信号。
- 通过绘制吸光度（A860) 值相对于P的量的变化曲线i 标准（nmol），并使用以下公式进行线性回归以获得趋势线函数：
- 根据上述线性回归公式计算酶促反应释放的磷酸盐量（nmol）。
- 使用以下公式计算比活性：
其中 nPi 是反应中释放的磷酸盐量（nmol）， t 是反应时间（min），以及 mTmPPase 是用于测定的纯化TmPPase的量（mg）。 - 使用以下公式计算每种抑制剂浓度下的活性百分比：
其中 SAi i含抑制剂样品的比活性 SA未 是未抑制样品的比活性。 - 计算 logIC50 （估算）和 IC50 （估算）采用以下公式，通过四参数剂量-反应曲线的非线性回归拟合进行计算：
其中 X 为浓度的对数值（ µM），Y 为活性（%），Top 和 Bottom 分别为与 Y 同单位的平台值（分别为 100% 和 0%），logIC50 与 X 具有相同的对数单位，而 HillSlope = 斜率因子或希尔斜率，无单位。
注意：软件（材料表) 用于拟合。使用浓度为 0.01 µM （而不是 0.00 µM由于未加抑制剂的样本中零的对数无定义，因此无法计算。
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结果
在本实验方案中，测试了八种化合物（1−8）（图2A），同时以焦磷酸酶常用抑制剂IDP作为阳性对照。每种化合物均在三个不同浓度（1 µM、5 µM 和 20 µM）下进行三复孔测试。筛选流程如图1所示，从样品与试剂准备开始，直至在860 nm处进行吸光度测定。
在本实验方案结束时，加入溶液A+B以及亚砷酸盐-柠檬酸盐后，由于磷酸根离子与钼酸盐形成复合物，溶液会呈现出稳定的蓝色，在709 nm和860 nm处具有最大吸收峰14，该现象可被观察到，并表明酶促反应的发生。在本实验中，我们采用860 nm处的吸光度来测定释放的Pi量，因为相较于709 nm处的吸光度，其检测限更低且灵敏度更高15。蓝色在室温孵育30分钟后完全显色，并至少在5小时内保持稳定14。该检测方法的灵敏度可达Pi浓度...
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讨论
本文报道了一种基于Vidilaseris等人14方法的详细实验方案，用于在96孔板体系中简便筛选来自T. maritima的膜结合型焦磷酸酶抑制剂。该方法成本低廉，基于正磷酸盐与钼酸盐在酸性条件下生成12-磷钼酸，并被还原为具有明显蓝色的磷钼酸还原物12。相较于其他方法（如灵敏度更高的孔雀绿法16），本方法具有优势，因为在TmPPase复活所需的高磷脂浓度条件下，本方法不会产生干扰信号14。
筛选流程的工作流程如图1所示，整个过程可在1小时内完成。本方案针对TmPPase优化，其最适工作温度为71 °C，反应时间为5分钟。由于在此温度下反应混合物中的水会蒸发，因此使用粘性密封膜（裁剪至合适尺寸以覆盖排管）防止蒸发14，蒸发的水分可通过离心重新收集。选择5分钟的孵育时间，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了Jane和Aatos Erkko基金会以及英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，项目号BB/M021610）向Adrian Goldman提供的资助，芬兰科学院向Keni Vidilaseris（项目号308105）、Henri Xhaard（项目号310297）和Jari Yli-Kauhaluoma（项目号265481）提供的资助，以及赫尔辛基大学研究基金向Gustav Boije af Gennäs提供的资助。作者感谢Bernadette Gehl在项目期间提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 粘性密封膜 | Thermo Scientific | AB0558 | |
| 四水合七钼酸铵 | Merck | F1412481 636 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96孔多联培养皿 | Thermo Scientific | 130188 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Merck | 1167431000 | |
| 8联PCR管条（0.2 ml，无盖，120个） | Nippon genetics | FG-028 | |
| 十二烷基麦芽糖苷（DDM） | Melford | B2010-100G | |
| 乙醇 | Merck | 1009901001 | |
| 冰醋酸 | Merck | 1000631011 | |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| 亚氨基三磷酸钠盐 | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| 大豆卵磷脂来源的L-α-磷脂酰胆碱 | Sigma | 429415-100GM | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| 96孔PCR板（多联板） | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent（型号750） | Labsystems | ||
| 聚苯乙烯培养皿（尺寸150 mm × 15 mm） | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| 氯化钾 | Merck | 104936 | |
| Prism 6 软件 | GraphPad | ||
| QBT2 加热模块 | Grant Instruments | ||
| 偏亚砷酸钠 | Fisher Chemical | 12897692 | |
| 磷酸氢二钠（Pi） | Sigma | S0876-1KG | |
| 焦磷酸氢二钠 | Fluka | 71501-100G | |
| 二水合柠檬酸三钠 | Fluka | 71404-1KG |
参考文献
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