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方法文章

利用高致病性H5N1和禽源H7N9病毒包膜糖蛋白制备高滴度感染性流感假病毒颗粒

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DOI：

10.3791/60663

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2020年1月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Hang Zhou Red Cross Hospital, 2Clinical Laboratory, Yuhang District Maternity and Child Health Care Hospital

本文内容

摘要

本方案描述了一种实验流程，用于制备携带两种甲型流感病毒株包膜糖蛋白的高滴度感染性病毒假颗粒（pp），并介绍如何测定其感染能力。该方案具有高度适应性，可广泛用于开发携带不同包膜糖蛋白的其他类型包膜病毒的假颗粒。

摘要

高致病性禽流感A病毒H5N1（HPAI H5N1）和H7N9偶尔直接传播给人类并导致死亡，这是严重的公共卫生问题，提示存在暴发流行的可能性。然而，我们对病毒的分子机制了解仍十分有限，有必要研究其包膜蛋白的生物学特性，以将其作为治疗靶点，并开发控制感染的策略。我们建立了一种稳定的病毒假型颗粒（pp）平台，用于研究禽流感病毒，包括对其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）包膜糖蛋白的功能分析、HA与NA的重配特性、受体、嗜性、中和抗体、诊断、感染性等，服务于药物开发与疫苗设计。本文描述了一种实验流程，用于构建携带两种流感A病毒株（HAPI H5N1和2013年禽源H7N9）包膜糖蛋白（HA、NA）的假型颗粒。这些假型颗粒的生成基于某些病毒（如小鼠白血病病毒，MLV）能够将外源包膜糖蛋白整合进假型颗粒的特性。此外，我们还详细说明了如何利用RT-qPCR对这些假型颗粒进行定量，以及根据HA和NA来源的不同，检测同源与异源病毒假型颗粒的感染性。该系统具有高度灵活性和可适应性，可用于构建携带能整合到任何其他类型包膜病毒中的包膜糖蛋白的病毒假型颗粒。因此，这一病毒颗粒平台可在多种科研研究中用于野生病毒的分析研究。

引言

病毒颗粒的任务是将其基因组从已感染的宿主细胞转运至未感染的宿主细胞，并以具备复制能力的形式将其递送至细胞质或细胞核中1。该过程首先由病毒与宿主细胞受体结合而启动，随后发生病毒颗粒与细胞膜的融合。对于包膜病毒（如流感病毒），刺突糖蛋白负责受体结合和膜融合1,2。病毒包膜糖蛋白（例如，热原质、抗原）参与多种重要特性与事件，包括病毒生命周期的起始（结合与融合）、病毒致病性、免疫原性、宿主细胞凋亡和细胞嗜性，以及细胞内吞途径、跨物种传播和基因重配1,3,4,5,6,7。对病毒包膜糖蛋白的研究将有助于我们理解病毒感染过程的诸多方面。假型病毒颗粒（pp），也称为假病毒或假颗粒，可通过假型化技术生成8,9,10。该技术已被用于构建多种病毒的假型颗粒，包括丙型肝炎病毒11,12、乙型肝炎病毒13、水疱性口炎病毒（VSV）14,15以及流感病毒16,17,18,19。该技术基于慢病毒或其他逆转录病毒的Gag-Pol蛋白。

通过共转染病毒包膜糖蛋白表达质粒、缺失包膜env基因的逆转录病毒包装质粒以及一个独立的报告基因质粒至假病毒（pp）生产细胞中，可利用三质粒系统获得假型病毒颗粒。逆转录病毒由其Gag蛋白组装，并从表达病毒包膜蛋白的感染细胞膜上出芽1。因此，可通过利用逆转录病毒Gag蛋白在表达流感病毒HA和NA的细胞膜上诱导出芽，从而获得高滴度的流感假型病毒颗粒（pps）。在我们之前的研究中，所有组合的HA和NA均具有功能，能够在病毒生命周期中执行其相应功能16,17,18,20,21。这些假型病毒颗粒可用于研究流感病毒的生物学特性，包括血凝活性、神经氨酸酶活性、HA受体结合趋向性以及感染性。由于HA和NA均为病毒生命周期中重要的表面功能蛋白，来源于不同流感毒株的HA与NA若发生错配，可在一定程度上模拟两者之间的基因重配现象。本文中，我们采用三质粒假型系统，将两种HA和两种NA（分别来源于高致病性禽流感H5N1毒株和H7N9毒株）进行组合，构建了八种类型的流感假型病毒颗粒。这八种pps包括两种天然匹配的pps（H5N1pp、H7N9pp）；两种错配的pps（(H5+N9)pp、(H7+N1)pp）；以及四种仅携带单一糖蛋白（HA或NA）的pps（H5pp、N1pp、H7pp、N9pp）。针对H5N1和H7N9等流感病毒的研究受到生物安全要求的限制，所有野生型流感病毒株的相关研究必须在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行。而假型病毒颗粒技术可在生物安全二级（BSL-2）条件下包装人工病毒颗粒。因此，假型病毒颗粒是一种更安全且有效的工具，可用于研究依赖于流感病毒两种主要糖蛋白——血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）——的病毒学过程。

本方案描述了通过三质粒共转染策略（见图1概览）生成这些假病毒颗粒（pps）的方法，以及如何对pps进行定量和感染性检测。假病毒颗粒的生产涉及三种质粒（图1）。其中，编码逆转录病毒Gag-Pol蛋白的gag-pol基因来自逆转录病毒包装试剂盒，被克隆至pcDNA 3.1质粒中，并命名为pcDNA-Gag-Pol。编码绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein）的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因则从pTRE-EGFP载体中克隆获得，插入pcDNA 3.1质粒，命名为pcDNA-GFP；在克隆过程中，通过引物引入了包装信号（ψ）序列。HA和NA基因分别被克隆至pVRC质粒中，命名为pVRC-HA和pVRC-NA。最后一种质粒编码融合蛋白，可根据需要替换为其他感兴趣的融合蛋白。我们的假病毒包装平台包含两种糖蛋白表达质粒：pVRC-HA和pVRC-NA，这可在生物安全二级（BSL-2）条件下简化不同病毒株之间重配的研究。

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方案

1. 第1天：细胞培养与接种

  1. 在60 mm培养皿中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素的杜尔贝科改良必需培养基（DMEM）（完全DMEM培养基，DCM），于37 °C、5%二氧化碳（CO2）培养箱中培养人胚胎肾（HEK）293T/17细胞，直至细胞融合度达到约80%。
    注意：建议使用低代次的HEK 293T/17细胞。
  2. 用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）小心洗涤细胞。
    注意：操作HEK 293T/17细胞时必须格外轻柔，因其容易脱落。
  3. 吸除PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液使细胞解离。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育不超过5分钟，直至细胞解离完成。
  4. 加入5 mL DCM培养基以终止胰蛋白酶消化作用。通过反复吹打数次，将细胞分散成单细胞悬液。
  5. 将细胞悬液转移至预冷的15 mL离心管中。在4 °C条件下，以250 × g离心5分钟收集细胞。
  6. 尽可能吸除上清液。用6 mL DCM培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。用DCM培养基将细胞稀释至1 × 106 个细胞/mL。
  7. 每孔加入1 mL细胞悬液，将细胞接种至6孔板中。轻轻拍打培养板使细胞分布均匀。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育过夜（14–16小时）。

2. 第2天：通过脂质体转染介导的四质粒共转染

  1. 在倒置光学显微镜下观察细胞形态和密度。理想情况下，转染时细胞融合度应约为85%。每孔更换为1 mL无血清DMEM培养基，然后将培养板放回培养箱中。
    注意：操作HEK 293T/17细胞时必须非常轻柔，因为这些细胞容易脱落。
  2. 对于每孔待转染的培养细胞，用150 µL低血清培养基将8 µL转染试剂稀释（试管1）。轻轻混匀，在室温（RT，约20 °C）孵育5分钟。
    注意：每个转染样品需准备两个1.5 mL微量离心管，编号为1和2。
  3. 在试管2中，将2.5 µg质粒DNA溶于150 µL低血清培养基中。
    注意：在试管2中，按表1所示稀释各质粒DNA。使用编码水疱性口炎病毒（VSV）G糖蛋白的质粒（质粒pLP-VSVG）作为阳性对照，因为VSV能够感染多种细胞。使用pcDNA-Gag-Pol和pcDNA-GFP质粒生成缺乏流感病毒包膜糖蛋白的阴性对照颗粒（Δenv pps）。
  4. 孵育5分钟后，将稀释后的DNA与稀释后的转染试剂混合。轻轻混匀，并在室温下再孵育15分钟。
  5. 将DNA-脂质复合物加入含有细胞和无血清培养基的对应孔中。通过前后轻轻摇动培养板进行混匀。
  6. 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育4–6小时后，吸去培养基，更换为2 mL DMEM。继续在37 °C、5% CO2培养箱中孵育36–48小时。
    注意：更换为无血清且不含抗生素的DMEM。在本实验方案中，可使用两种HA和两种NA生成八种类型的pps（见表1）。

3. 第3天：易感细胞接种

  1. 进行感染性检测时，将每种易感细胞以每孔 1 × 104 个细胞的密度接种于 96 孔板中。
    注意：本文使用两种靶细胞进行感染性检测：一种是来源于肺泡的人源细胞系（A549 细胞），另一种是马尔登·达比犬肾细胞（MDCK 细胞）。MDCK 细胞在流感研究中被广泛使用，可作为良好的对照。此步骤具有灵活性，可根据研究需求选用其他靶细胞系。
  2. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育过夜（14–16 小时）。

4. 第4天：假型病毒颗粒的收集、定量与感染性检测

  1. 假病毒颗粒的收集
    1. 观察培养基的颜色，理想情况下应为浅粉色或微橙色。使用倒置荧光生物显微镜在440–460 nm波长下观察细胞状态。
    2. 转染后36–48小时，将假病毒颗粒（pps）通过0.45 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜过滤器进行传代，以去除细胞碎片。
    3. 将假病毒颗粒分装为小体积等份。
    4. 于-80 °C保存假病毒颗粒。
      注意：此步骤可作为暂停点，但不建议暂停，因为假病毒颗粒的感染性在冻融后会显著下降。
  2. 假病毒颗粒的定量
    1. 取20 µL纯化的假病毒颗粒加入至1.5 mL无RNase的微量离心管中。
    2. 加入1 µL浓度为0.24 U/mL的苯甲酸酶核酸酶，在37 °C孵育1小时，以消除任何DNA和RNA污染。
      注意：目标RNA（通常为下调的巨细胞病毒CMV-GFP RNA）被包裹在假病毒颗粒内部，可避免被苯甲酸酶核酸酶降解。
    3. 将样品在-70 °C冷冻以灭活苯甲酸酶核酸酶。
    4. 加入2 µL蛋白酶K，在50 °C孵育30分钟以消化包膜蛋白并释放CMV-GFP RNA。随后在100 °C加热3分钟以灭活蛋白酶K。
    5. 使用通用探针一步法RT-qPCR试剂盒，在实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）仪上，采用正向引物5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3'、反向引物5'-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3'以及探针5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3'，对假病毒颗粒进行定量。在评估感染性之前，根据RNA拷贝数对假病毒颗粒进行归一化处理。
  3. 感染性检测
    1. 根据qRT-PCR数据，将每种假病毒颗粒稀释至4 × 105 拷贝/mL（假病毒颗粒归一化）。
    2. 向携带H7N9血凝素（HA）的假病毒颗粒中加入甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）-胰蛋白酶，使其终浓度为40 µg/mL。在37 °C孵育1小时，以形成其功能性亚基HA1和HA2。
      注意：携带H5的假病毒颗粒无需用TPCK-胰蛋白酶处理，因其HA1-HA2切割位点含有多个精氨酸和赖氨酸残基。该多碱性切割位点可被广泛存在的细胞蛋白酶切割。
    3. 将归一化后的假病毒颗粒与DMEM培养基（无血清）按1:1体积比混合。
    4. 将含有易感细胞的培养板移至生物安全柜中。
    5. 吸除上清液，并用0.1 mL预热的PBS洗涤细胞一次。
    6. 向一个孔中加入0.1 mL假病毒颗粒-DMEM混合液。对每种假病毒颗粒的感染性测试均设置三个复孔，分别接种于一种易感细胞系（详见图2）。
    7. 将96孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育4–6小时。
    8. 吸除上清液，更换为0.1 mL DCM培养基。
    9. 继续将96孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育24–36小时。

5. 第5天或第6天：感染性检测

  1. 将96孔板移至生物安全柜中。
  2. 吸除上清液，并用0.2 mL预热的PBS洗涤细胞1次。
  3. 移除PBS，加入0.1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。
  4. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育3分钟，直至细胞解离。
    注意：避免孵育超过5分钟，否则会导致细胞成团。
  5. 加入0.4 mL DCM以终止胰蛋白酶消化作用。
  6. 通过反复吹打数次，将细胞分散成单细胞悬液。
  7. 将细胞悬液转移至预冷的1.5 mL微量离心管中。
  8. 使用荧光激活细胞分选（FACS）检测GFP报告基因阳性细胞。
    注意：为确定GFP报告基因阳性靶细胞的比例，应使用对照样品（未处理的pps A549细胞或MDCK细胞）设置流式细胞仪门控参数，然后对每份样品的10,000个细胞进行计数，统计GFP阳性细胞比例。

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结果

根据上述通用实验流程，我们已生成了10种假病毒颗粒（pps），其中包括两种血凝素（HA）/神经氨酸酶（NA）组合、VSV-G糖蛋白或无包膜糖蛋白的假病毒颗粒（见表1）。其中7种具有感染性。携带无包膜糖蛋白或仅携带NA的假病毒颗粒在此未表现出任何感染性。流感假病毒颗粒的制备流程概述见图1。假病毒颗粒的透射电子显微镜图像（例如H5N1pp）见图3。这些假病毒颗粒感染性检测结果见图4。7种假病毒颗粒的感染性在每细胞20个基因组拷贝（GCP）[类似于感染复数（MOI）]条件下进行评估。在携带H5的假病毒颗粒组中，H5N1、(H5+N9)和H5在A549细胞系中的感染性分别为90.05 ± 4.05%、17.78 ± 1.58%和10.15 ± 2.85%，在MDCK细胞中分别为40.37 ± 4.92%、5.24 ± 1.32%和4.88 ± 0.27%。在携带H7的假病毒颗粒组中，H7N9、(H7+N1)和H7在A549细胞系中的感...

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讨论

在本实验方案中，我们描述了一种在生物安全二级（BSL-2）条件下制备流感病毒假病毒颗粒（pp）的方法。报告质粒pcDNA-GFP被整合到假病毒颗粒中，可用于通过流式细胞术（FACS）在感染性检测中定量假病毒颗粒。我们选择了两种易感细胞系，因为它们在流感病毒研究中被广泛使用。MDCK细胞可为这些研究中使用的各种永生化人源细胞提供良好的对照。

本方案基于逆转录病毒MLV，该病毒可携带GFP报告基因，并在细胞膜上产生出芽。该技术已广泛应用于流感病毒颗粒的包装4,22,23,24。其他一些系统则基于慢病毒HIV-1假型系统19,25,26或杆状病毒-昆...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了浙江省医药卫生科技计划（资助编号：2017KY538）、杭州市医药卫生科技计划（资助编号：OO20190070）、杭州市医学科技重点项目（资助编号：2014Z11）以及杭州市社会发展与科学研究自主应用项目（资助编号：20191203B134）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
苯佐那酶核酸酶Millipore70664有效降低黏度并从蛋白质溶液中去除核酸
透明平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板（96孔）Corning3599经处理以实现最佳细胞贴附
经伽马辐射灭菌，并经认证为无热原
每孔具有独立的字母数字编码以便识别
透明组织培养处理多孔板（6孔）Costar3516每孔具有独立的字母数字编码以便识别
经处理以实现最佳细胞贴附
经伽马辐照灭菌
杜尔贝科改良必需培养基（DMEM）Gibco11965092一种广泛使用的基础培养基，用于支持多种不同哺乳动物细胞的生长
胎牛血清ExcellFND500可为基本细胞培养、特殊研究及特定检测提供优异性能的胎牛血清
荧光激活细胞分选（FACS）Beckman Coultercytoflex
人肺泡腺癌A549细胞ATCCCRM-CCL-185
人胚胎肾（HEK）HEK-293T/17细胞ATCCCRL-11268一种通用型转染试剂，已被证实可高效转染最广泛的贴壁和悬浮细胞系
倒置荧光生物显微镜OlympusBX51-32P01-FLB3
倒置光学显微镜OlympusCKX31-12PHP
Lipofectamine 2000转染试剂Invitrogen11668019基于探针的快速、灵敏且精确的qPCR检测与靶标RNA定量方法。
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR试剂盒NEBE3006L可耐受高达14,000 RCF
无RNase/DNase，无热原
Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞ATCCCCL-34
MaxyClear Snaplock微量离心管（1.5 mL）AxygenMCT-150-C33 mm，经伽马射线灭菌
Millex-HV针头式滤器，0.45 µm，PVDFMilliporeSLHV033RS一种改良的最低必需培养基（MEM），可在不影响细胞生长速率或形态的前提下，将胎牛血清添加量至少减少50%。Opti-MEM I培养基也推荐与阳离子脂质转染试剂（如Lipofectamine试剂）联合使用。
Opti-MEM I减血清培养基Gibco11058021青霉素和链霉素用于预防细菌污染，因其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有协同抗菌作用。
青霉素-链霉素Gibco15140122最大RCF为12,500 ×g
温度范围为-80 °C至120 °C
无RNase/DNase
无菌
聚丙烯离心管（15 mL）Corning430791一种稳定且高活性的丝氨酸蛋白酶
蛋白酶KBeyotimeST532经处理以实现最佳细胞贴附
经伽马辐射灭菌，并经认证为无热原
组织培养处理培养皿（60 mm）Corning430166来自牛胰腺的胰蛋白酶
经TPCK处理，基本无盐，冻干粉末，≥10,000 BAEE单位/mg蛋白
TPCK-胰蛋白酶SigmaT1426该胰蛋白酶液体配方含有EDTA和酚红。Gibco胰蛋白酶-EDTA由胰蛋白酶粉末制成，该粉末为经辐照处理的来源于猪胰腺的蛋白酶混合物。由于其较强的消化能力，胰蛋白酶广泛用于细胞解离、常规细胞传代以及原代组织解离。所需胰蛋白酶浓度因细胞类型和实验需求而异。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Gibco25200056

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