本方案描述了一种实验流程，用于制备携带两种甲型流感病毒株包膜糖蛋白的高滴度感染性病毒假颗粒（pp），并介绍如何测定其感染能力。该方案具有高度适应性，可广泛用于开发携带不同包膜糖蛋白的其他类型包膜病毒的假颗粒。
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摘要
摘要
高致病性禽流感A病毒H5N1（HPAI H5N1）和H7N9偶尔直接传播给人类并导致死亡，这是严重的公共卫生问题，提示存在暴发流行的可能性。然而，我们对病毒的分子机制了解仍十分有限，有必要研究其包膜蛋白的生物学特性，以将其作为治疗靶点，并开发控制感染的策略。我们建立了一种稳定的病毒假型颗粒（pp）平台，用于研究禽流感病毒，包括对其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）包膜糖蛋白的功能分析、HA与NA的重配特性、受体、嗜性、中和抗体、诊断、感染性等，服务于药物开发与疫苗设计。本文描述了一种实验流程，用于构建携带两种流感A病毒株（HAPI H5N1和2013年禽源H7N9）包膜糖蛋白（HA、NA）的假型颗粒。这些假型颗粒的生成基于某些病毒（如小鼠白血病病毒，MLV）能够将外源包膜糖蛋白整合进假型颗粒的特性。此外，我们还详细说明了如何利用RT-qPCR对这些假型颗粒进行定量，以及根据HA和NA来源的不同，检测同源与异源病毒假型颗粒的感染性。该系统具有高度灵活性和可适应性，可用于构建携带能整合到任何其他类型包膜病毒中的包膜糖蛋白的病毒假型颗粒。因此，这一病毒颗粒平台可在多种科研研究中用于野生病毒的分析研究。
引言
病毒颗粒的任务是将其基因组从已感染的宿主细胞转运至未感染的宿主细胞，并以具备复制能力的形式将其递送至细胞质或细胞核中1。该过程首先由病毒与宿主细胞受体结合而启动，随后发生病毒颗粒与细胞膜的融合。对于包膜病毒（如流感病毒），刺突糖蛋白负责受体结合和膜融合1,2。病毒包膜糖蛋白（例如，热原质、抗原）参与多种重要特性与事件，包括病毒生命周期的起始（结合与融合）、病毒致病性、免疫原性、宿主细胞凋亡和细胞嗜性，以及细胞内吞途径、跨物种传播和基因重配1,3,4,5,6,7。对病毒包膜糖蛋白的研究将有助于我们理解病毒感染过程的诸多方面。假型病毒颗粒（pp），也称为假病毒或假颗粒，可通过假型化技术生成8,9,10。该技术已被用于构建多....
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方案
1. 第1天：细胞培养与接种
- 在60 mm培养皿中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素的杜尔贝科改良必需培养基（DMEM）（完全DMEM培养基，DCM），于37 °C、5%二氧化碳（CO2）培养箱中培养人胚胎肾（HEK）293T/17细胞，直至细胞融合度达到约80%。
注意：建议使用低代次的HEK 293T/17细胞。 - 用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）小心洗涤细胞。
注意：操作HEK 293T/17细胞时必须格外轻柔，因其容易脱落。 - 吸除PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液使细胞解离。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育不超过5分钟，直至细胞解离完成。
- 加入5 mL DCM培养基以终止胰蛋白酶消化作用。通过反复吹打数次，将细胞分散成单细胞悬液。
- 将细胞悬液转移至预冷的15 mL离心管中。在4 °C条件下，以250 × g离心5分钟收集细胞。
- 尽可能吸除上清液。用6 mL DCM培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。用DCM培养基将细胞稀释至1 × 106 个细胞/mL。
- 每孔加入1 mL细胞悬液，将细胞接种至6孔板中。轻轻拍打培养板使细胞分布均匀。将培养板置于37 °C、5% CO2
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结果
根据上述通用实验流程，我们已生成了10种假病毒颗粒（pps），其中包括两种血凝素（HA）/神经氨酸酶（NA）组合、VSV-G糖蛋白或无包膜糖蛋白的假病毒颗粒（见表1）。其中7种具有感染性。携带无包膜糖蛋白或仅携带NA的假病毒颗粒在此未表现出任何感染性。流感假病毒颗粒的制备流程概述见图1。假病毒颗粒的透射电子显微镜图像（例如H5N1pp）见图3。这些假病毒颗粒感染性检测结果见图4。7种假病毒颗粒的感染性在每细胞20个基因组拷贝（GCP）[类似于感染复数（MOI）]条件下进行评估。在携带H5的假病毒颗粒组中，H5N1、(H5+N9)和H5在A549细胞系中的感染性分别为90.05 ± 4.05%、17.78 ± 1.58%和10.15 ± 2.85%，在MDCK细胞中分别为40.37 ± 4.92%、5.24 ± 1.32%和4.88 ± 0.27%。在携带H7的假病毒颗粒组中，H7N9、(H7+N1)和H7在A549细胞系中的感.......
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讨论
在本实验方案中，我们描述了一种在生物安全二级（BSL-2）条件下制备流感病毒假病毒颗粒（pp）的方法。报告质粒pcDNA-GFP被整合到假病毒颗粒中，可用于通过流式细胞术（FACS）在感染性检测中定量假病毒颗粒。我们选择了两种易感细胞系，因为它们在流感病毒研究中被广泛使用。MDCK细胞可为这些研究中使用的各种永生化人源细胞提供良好的对照。
本方案基于逆转录病毒MLV，该病毒可携带GFP报告基因，并在细胞膜上产生出芽。该技术已广泛应用于流感病毒颗粒的包装4,22,23,24。其他一些系统则基于慢病毒HIV-1假型系统19,25,26或杆状病毒-昆.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了浙江省医药卫生科技计划（资助编号：2017KY538）、杭州市医药卫生科技计划（资助编号：OO20190070）、杭州市医学科技重点项目（资助编号：2014Z11）以及杭州市社会发展与科学研究自主应用项目（资助编号：20191203B134）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 苯佐那酶核酸酶 | Millipore | 70664 | 有效降低黏度并从蛋白质溶液中去除核酸 |
| 透明平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板（96孔） | Corning | 3599 | 经处理以实现最佳细胞贴附 经伽马辐射灭菌，并经认证为无热原 每孔具有独立的字母数字编码以便识别 |
| 透明组织培养处理多孔板（6孔） | Costar | 3516 | 每孔具有独立的字母数字编码以便识别 经处理以实现最佳细胞贴附 经伽马辐照灭菌 |
| 杜尔贝科改良必需培养基（DMEM） | Gibco | 11965092 | 一种广泛使用的基础培养基，用于支持多种不同哺乳动物细胞的生长 |
| 胎牛血清 | Excell | FND500 | 可为基本细胞培养、特殊研究及特定检测提供优异性能的胎牛血清 |
| 荧光激活细胞分选（FACS） | Beckman Coulter | cytoflex | |
| 人肺泡腺癌A549细胞 | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| 人胚胎肾（HEK）HEK-293T/17细胞 | ATCC | CRL-11268 | 一种通用型转染试剂，已被证实可高效转染最广泛的贴壁和悬浮细胞系 |
| 倒置荧光生物显微镜 | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| 倒置光学显微镜 | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 | 基于探针的快速、灵敏且精确的qPCR检测与靶标RNA定量方法。 |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR试剂盒 | NEB | E3006L | 可耐受高达14,000 RCF 无RNase/DNase，无热原 |
| Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞 | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock微量离心管（1.5 mL） | Axygen | MCT-150-C | 33 mm，经伽马射线灭菌 |
| Millex-HV针头式滤器，0.45 µm，PVDF | Millipore | SLHV033RS | 一种改良的最低必需培养基（MEM），可在不影响细胞生长速率或形态的前提下，将胎牛血清添加量至少减少50%。Opti-MEM I培养基也推荐与阳离子脂质转染试剂（如Lipofectamine试剂）联合使用。 |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Gibco | 11058021 | 青霉素和链霉素用于预防细菌污染，因其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有协同抗菌作用。 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 最大RCF为12,500 ×g 温度范围为-80 °C至120 °C 无RNase/DNase 无菌 |
| 聚丙烯离心管（15 mL） | Corning | 430791 | 一种稳定且高活性的丝氨酸蛋白酶 |
| 蛋白酶K | Beyotime | ST532 | 经处理以实现最佳细胞贴附 经伽马辐射灭菌，并经认证为无热原 |
| 组织培养处理培养皿（60 mm） | Corning | 430166 | 来自牛胰腺的胰蛋白酶 经TPCK处理，基本无盐，冻干粉末，≥10,000 BAEE单位/mg蛋白 |
| TPCK-胰蛋白酶 | Sigma | T1426 | 该胰蛋白酶液体配方含有EDTA和酚红。Gibco胰蛋白酶-EDTA由胰蛋白酶粉末制成，该粉末为经辐照处理的来源于猪胰腺的蛋白酶混合物。由于其较强的消化能力，胰蛋白酶广泛用于细胞解离、常规细胞传代以及原代组织解离。所需胰蛋白酶浓度因细胞类型和实验需求而异。 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | Gibco | 25200056 |
参考文献
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.....
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