本方案描述了冷冻APEX（cryoAPEX）方法，该方法可在超微结构得到最佳保存的细胞内，通过透射电子显微镜对带有APEX2标签的膜蛋白进行定位。
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本文内容
摘要
摘要
信号转导和膜运输等关键细胞事件依赖于蛋白质在细胞区室中的正确定位。因此，了解蛋白质精确的亚细胞定位对于回答许多生物学问题至关重要。长期以来，寻找一种能够有效标记蛋白质定位、同时实现良好细胞保存和染色的可靠标记方法一直具有挑战性。近年来，电子显微镜（EM）成像技术的进步推动了多种方法和策略的发展，以提高细胞结构的保存效果并标记目标蛋白质。一种相对较新的基于过氧化物酶的遗传标签 APEX2，已成为可克隆的电子显微镜活性标签中的领先技术。与此同时，透射电子显微镜（TEM）样品制备技术近年来也取得了进展，尤其是通过高压冷冻（HPF）实现的冷冻固定，以及通过冷冻置换（FS）实现的低温脱水与染色。HPF 和 FS 能够为 TEM 成像提供优异的细胞超微结构保存效果，其质量仅次于对玻璃态样品的直接冷冻成像。本文介绍了一种名为 cryoAPEX 的实验方案，该方法结合了 APEX2 标签与 HPF 和 FS 技术。在此方案中，目标蛋白质首先被标记 APEX2，随后进行化学固定和过氧化物酶反应。与传统的室温染色和酒精脱水不同，样品通过冷冻固定，并在低温下经由冷冻置换完成脱水和染色。利用 cryoAPEX 方法，不仅可以在亚细胞区室中识别目标蛋白质，还能在结构完整保留的膜系统内解析其拓扑信息。我们证明，该方法具有足够高的分辨率，能够解析蛋白质在细胞器腔内的分布模式，并区分某一细胞器内蛋白质的区室化定位，即使该细胞器邻近其他未标记的细胞器。此外，cryoAPEX 操作流程简便，适用于培养在组织培养条件下的细胞，其技术难度不高于常规的冷冻固定与冷冻置换方法。cryoAPEX 可广泛应用于任何可通过基因标记的膜蛋白的 TEM 分析。
引言
生物学研究通常涉及解析蛋白质在细胞和细胞器内的亚细胞定位问题。免疫荧光显微镜可提供蛋白质定位的低分辨率图像，而近年来超分辨率成像技术的进步正在不断突破荧光标记蛋白质的分辨率极限1,2,3。然而，电子显微镜（EM）仍是成像细胞超微结构的高分辨率“金标准”，尽管蛋白质标记仍具挑战性。
历史上，多种电子显微镜（EM）方法已被用于研究蛋白质的超微结构定位问题。其中最常用的方法之一是免疫电子显微镜技术（IEM），该技术利用抗原特异性的初级抗体来检测目标蛋白。EM信号通过使用与电子致密颗粒结合的二抗产生，最常见的是胶体金4,5。 alternatively，也可使用与酶（如辣根过氧化物酶，HRP）偶联的抗体来生成电子致密沉淀6,7,8。IEM主要有两种方法，称为包埋前标记和包埋后标记。在包埋前IEM中，抗体直接引入细胞，这需要轻微固定并通透细胞9....
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方案
1. 细胞培养与转染
- 将 HEK-293T 细胞接种于直径 60 mm 或更大的组织培养皿中，在 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中培养至 60%–90% 汇合度。
- 使用转染试剂（见材料表），按照生产商说明书将 APEX2 标记的哺乳动物表达质粒转染细胞。
- 转染后 12–15 小时，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，再用 PBS 轻柔冲洗使细胞脱离培养皿。若特定细胞类型需要，可使用胰酶等解离试剂。在 500 x g 条件下离心 5 分钟，形成细胞沉淀。
2. 化学固定与过氧化物酶反应
- 小心移除上清液，并将沉淀物重悬于 2 mL 含 2% 戊二醛（v/v）的 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 7.4）中，室温下操作。将样品置于冰上，孵育 30 分钟。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，收集沉淀物。从此时起至步骤 2.3.3，所有样品和溶液均需保持在冰上，离心操作也需在 4 °C 下进行。
注意：戊二醛和含砷的柠檬酸钠缓冲液均有毒性，操作时应遵循适当的安全规程并佩戴个人防护装备。含有戊二醛和/或柠檬酸钠缓冲液的废液应作为危险化学废物处理。 - 用 2 mL 的 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液洗涤沉淀物 3 次，每次 ....
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结果
为了比较使用冷冻APEX（cryoAPEX）方法与传统固定和脱水方法在超微结构保存方面的效果，我们制备了样品，其中内质网膜（ERM；ER membrane）肽段被标记上APEX2，并转染至HEK-293T细胞中。ERM-APEX2定位于内质网的胞质面，并将内质网结构重塑为形态上独特的结构，称为有序光滑内质网（organized smooth ER, OSER）34,42,43。OSER的形态包含光滑、平行且紧密堆叠的膜区域，是用于比较超微结构保存效果的理想区域。采用传统APEX方法制备的样品中，OSER结构显示出清晰的标记信号（图2A–D）。在高倍镜下观察时，堆叠的膜呈现皱褶状，同心膜密度之间存在不均匀的间隙，表明膜结构保存不良并发生了脂质提取（图2D）。而通过cry.......
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讨论
本文介绍的冷冻APEX技术提供了一种在细胞环境中表征膜蛋白定位的可靠方法。该方法不仅利用基因编码的APEX2标签实现对目标蛋白的精确定位，还通过冷冻固定和低温脱水技术，实现了对周围细胞超微结构的优良保存与染色。综合而言，这些技术结合成为在亚细胞背景下高精度定位蛋白的有力工具。
该方法进步的关键在于，传统透射电镜（TEM）制备过程中超微结构的损失主要源于脱水步骤，而非固定步骤40。此前人们认为，基于过氧化物酶的方法与高压冷冻/冷冻替代（HPF/FS）技术不兼容，因为过氧化物酶反应前需要进行化学固定。为克服这一限制，近期开发出一种名为CryoCHEM的方案，该方案首先对样品进行冷冻固定，随后进行再水化并实施过氧化物酶反应49。该方法在显著改善样品染色和结构保存的同时，实现了优异的靶标定位效果。该技术已被证明适用于组织样品，以及需要进行荧光显微镜与电子显微镜关联成像的情况。与CryoCHEM并行发展的是我们的方法，该方法将戊二醛固定与高压冷冻和冷冻替代技术相结合。CryoAPEX提供了一种简化.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本方案源自 Sengupta 等人发表于《细胞科学杂志》（Journal of Cell Science）的研究，132 (6), jcs222315 (2019)48。本研究获得了美国国立卫生研究院资助项目 R01GM10092（授予 S.M.）和 AI081077（授予 R.V.S.）、印第安纳临床与转化科学研究所资助项目 CTSI-106564（授予 S.M.）以及普渡大学炎症、免疫与传染病研究所资助项目 PI4D-209263（授予 S.M.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物 | Sigma-Aldrich | D5637-1G | |
| 丙酮（玻璃蒸馏） | Electron Microscopy Sciences | 10016 | |
| 烧杯；塑料，一次性，120 cc | Electron Microscopy Sciences | 60952 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| 冷冻储存管，2 mL | VWR | 82050-168 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Corning | 10-017-CV | |
| Durcupan ACM Fluka，单组分 A，M 型环氧树脂 | Sigma-Aldrich | 44611-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka，单组分 B，固化剂 964 | Sigma-Aldrich | 44612-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka，单组分 C，促进剂 960（DY 060） | Sigma-Aldrich | 44613-100ML | |
| Durcupan ACM Fluka，单组分 D | Sigma-Aldrich | 44614-100ML | |
| 包埋模具，标准平面型，14 mm × 5 mm × 6 mm | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| 包埋模具，标准平面型，14 mm × 5 mm × 4 mm | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| 胎牛血清；Nu-Serum IV 生长培养基添加剂 | Corning | 355104 | |
| 玻璃刀舟，6.4 mm | Electron Microscopy Sciences | 71008 | |
| 玻璃刀制备仪 | Leica Microsystems | EM KMR3 | |
| 戊二醛 10% 水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| HEK 293 细胞 | ATCC | CRL-1573 | |
| 配备快速转移系统的高压冷冻仪 | Leica Microsystems | EM PACT2 | 已归档产品，已被 Leica EM ICE 取代 |
| 过氧化氢 30% 溶液 | Fisher Scientific | 50-266-27 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | ThermoFisher Scientific | L3000015 | |
| EM PACT2 膜载体，1.5 mm × 0.1 mm | Mager Scientific | 16707898 | |
| 四氧化锇，晶体 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）20X，超纯级 | VWR | 97062-950 | |
| AFS/AFS2 用塑料胶囊，5 mm × 15 mm | Mager Scientific | 16702738 | |
| 载网（Slot grids），2 × 1 mm 铜网，带 Formvar 支持膜 | Electron Microscopy Sciences | FF2010-Cu | |
| 二甲胂酸钠缓冲液，0.2 M，pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 102090-962 | |
| 氢氧化钠，颗粒，500 g（ACS 级） | Avantor Macron Fine Chemicals | 7708-10 | |
| 单宁酸 | Electron Microscopy Sciences | 21710 | |
| 组织培养皿，聚苯乙烯，无菌，Corning，100 mm | VWR | 25382-166 | |
| 超薄玻璃刀条 | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 超薄切片机 | Leica Microsystems | EM UC7 | |
| 醋酸铀酰二水合物 | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
参考文献
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies.
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重印与许可
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