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方法文章

非人灵长类胰岛氧耗分析

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DOI：

10.3791/60696

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2019年12月18日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 2Agilent Technologies, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 4Department of Veterans Affairs Tennessee Valley, 5Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

本文内容

摘要

本方案展示了非人灵长类动物胰岛中氧气消耗量的准确且可重复的测量方法。胰岛加样技术及微孔板的包被为其他类型培养类球体的呼吸作用高效测量提供了框架。

摘要

测量细胞球状簇中的氧气消耗量，例如 离体 胰岛，历来具有挑战性。我们展示了利用专为球形细胞团耗氧量检测设计的96孔微孔板来测定胰岛耗氧量的方法。在该检测中，于实验前一天对球形细胞团微孔板涂覆细胞和组织黏附剂。我们使用少量黏附剂溶液，以促进胰岛仅黏附于孔底。在实验当天，采用特定技术将15个胰岛直接加载至每孔底部，以确保胰岛位置优化并实现耗氧量的准确测量。在非人灵长类动物胰岛中，通过药物学手段检测线粒体呼吸的多个方面，包括ATP依赖性呼吸、最大呼吸和质子泄漏。该方法仅需每孔少量胰岛即可获得稳定且可重复的结果。理论上，该方法可适用于任何大小相似的培养球形细胞团。

引言

为了维持正常的血糖水平，胰腺β细胞必须感知葡萄糖浓度的升高，并相应地分泌胰岛素。胰岛素分泌与葡萄糖水平的耦联直接依赖于葡萄糖代谢以及线粒体氧化磷酸化所产生的ATP。因此，线粒体在刺激-分泌耦联中发挥着关键作用1。评估β细胞的线粒体功能可以揭示导致胰岛素分泌受损的缺陷。胰腺α细胞分泌胰高血糖素也与线粒体功能密切相关2。尽管永生化的胰岛细胞系在某些类型的检测中已被证明具有实用性，但这些细胞的生理特性并不能准确再现完整胰岛的功能，这一点可通过胰高血糖素在完整胰岛中对胰岛素分泌的增强作用3,4，以及胰岛素/生长抑素对胰高血糖素分泌的抑制作用5,6得以说明。这表明有必要使用完整、未损伤的胰岛来测量耗氧量。

胰岛细胞呼吸测定技术随着时间不断发展，从使用氧敏感型荧光染料7，发展到采用可直接测量耗氧量的固态传感器8。最初为单层贴壁细胞设计的常用细胞培养板系统，在用于胰岛时被证明效果不佳。由于胰岛在自然状态下不贴附于孔壁，容易被推至培养孔边缘，导致耗氧量测量结果不准确9。为解决这一问题，已开发出带有中央凹陷结构的特殊24孔板，可将胰岛限制在中心区域9。然而，24孔板系统受限于每孔需要大量胰岛（每孔50–80个），以及可同时检测的实验条件数量有限10。近年来，专为球状体细胞外通量分析设计的96孔微孔板的出现克服了这些限制，使得每孔仅需20个或更少的胰岛即可完成呼吸功能测定10。

在此，我们展示了利用该系统测量日本猕猴（Macaca fuscata）胰岛的耗氧量，该动物模型的胰岛生物学特性与人类相似11,12。在本实验方案中，每孔分析15个猕猴胰岛。据我们经验，每孔15个胰岛相比更少数量能产生更高的基础耗氧率，并且在药物干预下呼吸作用的激活与抑制反应更为显著。我们重点介绍了实验前的准备工作、将胰岛稳定加载至各孔中心位置的有效方法，以及在实施该实验过程中常见的挑战。

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方案

1. 实验运行前一天对微孔板和传感器盒的准备

胰岛取自三岁的日本猕猴，方法如前所述13。该方法与从尸体供体中分离人胰岛的方法非常相似，但不同于小鼠胰岛的分离方法；在小鼠中，通常在动物镇静状态下、器官摘除前用胶原酶溶液膨胀胰腺。胰岛的获取操作严格遵循俄勒冈国家灵长类研究中心（ONPRC）和俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南，并已获得ONPRC IACUC的批准。ONPRC遵守美国农业部（USDA）执行的《动物福利法和条例》，并遵循美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》中规定的公共卫生服务政策，对实验动物实施人道护理和使用。

  1. 类球体微孔板的准备
    1. 配制 3 mL 浓度为 0.1 M 的碳酸氢钠溶液。使用 0.45 µm 滤器（材料表）对该溶液进行过滤除菌。
    2. 在细胞培养超净台中，将 200 µL 细胞和组织粘附剂（材料表）加入 2.8 mL 0.1 M 碳酸氢钠溶液中。然后将 20 µL 该混合液加入 96 孔类球体微孔板（材料表）每个孔的底部。确保移液枪头中无气泡，并仅使孔底被覆盖。微孔板的包被可防止在检测过程中加入药物并混匀时胰岛沿孔壁上移。
      注意：仅需包被检测中实际用于胰岛的孔数即可。若仅使用少数孔，可相应减少细胞粘附剂溶液的用量。本检测所用的细胞粘附剂是一种从海洋贻贝中提取的配方蛋白溶液。或者，也可使用 20 µL 浓度为 100 µg/mL 的多聚-L-赖氨酸对微孔板孔进行包被。
    3. 将微孔板置于 37 °C、无 CO2 的培养箱中孵育 1 小时。
    4. 在无菌环境下，用多通道移液器吸除微孔板中的细胞粘附剂溶液。每孔用 400 µL 37 °C 的无菌水清洗两次。静置使其自然干燥。
    5. 30–40 分钟后，盖上盖子，并于 4 °C 过夜保存。
  2. 传感器盒的水化
    1. 在无菌环境下打开传感器盒包装（材料表），取出内容物。将传感器盒倒置放置在辅助板旁边。
    2. 向辅助板的每个孔中加入 200 µL 无菌水，然后将传感器盒重新放入辅助板中。将组装好的传感器盒与辅助板一起置于 37 °C、无 CO2 的培养箱中过夜。
  3. 校准液的配制
    1. 将 25 mL 校准液（材料表）分装至一个 50 mL 锥形管中。将该管置于 37 °C、无 CO2 的培养箱中过夜。

2. 检测当天的培养基制备、胰岛加载及传感器盒加载方案

  1. 培养基的制备
    1. 向48.5 mL基础培养基（最低必需培养基DMEM，参见材料表）中，分别加入500 µL的1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨酰胺。此外，加入496 µL的200 mg/mL葡萄糖（培养基中葡萄糖的终浓度为5.5 mM）。
      注意：本实验中基础葡萄糖浓度保持恒定。然而，葡萄糖也可用于刺激呼吸作用，作为下文所述药理学干预的补充10。
    2. 确认pH值为7.4 ± 0.1，必要时进行调节。
  2. 传感器微板的准备
    1. 从培养箱中取出传感器微板，移除传感器盖，倒掉孔中的水。向每个孔中加入200 µL预热的校准液，并重新盖上传感器微板盖。
    2. 将传感器微板放回培养箱中约1小时（或直至使用前）。
  3. 线粒体应激实验药物的准备
    1. 打开应激测试试剂盒（材料表），取出内容物。按以下方法配制寡霉素（Oligomycin）、羰基氰化-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）以及鱼藤酮/抗霉素A（Rotenone/Antimycin A, AA）的储备液和工作液。
      1. 寡霉素：向管中加入630 µL已配制的培养基，制成100 µM储备液。然后用培养基稀释至45 µM，得到加药口浓度（注射后孔内终浓度为4.5 µM）
      2. FCCP：向管中加入720 µL已配制的培养基，制成100 µM储备液。然后用培养基稀释至10 µM，得到加药口浓度（孔内终浓度为1 µM）
        注意：不应在培养基中添加BSA和/或FBS，因为这可能影响线粒体解偶联剂的作用14。
      3. 鱼藤酮/AA：向管中加入540 µL已配制的培养基，制成50 µM储备液。然后用培养基稀释至25 µM，得到加药口浓度（孔内终浓度为2.5 µM）
        注意：上述浓度在我们实验中已获得稳定结果。额外添加FCCP并未进一步增加呼吸作用。然而，药物浓度可能需要根据胰岛大小进行调整，尤其是不同物种的胰岛或非胰岛类球状体。作为参考，非人灵长类动物胰岛的平均直径约为150 µm15。
  4. 球状体培养板的准备及胰岛转移
    1. 手动挑选胰岛，将其转移至含有已配制培养基的60 mm × 15 mm细胞培养皿中，以获得接近100%的纯度。
      注意：胰岛应呈圆形，边界清晰，且比外分泌组织杂质更致密。避免选择外观受损或松散的胰岛。本实验中未直接测量胰岛大小，但我们尽量为每个孔和样本挑选大小相近的胰岛。
    2. 使用多通道移液器向球状体微孔板的每个孔中加入175 µL已配制的培养基。
    3. 将P20移液器调至15 µL，从细胞培养皿中吸取15个胰岛。胰岛在移液器吸头中应肉眼可见。
    4. 将胰岛转移至球状体微孔板时，将移液器吸头降至孔底，略微上提，缓慢排出极小体积（约5 µL）。确认所有胰岛已离开吸头。每个孔应加入15个胰岛。偶尔在显微镜下检查球状体微孔板，以确认胰岛位于各孔底部而非附着在孔壁上。
      注意：避免在四个角落的孔中加入胰岛。实验过程中塑料边缘可能发生氧气和pH的扩散，而四个角落的孔中该现象更为显著。
    5. 将所有胰岛转移至球状体微孔板后，将微孔板置于37 °C、无CO2的培养箱中孵育，同时完成以下步骤。
  5. 加载传感器微板并运行实验
    1. 从培养箱中取出传感器微板。每个孔的A-C加药口必须加载药物或培养基。含胰岛的孔及四个角落的孔应加载药物；不含胰岛的非角落孔应加载培养基。D口可保持空置。向每个传感器的A口（左上）加入20 µL寡霉素或培养基；向B口（右上）加入22 µL FCCP或培养基；向C口（左下）加入25 µL鱼藤酮/AA或培养基。
    2. 设置细胞外通量分析仪的实验程序：30分钟基础呼吸期（5个循环，每个循环3分钟混合、3分钟检测）、42分钟寡霉素检测期（7个循环，每个循环3分钟混合、3分钟检测）、30分钟FCCP期（5个循环，每个循环3分钟混合、3分钟检测）以及30分钟鱼藤酮/AA期（5个循环，每个循环3分钟混合、3分钟检测）。
    3. 运行实验，并按照屏幕提示完成传感器校准及微孔板插入操作。

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结果

将胰岛加载至微孔板时，应使用15 µL培养基吸取15个胰岛，如图1A所示。数秒内，胰岛会自然沉降至移液枪头底部。随后，将枪头降至孔底，再略微上提枪头，连同胰岛一起缓慢排出少量液体（约5 µL）。该技术可确保胰岛一致地定位在微孔板孔底（图1B），从而实现准确的耗氧量测定。

图2 显示了整个实验过程中每个孔中氧气消耗量的代表性结果。该特定实验展示了当加样操作不当，导致大量胰岛附着在孔壁侧面而非沉降至孔底时可能出现的情况。这种情况可能是因为在胰岛已被移液至孔中后，又向孔内加入了过多培养基所致。额外培养基的液流会将胰岛从孔底冲起。一旦发生这种情况，基础氧气消耗水平将非常低，且该孔对FCCP几乎无反应或完全无反应。

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讨论

以往对胰岛耗氧量的研究受到胰岛球形结构、难以贴附于培养表面以及每个孔所需胰岛数量较多等因素的限制。在本实验方案中，我们重点介绍了采用96孔球形微孔板在少量胰岛条件下准确测定胰岛耗氧量的有效性，并展示了一种在技术上可行且结果稳定的胰岛操作与加样技术。

为了使胰岛在检测过程中能够贴附于微孔板底部，并在混合步骤中保持稳定，需在检测前一天用细胞黏附溶液包被96孔微孔板。尽管这一操作通常是有益的，但如果胰岛加样不当，则容易黏附在孔壁侧面而非底部，从而影响甚至无法进行准确测量。为避免此问题，我们建议仅使用极少量的黏附溶液进行包被，每孔仅20 µL。此外，我们所展示的移液技术可确保胰岛被准确加载至孔底，而不会因额外培养基的流动将其推至孔壁侧边。

96孔球状体微孔板克服了以往测量胰岛氧消耗率的局限性，包括所需胰岛数量较多以及可同时检测的实验条件有限等问题。事实上，最近一项研究10已证明该系统可在每个孔中使用单个人胰岛进行检测。然而，使用单个胰岛测量氧消耗率时，基础氧消耗值非常低，仅在体积最大的胰...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢范德堡高通量筛选核心设施提供设备使用支持，安捷伦生物技术公司，保罗·基维特博士（俄勒冈健康与科学大学）在非人灵长类动物胰岛分离方面的帮助，以及范德堡大学埃里克·多纳休对图1提供的协助。J.M.E. 的研究得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助号 T32GM007347 的支持。M.G. 的研究得到了美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（R24DK090964-06）以及美国退伍军人事务部（BX003744）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养皿，60 mm × 15 mm 型Corning430166
Cell-Tak 细胞和组织粘附剂Corning354240
锥形管，50 mLFalcon352070
无水葡萄糖Fisher ScientificBP350-1用于配制葡萄糖溶液（200 mg/mL），经无菌过滤
一次性储液槽（无菌），25 mLVistalab3054-1033用于多通道移液器加样
EZFlow 无菌 0.45 μm PES 注射式滤器，13 mmFoxx Life Sciences371-3115-OEM
L-谷氨酰胺Gibco25030-081200 mM（100倍浓缩液）
多通道移液器吸头ThermoFisher Scientific94410810
多通道移液器，15–1250 μLThermoFisher Scientific4672100BT推荐使用
P20、P200 和 P1000 移液器Eppendorf2231000602
pH 探针Hanna InstrumentsHI2210-01
移液器吸头，20 μL、200 μL、1000 μLOlympus24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF 基础培养基Agilent103334-100
Seahorse XF 细胞线粒体应激测试试剂盒Agilent103015-100包含寡霉素（Oligomycin）、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A（Rotenone/Antimycin A）
Seahorse XFe96 分析仪AgilentS7800B包含配备 37 °C 非 CO₂ 培养箱的预处理工作站
Seahorse XFe96 类球体检测微孔板套装（Mini）Agilent102905-100包含传感器微孔板、类球体微孔板和校准液
碳酸氢钠Fisher ScientificBP328-500
丙酮酸钠Gibco11360-070100 mM（100倍浓缩液）
体视显微镜OlympusSZX9
注射器（无菌），5 mLBD309603用于无菌过滤
水（无菌）SigmaW3500-500mL

参考文献

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