本方案展示了非人灵长类动物胰岛中氧气消耗量的准确且可重复的测量方法。胰岛加样技术及微孔板的包被为其他类型培养类球体的呼吸作用高效测量提供了框架。
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本文内容
摘要
摘要
测量细胞球状簇中的氧气消耗量，例如 离体 胰岛，历来具有挑战性。我们展示了利用专为球形细胞团耗氧量检测设计的96孔微孔板来测定胰岛耗氧量的方法。在该检测中，于实验前一天对球形细胞团微孔板涂覆细胞和组织黏附剂。我们使用少量黏附剂溶液，以促进胰岛仅黏附于孔底。在实验当天，采用特定技术将15个胰岛直接加载至每孔底部，以确保胰岛位置优化并实现耗氧量的准确测量。在非人灵长类动物胰岛中，通过药物学手段检测线粒体呼吸的多个方面，包括ATP依赖性呼吸、最大呼吸和质子泄漏。该方法仅需每孔少量胰岛即可获得稳定且可重复的结果。理论上，该方法可适用于任何大小相似的培养球形细胞团。
引言
为了维持正常的血糖水平，胰腺β细胞必须感知葡萄糖浓度的升高，并相应地分泌胰岛素。胰岛素分泌与葡萄糖水平的耦联直接依赖于葡萄糖代谢以及线粒体氧化磷酸化所产生的ATP。因此，线粒体在刺激-分泌耦联中发挥着关键作用1。评估β细胞的线粒体功能可以揭示导致胰岛素分泌受损的缺陷。胰腺α细胞分泌胰高血糖素也与线粒体功能密切相关2。尽管永生化的胰岛细胞系在某些类型的检测中已被证明具有实用性，但这些细胞的生理特性并不能准确再现完整胰岛的功能，这一点可通过胰高血糖素在完整胰岛中对胰岛素分泌的增强作用3,4，以及胰岛素/生长抑素对胰高血糖素分泌的抑制作用5,6得以说明。这表明有必要使用完整、未损伤的胰岛来测量耗氧量。
胰岛细胞呼吸测定技术随着时间不断发展，从使用氧敏感型荧光染料7，发展到采用可直接测量耗氧量的固态传感器8。最初为单层贴壁细胞设计的常用细胞培养板系统，在用于胰岛时被证明效果不佳。由于胰岛在自然状态下不贴附于孔壁，容易被推至培养孔边缘，导致耗氧量测量结果不准确
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方案
1. 实验运行前一天对微孔板和传感器盒的准备
胰岛取自三岁的日本猕猴，方法如前所述13。该方法与从尸体供体中分离人胰岛的方法非常相似，但不同于小鼠胰岛的分离方法；在小鼠中，通常在动物镇静状态下、器官摘除前用胶原酶溶液膨胀胰腺。胰岛的获取操作严格遵循俄勒冈国家灵长类研究中心（ONPRC）和俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南，并已获得ONPRC IACUC的批准。ONPRC遵守美国农业部（USDA）执行的《动物福利法和条例》，并遵循美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》中规定的公共卫生服务政策，对实验动物实施人道护理和使用。
- 类球体微孔板的准备
- 配制 3 mL 浓度为 0.1 M 的碳酸氢钠溶液。使用 0.45 µm 滤器（材料表）对该溶液进行过滤除菌。
- 在细胞培养超净台中，将 200 µL 细胞和组织粘附剂（材料表）加入 2.8 mL 0.1 M 碳酸氢钠溶液中。然后将 20 µL 该混合液加入 96 孔类球体微孔板（材料表）每个孔的底部。确保移液枪头中无气泡，并仅使孔底被覆盖。微孔板的包被可防止在检测过程中加入药物并混匀时胰岛沿孔壁上移。
注意：仅需包被检测中实际用于胰....
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结果
将胰岛加载至微孔板时，应使用15 µL培养基吸取15个胰岛，如图1A所示。数秒内，胰岛会自然沉降至移液枪头底部。随后，将枪头降至孔底，再略微上提枪头，连同胰岛一起缓慢排出少量液体（约5 µL）。该技术可确保胰岛一致地定位在微孔板孔底（图1B），从而实现准确的耗氧量测定。
图2 显示了整个实验过程中每个孔中氧气消耗量的代表性结果。该特定实验展示了当加样操作不当，导致大量胰岛附着在孔壁侧面而非沉降至孔底时可能出现的情况。这种情况可能是因为在胰岛已被移液至孔中后，又向孔内加入了过多培养基所致。额外培养基的液流会将胰岛从孔底冲起。一旦发生这种情况，基础氧气消耗水平将非常低，且该孔对FCCP几乎无反应或完全无反应。
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讨论
以往对胰岛耗氧量的研究受到胰岛球形结构、难以贴附于培养表面以及每个孔所需胰岛数量较多等因素的限制。在本实验方案中，我们重点介绍了采用96孔球形微孔板在少量胰岛条件下准确测定胰岛耗氧量的有效性，并展示了一种在技术上可行且结果稳定的胰岛操作与加样技术。
为了使胰岛在检测过程中能够贴附于微孔板底部，并在混合步骤中保持稳定，需在检测前一天用细胞黏附溶液包被96孔微孔板。尽管这一操作通常是有益的，但如果胰岛加样不当，则容易黏附在孔壁侧面而非底部，从而影响甚至无法进行准确测量。为避免此问题，我们建议仅使用极少量的黏附溶液进行包被，每孔仅20 µL。此外，我们所展示的移液技术可确保胰岛被准确加载至孔底，而不会因额外培养基的流动将其推至孔壁侧边。
96孔球状体微孔板克服了以往测量胰岛氧消耗率的局限性，包括所需胰岛数量较多以及可同时检测的实验条件有限等问题。事实上，最近一项研究10已证明该系统可在每个孔中使用单个人胰岛进行检测。然而，使用单个胰岛测量氧消耗率时，基础氧消耗值非常低，仅在体积最大的胰.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢范德堡高通量筛选核心设施提供设备使用支持，安捷伦生物技术公司，保罗·基维特博士（俄勒冈健康与科学大学）在非人灵长类动物胰岛分离方面的帮助，以及范德堡大学埃里克·多纳休对图1提供的协助。J.M.E. 的研究得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助号 T32GM007347 的支持。M.G. 的研究得到了美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（R24DK090964-06）以及美国退伍军人事务部（BX003744）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养皿，60 mm × 15 mm 型 | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak 细胞和组织粘附剂 | Corning | 354240 | |
| 锥形管，50 mL | Falcon | 352070 | |
| 无水葡萄糖 | Fisher Scientific | BP350-1 | 用于配制葡萄糖溶液（200 mg/mL），经无菌过滤 |
| 一次性储液槽（无菌），25 mL | Vistalab | 3054-1033 | 用于多通道移液器加样 |
| EZFlow 无菌 0.45 μm PES 注射式滤器，13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-081 | 200 mM（100倍浓缩液） |
| 多通道移液器吸头 | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| 多通道移液器，15–1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | 推荐使用 |
| P20、P200 和 P1000 移液器 | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH 探针 | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| 移液器吸头，20 μL、200 μL、1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF 基础培养基 | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF 细胞线粒体应激测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 | 包含寡霉素（Oligomycin）、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A（Rotenone/Antimycin A） |
| Seahorse XFe96 分析仪 | Agilent | S7800B | 包含配备 37 °C 非 CO₂ 培养箱的预处理工作站 |
| Seahorse XFe96 类球体检测微孔板套装（Mini） | Agilent | 102905-100 | 包含传感器微孔板、类球体微孔板和校准液 |
| 碳酸氢钠 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-070 | 100 mM（100倍浓缩液） |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX9 | |
| 注射器（无菌），5 mL | BD | 309603 | 用于无菌过滤 |
| 水（无菌） | Sigma | W3500-500mL |
参考文献
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology
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重印与许可
