IR-TEx：一种面向疟疾媒介的开源大数据转录组学数据整合工具 Anopheles gambiae

摘要

IR-TEx 用于研究冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中与杀虫剂抗性相关的转录谱。本文提供了使用该应用程序的完整说明，探索多个转录组数据集的修改方法，以及利用该框架为来自任何生物体、在任何平台上生成的转录组数据集合构建交互式数据库的方法。

摘要

IR-TEx 是一个使用 Shiny（R 语言的一个软件包）编写的程序，可用于探索与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）杀虫剂抗性表型相关的转录本表达情况，并为其分配功能。该程序可在线使用，也可由任何人下载并在本地运行。本地版本的程序可进行修改，以添加来自多种组学平台的新型杀虫剂抗性数据集。本指南演示了如何添加新数据集以及如何处理缺失数据。此外，IR-TEx 可以被完全且便捷地重新编码，以适用于任何实验产生的组学数据集，使其成为众多研究人员的宝贵资源。本实验方案以微粒体谷胱甘肽转移酶 GSTMS1 为例，说明了 IR-TEx 在鉴定新型杀虫剂抗性候选基因方面的应用价值。该转录本在来自科特迪瓦和布基纳法索的多个拟除虫菊酯抗性蚊群中均呈上调表达。通过鉴定与其共表达的转录本，可进一步揭示该基因的潜在生物学功能。

引言

通过微阵列平台和RNA测序技术，研究人员能够同时测量大量转录本的表达水平，从而在模式生物和非模式生物中产生了大量将转录本表达与特定表型相关联的数据集。这些数据集为科研人员提供了极为丰富的资源，若采用大数据整合方法将相关数据集进行整合，其研究价值可进一步提升。然而，该方法通常仅限于具备特定生物信息学技能的研究人员使用。本文介绍了一款名为IR-TEx的程序（此前由Ingham等人¹发表），该程序基于R语言开发的Shiny²软件包编写，使缺乏生物信息学背景的用户也能相对轻松地对这些数据集进行整合与深入分析。

IR-TEx 位于 http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx，该工具旨在研究与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）杀虫剂抗性相关的转录本，冈比亚按蚊是非洲主要的疟疾传播媒介¹。疟疾是一种由疟原虫属（Plasmodium）物种引起的寄生虫病，通过雌性按蚊（Anopheles）叮咬在人类之间传播。使用杀虫剂靶向控制蚊媒已被证明是预防非洲疟疾发病率和死亡率最有效的方法。自2000年以来，防控工具（例如长效杀虫蚊帐）的大规模推广在显著降低疟疾病例方面发挥了关键作用³。由于可用的杀虫剂种类极为有限，蚊虫面临强烈的进化压力，目前杀虫剂抗性已在非洲疟疾传播媒介中广泛存在⁴。

此外，靶标位点突变⁵和杀虫剂的代谢降解^6,7仍是抗性机制研究的主要方向，但其他重要的抗性机制也正在逐渐被揭示¹。许多这类新机制此前并未与杀虫剂抗性相关联，但通过使用IR-TEx应用程序在多个抗性种群中搜索共同的基因表达模式而被发现，并随后通过基因组学方法进行了功能验证¹。

本文介绍了一步一步使用IR-TEx的方法，包括在网页端和本地安装环境下的操作流程。该方案描述了如何将新的杀虫剂抗性数据集整合到现有软件包中，并解释了如何处理缺失数据。最后，本文还说明了如何将该软件用于与杀虫剂抗性无关的其他组学（-omics）数据集，从而在整合不同组学方法数据的同时，处理缺失值和数据标准化问题，使各类数据具有可比性。

方案

1. 使用 IR-TEx 网络应用程序

1. 在网页浏览器中运行应用程序
   1. 通过访问页面底部的链接打开 IR-TEx 网络应用程序 http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx.
   2. 网页初始化完成后，单击 应用 页面顶部的按钮，该按钮将显示应用程序及其相关输出。
   3. 阅读与默认条目相关的每个输出 AGAP008212-RA (CYP6M2) 在转录本 ID 框中输入以下条件： An. coluzzii 暴露于拟除虫菊酯类杀虫剂或未暴露于任何杀虫剂类别的数据集，以及相关转录本与相关系数 |r| >0.98.
2. 探索目标转录本的表达
   1. 要选择感兴趣的转录本，请将转录本ID输入到 转录本 ID 盒，记住转录本以结尾 -RX 取决于所关注的同工型。
   2. 选择要查询的数据集，勾选以下相关选项：(i) 国家；(ii) 暴露状态；(iii) 目标物种；(iv) 目标杀虫剂类别，并确保这些筛选条件能够产生 >1个包含的数据集（参见Ingham等人的补充表1）¹).
      注：(iii) 指该成员中的 An. gambiae 用户感兴趣的物种复合群。目前，相关数据已可获取。 An. coluzzii 和 An. arabiensis.
   3. 点击 更新视图 在选择菜单的底部或按 返回，忽略 绝对相关值 （目前）。
   4. 等待应用程序完成更新。
   5. 将第一张图理解为：log₂ 抗性种群与实验室敏感蚊种群之间目标转录本在各数据集中满足步骤1.2所选条件的倍数变化图1）。所有数据集的详细信息可参见 Ingham 等人。¹.
   6. 阅读图表下方的信息：各相关数据集中抗性蚊虫与敏感蚊虫之间的倍数变化，以及校正后的 p 值（Q）。每一行代表微阵列上的单个探针。该图形展示方法此前已有报道¹.
   7. 阅读下表，了解在所选步骤1.2标准下，目标转录本具有显著性的实验数量以及符合条件的实验总数。
   8. 要以制表符分隔格式下载数据，请点击 下载 位于两个表格下方的按钮。此按钮允许用户通过 Excel 等程序更便捷地浏览数据。
   9. 按如下方式解读地图：每个点代表在各数据集中抗性蚊虫的大致采集地点，其中所关注的转录本呈现差异表达。颜色遵循应用程序中说明的交通信号灯系统图2).
   10. 对于步骤 1.2.5 和 1.2.8，通过右键单击并点击 另存图像为…， 并选择一个合适的文件夹。
       注意：如果应用程序出现输出错误，很可能没有数据集符合输入的条件。请查阅 Ingham 等人论文中的补充表 1。¹ 如果发生这种情况。
3. 鉴定目标转录本的潜在功能/通路
   1. 相关性（最小 r 值）² 在多个数据集之间输入值的转录本表达模式可用于预测转录本功能，并有可能揭示来自同一通路的共调控转录本。以 Ingham 等人的研究为例¹ (AGAP001076-RA； CYP4G16），请按照上述章节中的步骤1.2.1–1.2.2操作，选择所有数据集以获得最大功效。
   2. 点击之前 更新视图，移动 绝对相关值 将滑块调至 0.85，然后单击 更新视图 或按压 返回.
   3. 检查相关性表格（最下方的表格），找出当前显示的多个转录本，这些转录本与输入的转录本具有相关性（|r| = 0.85）。
   4. 操作 绝对相关值 滑动滑块并观察最下方图表和表格中的任何变化；步骤 1.3.2 的输出结果将保持不变。如图所示 图3 (|r| > 0.9，|r| > 0.8），降低相关性值的严格度会显示更多的转录本，但也会引入更多噪声。
   5. 阅读图形输出下方的表格，该表格（除步骤 1.2.6 中描述的参数外）还包含每个转录本的相关性值。
   6. 要以制表符分隔的格式下载数据，请点击 下载 按钮。
   7. 可使用 DAVID 分析对下载的转录本 ID 列表进行功能富集分析⁸. 进入 DAVID 网站（网址为 https://david.ncifcrf.gov/），选择 功能分析. 粘贴完整的基因列表，使用基因ID（不包含-RX后缀的标识符，可在Excel中通过在系统编号右侧插入一列并输入） =LEFT(X1,10)，其中 X1 为系统编号单元格]。选择该标识符作为 VectorBase_ID 基因列表并点击 提交列表.
   8. 点击 功能注释聚类 按钮，以获取该相关网络中富集结果的概览，从而为转录本指派潜在功能。通过浏览不同类别并点击相应项，深入探索各项富集结果。 + 每个按钮，然后点击 图表.

2. 本地下载和实施 IR-TEx

1. 下载并运行 IR-TEx
   1. 访问 http://github.com/LSTMScientificComputing/IR-TEx 的链接；点击 Clone or download | Download Zip。选择一个目标文件夹并将文件解压至该文件夹中。
   2. 从 http://cran.r-project.org/mirrors.html 提供的链接下载适用于相应操作系统的最新版本 R 软件，并安装该程序。
   3. 再次从 http://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ 提供的链接下载并安装适用于相应操作系统的最新 R Studio 软件。
   4. 安装完成后，打开 R Studio | Supplemental coding File 1，逐行运行代码，以完成 IR-TEx 的系统配置。
   5. 当所有软件包均成功安装并按需更新后，进入 File | Open，找到 IR-TEx.R 文件，选中并打开。此时该文件应显示在 R Studio 的顶部窗口中。
   6. 要运行应用程序，请点击窗口右上角的 Run App 按钮，将弹出第二个窗口用于加载应用程序。加载完成后，为获得完整功能，请点击已加载窗口右上角的 Open in Browser。
2. 向 IR-TEx 添加抗性数据集（使用 Anopheles gambiae 15k Agilent 芯片生成）
   1. 若要将使用相同微阵列平台（A-MEXP-2196）生成的新分析数据集添加至现有数据集中，请先下载应用程序，并定位到第 2.1 节中下载并解压的文件夹。
   2. 打开 Additional File 1，该文件代表在 A-MEXP-2196 平台上进行 limma 分析的输出结果¹。在 Excel 中，于 H1 单元格输入 Fold_Change，在 H2 单元格输入 =2^B2（其中 B2 为对数倍数变化值），并将此公式应用于 H 列的其余单元格，以生成原始倍数变化值。
   3. 调整 Additional File 1 的结构，使 A 列为 ID，B 列为 H 列的倍数变化值（复制 H 列，选中 B 列，右键粘贴数值），C 列为校正后的 p 值。删除所有其他列，并将其另存为制表符分隔的文件。
   4. 打开 Supplemental coding File 2，使用第 2.2.3 步生成的制表符分隔文件运行代码。
      NEWFILE_FC = c('COUNTRY','EXPOSURE STATUS','SPECIES','INSECTICIDE')
      NEWFILE_Q = c('COUNTRY','EXPOSURE STATUS','SPECIES','INSECTICIDE')
      注意：单引号内的字段应更改为新数据集的相关信息。暴露状态指样本是否在杀虫剂暴露后采集（暴露/未暴露）。杀虫剂：若为“未暴露”，则填写“none”。参见 Fold_Changes.txt 文件中其他样本的元数据。请确保拼写一致。
   5. 打开 geography.txt 文件，滚动至最后一个有内容的行，选择其下一行。在第 1 列输入数据集名称，后跟 Q 和 NEWFILE_Q；在第 2 列输入样本采集地点的纬度；在第 3 列输入经度。保存更改。
   6. 如果使用了新的条目（例如 Gambia），而该条目在数据集中不可选（参见 Ingham 等人补充表 1¹），则需要将其添加至代码中。为此，请在 RStudio 中打开 IR-TEx.R 文件，并定位到 RStudio 指示的第 26 行，此处应开始出现以下内容：
      'sidebarPanel(….'。
      注意：接下来的每一行对应在第 2.2.5 步中输入到 Fold_Changes.txt 文件中数据集名称下方各行的元数据项。
   7. 要添加新的元数据，请滚动至所选元数据所在行的末尾，找到“selected=”这一术语。其后应为一个逗号和闭合括号；此时将光标置于闭合括号内。在最后一个单引号后输入一个逗号，接着输入一个单引号，然后输入新的元数据（例如 'Gambia'），并保存更改。示例如下：
      checkboxGroupInput('CountryInput','Select Relevant Countries',c('Burkina Faso','Cote D`Ivoire','Cameroon','Equatorial Guinea','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'),selected=c('Burkina Faso','Cote D`Ivoire','Cameroon','Equatorial Guinea','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo'))
   8. 运行应用程序。新的元数据条目应作为未选中的复选框出现在相应标题下。如果用户希望其默认被选中，则应将其添加至 selected=c(…) 列表中，如下所示：
      checkboxGroupInput('CountryInput','Select Relevant Countries',c('Burkina Faso','Cote D`Ivoire','Cameroon','Equatorial Guinea','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'),selected=c('Burkina Faso','Cote D`Ivoire','Cameroon','Equatorial Guinea','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'))
   9. 如需添加未在 A-MEXP-2196 平台上生成的抗性数据集，请参见第 3 节。

3. 针对不同数据集调整 IR-TEx 的使用方法

1. 在多个组学平台间应用并处理缺失数据
   1. 继续进行 "0" 在数据集中：请查阅数据集来源以了解具体含义 "0"建议 "0" 被（保守地）替换为 "NA"与原始的倍数变化（B/A）相同， "0" 表示在实验条件B中未检测到信号。如果实验条件A表现出显著表达，用户可应用较小的倍数变化值。
   2. 打开 附加文件 2.txt，一个来自 Uyhelji 等人的 RNAseq 文件⁹此文件为新数据应遵循的模板：A 列为标识符，B 列为原始倍数变化值，C 列为校正后的 p 值。请使用此文件执行以下步骤。
   3. 运行 R 代码，将不同平台的标识符匹配到一个制表符分隔的文件中，然后对数据进行整理和标准化（补充编码文件 2）。文件中包含说明。任何 FILEPATH 均将通过 "/" 适用于 macOS 或 "//" 适用于 Windows（请更改这些设置） "\"，它们将按此形式呈现。
   4. 输出在实验结束时生成的文件 补充编码文件 2 到步骤 3.1.5 中选定的位置以供使用。 补充编码文件 2 将输出一个新 Fold_Changes.txt 文件。备份原始文件。
   5. 执行包含在代码中的指令 补充编码文件 3. 找到名为的输出文件 FC_distribPlot.png 在指定为的文件夹中 文件路径. 检查对数分布₂ 倍数变化，以验证对数₂ 不同数据集之间的倍数变化分布几乎相同。
   6. 按照步骤 2.2.6 的说明编辑其他文件，并确保新文件的兼容性 Fold_Changes.txt.
2. 将 IR-TEx 用于全新数据集的修改方法
   1. 打开 IR-TEx.R 在 RStudio 中并找到以第 23–34 行开头的代码行：
      '标签面板('
      并结束于：
      提交按钮("更新视图", 图标("刷新"))
      ),
   2. 改变 AGAP008212-RA 在新数据中，将以下行中的内容与目标转录本进行比对。
      textInput('textInput','转录本 ID',value='AGAP008212-RA')
   3. 找到以以下内容开头的四个选项：
      复选框组输入
      这些选项可进行修改，以表示用户希望用于筛选新数据的重要元数据。在每种情况下，用户都应更改 选择相关国家; 选择暴露状态; 选择相关物种； 和 选择杀虫剂类别 以代表数据（即 选择组织类型; 选择性别; 选择年龄区间; 选择疾病状态.
   4. 识别与数据集相关的元数据，并输入以替换第一个之后的现有选项 c('在每种情况下，选项都应包含在引号内，并以逗号与下一个选项分隔。在最后一个选项之后，应闭合括号。示例如下 选择疾病状态 是：
      （感染、未感染、未知）
   5. 选择在打开应用程序时将选中的元数据。这些选项可通过修改后续设置进行更改 selected=c('一个示例 选择疾病状态 是：
      selected = c('感染', '未感染')
      这将指示应用程序在初始加载时仅选择符合这些条件的数据集。
   6. 要创建一个新的数据表，请遵循以下布局： Fold_Changes.txt 并按照第2节中的说明操作。根据步骤3.2.4中列出的每一项更改，精确修改元数据（R语言区分大小写）。在“detoxification”列中输入基因名称，在“transcript type”列中为每条转录本输入基因描述。添加新数据集时，请遵循第3.2节的指导。
   7. 如果映射与实验需求无关，请找到以下代码行并在其前方添加“#”：
      第49–51行：
      （空行）
      withSpinner(plotOutput("地理学")),
      地理图例
      第493行开始：
      地理学 <- renderPlot({
      至602行结束：
      地理图例 <- 渲染文本({
      粘贴("仅显著转录本（p"，作为表达式（"<="),"0.05)：FC > 5 = 红色，FC > 1 = 琥珀色，FC < 1 = 绿色"，sep=""）
      })

结果

利用 IR-TEx 附带的 Fold_Changes.txt 文件，我们将抗性伊蚊库兹氏按蚊（Anopheles coluzzii）和冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）数据集中的显著差异表达转录本与来自科特迪瓦和布基纳法索的敏感型对照进行了比较。结果得到18个感兴趣的转录本（表1；该分析可通过 Excel、R 或其他程序完成）。其中两个转录本——ATP酶（AGAP006879）和α-晶体蛋白（AGAP007160）——已有文献报道，前者对拟除虫菊酯抗性具有显著影响¹。除这两个转录本外，还发现了两个解毒相关转录本：GSTMS1（FC_µ = 1.95 和 1.85）和 UGT306A2（FC_µ = 2.29 和 2.28）。

如前所述¹，对其中两个转录本（GSTMS1，一种解毒相关转录本；以及 AGAP009110-RA，一种功能未知、蚊子特有的含有 β-1,3-葡聚糖结合结构域的转录本）进行了 qPCR 验证。使用 附加文件 3 中描述的引物组进行分析，结果表明，与实验室敏感品系 N'Gousso 相比，这两个转录本在来自科特迪瓦（Tiassalé）的一个多重抗性种群以及来自布基纳法索（Banfora）的另一个种群中均显著上调（图 4A）。

由于这两个转录本在所有抗性种群中均表现出显著上调，因此在来自LSTM实验室Tiassalé品系的蚊虫中进行了RNAi诱导的基因敲低实验。该品系源自科特迪瓦，对公共卫生中使用的各类主要杀虫剂均具有抗性，如先前研究所述^1,10。敲低GSTMS1的表达后，与注射GFP的对照组相比，氯氰菊酯暴露后的死亡率显著升高（p = 0.021），表明该转录本在拟除虫菊酯抗性中具有重要作用（图4B）。相反，AGAP009110-RA的敲低在暴露后并未引起死亡率的显著变化（p = 0.082）（图4B）。

GSTMS1 是一种微粒体谷胱甘肽 S-转移酶（GST），也是在A. gambiae蚊子中发现的三种此类酶之一¹¹。尽管此前已有研究指出 epsilon 类和 delta 类 GST 成员参与了杀虫剂的解毒过程^12,13,14，但据我们所知，这是首次发现微粒体 GST 在拟除虫菊酯类杀虫剂抗性中发挥作用的证据¹⁵。为了探究该转录本在Anopheles gambiae sl蚊子中的潜在功能，研究分析了其在 IR-TEx 中的表达情况及相关性。GSTMS1 在该物种现有的 21 个数据集中有 20 个表现出显著的过表达，仅比奥科岛例外。在各个地区，其过表达水平均低于五倍，相较于敏感种群而言（图 5）。

由于微粒体谷胱甘肽S-转移酶（microsomal GSTs）长期以来一直被忽视作为潜在的杀虫剂解毒因子，目前对其在杀虫剂抗性中的作用知之甚少¹⁵。通过分析其他转录本的共相关性，可基于共调控或参与相同通路的假设来推断其假定功能。为了在相关性网络中最大化分析效力，选择了IR-TEx中所有可用的基因芯片数据集，并设定相关系数绝对值 |r| >0.75。 表2 显示了来自IR-TEx的分析结果。

在DAVID功能注释工具中，这些转录本在氧化还原酶活性以及葡萄糖/碳水化合物代谢方面显著富集⁸。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和谷胱甘肽γ-裂解酶均可维持哺乳动物细胞中谷胱甘肽的水平^16,17，因此与谷胱甘肽S-转移酶GSTMS1直接相关。过氧化氢酶是一种快速响应氧化应激的酶，可保护细胞免受活性氧物种的损伤，而活性氧是拟除虫菊酯暴露的副产物。伐昔洛韦水解酶是一种水解酶，可能在哺乳动物细胞的解毒过程中发挥作用¹⁸。CYP4H17也出现在相关性网络中。细胞色素P450酶可直接代谢拟除虫菊酯类杀虫剂，其降解产物可进一步被谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）代谢。最后，已有研究指出CYP4H17与A. funestus中拟除虫菊酯抗性相关¹⁹。综上所述，这些数据强烈支持GSTMS1在异源物质解毒中发挥重要作用。

图1：所有数据集中 AGAP002865-RA 的 Log₂ 倍数变化。 横轴表示不同的数据集，相关信息可参见先前发表文章的补充表1¹；纵轴表示目标转录本的 Log₂ 倍数变化。浅灰色虚线表示显著性近似阈值，此处定义为倍数变化 <0.8 或倍数变化 >1.2。黑色虚线表示倍数变化为1（即抗性群体与敏感性群体之间无表达差异）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：显示抗性群体中AGAP002865-RA显著差异表达的微阵列分布。 倍数变化采用交通灯系统表示：绿色表示倍数变化<1，橙色表示倍数变化>1，红色表示倍数变化>5。仅显示具有显著差异表达（p ≤ 0.05）的数据集。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：AGAP001076-RA（CYP4G16）的相关性网络。 在31个基因芯片数据集中，对所有转录本进行两两相关性计算，并应用用户自定义的阈值。图中显示的是（A）|r| > 0.9 和（B）|r| > 0.8 的结果。图中展示的所有转录本均满足该阈值条件，并与 AGAP001076-RA 的表达变化一致。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：敲低 GSTMS1 和 AGAP009110-RA 后的 mRNA 表达与表型变化。（A）分别来自科特迪瓦和布基纳法索的两个多重抗性An. coluzzii群体中 GSTMS1 和 AGAP009110-RA 的 mRNA 表达水平。以实验室敏感型An. coluzzii N'Gousso 为对照进行比较。显著性水平通过单因素方差分析（ANOVA）结合事后 Dunnett 检验计算得出。（B）与注射 GFP 的对照组相比，两种转录本经 RNAi 介导的敲低效果。GSTMS1 的敲低在氯氟氰菊酯暴露后显示出显著升高的死亡率（通过单因素方差分析结合事后 Tukey 检验计算；*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：Anopheles gambiae 和 Anopheles coluzzii 种群中 GSTMS1 的表达情况。 该地图显示了在现有的基因芯片数据集中 GSTMS1 显著差异表达的情况。GSTMS1 在21个基因芯片数据集中的20个中均表现出显著差异表达。请点击此处查看该图的放大版本。

转录本ID	描述	布基纳法索	科特迪瓦
AGAP006879-RA	ATP酶	27.94	43.05
AGAP007160-RB	a-晶体蛋白	11.49	10.58
AGAP007160-RC	a-晶体蛋白	11.14	10.38
AGAP007160-RA	a-晶体蛋白	9.78	9.84
AGAP009110-RA	未知	9.26	5.96
AGAP007780-RA	NADH脱氢酶	10.49	3.77
AGAP006383-RA	寡糖基转移酶复合体β亚基	3.69	5.57
AGAP007249-RB	Flightin蛋白	4.61	3.86
AGAP003357-RA	RAG1激活蛋白1样蛋白	4.31	4.05
AGAP007249-RA	Flightin蛋白	4.48	3.46
AGAP001998-RA	mRpS10	3.46	2.85
AGAP007589-RA	UGT306A2	2.29	2.28
AGAP000165-RA	GSTMS1	1.95	1.85
AGAP002101-RA	异亮氨酰-tRNA合成酶	0.57	0.59
AGAP002969-RA	天冬酰胺酰-tRNA合成酶	0.45	0.45
AGAP004199-RA	溶质载体家族5（钠偶联单羧酸转运蛋白），成员8	0.35	0.48
AGAP004684-RA	rRNA加工蛋白CGR1	0.36	0.22
AGAP006414-RA	Cht8	0.024	0.36

表1：在布基纳法索和科特迪瓦种群中相同倍数变化方向上显著差异的转录本。 转录本ID、基因描述以及代表An. coluzzii和An. gambiae种群的两个国家各自数据集的平均倍数变化。

相关性	系统命名	转录本类型
1	AGAP000165-RA	GSTMS1
0.82	AGAP004904-RA	过氧化氢酶
0.76	AGAP007243-RA	26S 蛋白酶调节亚基 8
0.79	AGAP008358-RA	CYP4H17
0.76	AGAP009436-RA	伐昔洛韦水解酶
0.75	AGAP010739-RA	葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶
0.85	AGAP011172-RA	胱硫醚γ-裂解酶
0.76	AGAP012678-RA	葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶

表2：与之共相关的转录本 GSTMS1. 该表格展示了相关性网络的输出结果 GSTMS1 在 IR-TEx 上，|r| 为 >0.75。该表格列出了每个共相关转录本的Spearman相关系数、转录本ID和基因描述。

附加文件1：在limma上分析的A-MEXP-2196芯片的输出文件。 该文件来源于一项Met基因敲低实验与GFP对照芯片的比较，更多细节见ArrayExpress数据库（编号E-MTAB-4043）及另一篇先前发表的文献¹。各列分别代表AGAP标识符（SystematicName）、对数倍数变化（logFC）、对数表达值（AveExpr）、t统计量（t）、未校正的p值（P.Value）、校正后的p值（adj.P.Val）以及B统计量（B）²⁰。本文件中所涉及的蚊虫为中国科特迪瓦地区的Anopheles coluzzii，未接触过杀虫剂，采集地经纬度分别为-5.4和6.0。 请点击此处查看该文件（右键可下载）。

附加文件 2：RNAseq 实验的输出文件。 RNAseq 分析数据来自 Uyhelji 等人⁹，描述了按蚊（Anopheles）在暴露于 50% 盐度时转录组的变化。该文件改编自论文中的表 S2，包含 AGAP 标识符（SystematicID）、原始倍数变化（Fold_Change）以及校正后的 p 值（q_value）。请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。

附加文件3：代表性结果的引物列表。 每个转录本的AGAP编号、基因名称、dsRNA正向引物、dsRNA反向引物、qPCR正向引物和qPCR反向引物序列集合。请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

补充代码文件 1。 请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。

补充代码文件 2。 请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。

补充代码文件 3。 请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。

讨论

大数据转录组学为每种实验条件产生数千个差异表达转录本的列表。许多此类实验是在相关生物体和表型上进行的，且几乎总是被作为独立实验进行分析。通过整体性地、且不依赖理论假设地利用这些丰富的数据资源，将能够：1）识别出新的候选转录本；2）避免因信息量过大而无法在体内验证，从而导致有价值的数据被舍弃¹。

IR-TEx 为生物信息学背景有限的用户提供了便捷地分析多个数据集、可视化数据集变化以及下载相关数据的能力¹。尽管 IR-TEx 不支持在单次搜索中查询多个转录本，但用户可直接使用 Excel、R 或其他合适的程序查看相应的 Fold_Changes.txt 文件。IR-TEx 的进一步优势在于利用相关性网络预测转录本功能，输入假定蛋白或功能未知的转录本，并结合下游软件进行富集分析¹。

在本方案所展示的示例中，IR-TEx 按其原始功能使用。在此，它可用于探索与杀虫剂抗性相关的转录本，并通过作图方式可视化转录本的上调和下调表达分布情况。感兴趣的转录本需在体内进行验证，以确定其上调或下调表达是否与观察到的表型¹（例如杀虫剂抗性）相关。如先前报道¹所示，该数据集可用于基于假设的研究方法，以在国家特异性基础上鉴定感兴趣的转录本。随后可利用 IR-TEx 实现：1）探索该转录本的表达情况；2）通过在每个组学数据集所包含的所有转录本之间构建两两相关性网络，对该转录本的功能进行情境化分析。在此，GSTMS1 被发现与多个参与解毒过程的其他转录本存在共相关性。这些数据（结合该转录本敲低后，在杀虫剂暴露后导致死亡率显著上升的结果）表明该转录本在异源物质清除中具有重要作用。

IR-TEx 是一个有价值的资源，可用于通过网络或本地应用程序探索与杀虫剂抗性相关的转录本。本实验方案展示了如何针对不同的组学平台以及全新的数据对 IR-TEx 进行修改。该指南说明了如何使用 IR-TEx 整合来自多个组学平台的数据集，包括含有缺失数据的数据集，并展示了如何简便地重新编码 IR-TEx，使其对任何研究转录组数据集的研究人员都有所帮助。

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