我们建立了一种基于干细胞移植、阴道内人类免疫缺陷病毒暴露以及液滴数字PCR RNA定量的人源化且感染人类免疫缺陷病毒的NOG小鼠模型的制备与评价方案。
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本文内容
摘要
摘要
人源化小鼠为研究人类免疫缺陷病毒（HIV）的病毒学特性以及测试抗病毒药物提供了先进的研究平台。本方案描述了在成年NOG小鼠中建立人类免疫系统的方法。本文详细阐述了从脐带血中分离人CD34+细胞、将其经静脉移植至小鼠体内，到通过HIV感染、联合抗逆转录病毒治疗（cART）及采血等操作对模型进行干预的全部实验步骤。每只小鼠经静脉注射约75,000个人CD34+细胞后，可通过流式细胞术对小鼠外周血中的人源嵌合率（即人源化水平）进行长达数月的纵向评估。注射75,000个hCD34+细胞后，小鼠外周血中可达到20%–50%的人源CD45+细胞比例。该小鼠模型可经阴道途径感染HIV，且可每周采血一次用于分析，或在较长时间内每两周采血两次。本方案还介绍了一种利用微滴数字PCR（ddPCR）定量血浆病毒载量的检测方法。我们展示了如何通过饮食给予标准护理方案的cART药物，从而有效治疗这些小鼠。将cART药物掺入常规小鼠饲料中给药，是对该实验模型的重要优化。该模型可用于系统性或局部使用暴露前预防药物的临床前分析，也可用于新型治疗方法及HIV治愈策略的评估。
引言
人类免疫缺陷病毒（HIV）是一种慢性感染，全球感染者超过3700万人1。联合抗病毒治疗（cART）是一种挽救生命的疗法，但仍需要实现治愈。因此，需要能够模拟人类免疫系统及其应答反应的动物模型，以推动HIV的持续研究。通过将人类细胞移植到重度免疫缺陷小鼠体内，已开发出多种能够支持细胞和组织移植的人源化小鼠模型2。这类人源化小鼠可感染HIV，为非人灵长类猴免疫缺陷病毒模型提供了重要的替代方案，且相较于非人灵长类动物，其成本更低、使用更简便。人源化小鼠已广泛应用于HIV病毒传播、发病机制、预防和治疗等方面的研究3,4,5,6,7,8,9,10,11。
我们介绍了一种用于HIV研究的灵活人源化....
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方案
所有脐带血样本均严格按照当地批准的方案获取，并包括父母匿名捐赠的知情同意。所有动物实验均根据许可证2017-15-0201-01312，依照丹麦国家法规批准并严格实施。
警告：处理暴露于 HIV 的小鼠和血液时需极度谨慎。所有接触过 HIV 的表面和液体均须使用经证实可灭活 HIV 的消毒剂进行去污处理（材料表）。
1. 人CD34+干细胞的分离
- 根据当地伦理审批，在计划的剖宫产或阴道分娩后，使用EDTA抗凝采血管收集脐带血样本。
- 按照试剂盒说明书，通过密度梯度离心法从脐带血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
- 从PBMC群体中分离CD34+细胞，首先使用针对成熟细胞常见标志物的抗体进行预富集，诱导非目标谱系细胞与红细胞交联。随后按照试剂盒说明书，利用磁珠法进一步富集CD34+细胞。
- 通过标准台盼蓝排斥法测定活细胞数量：将10 µL细胞悬液重悬于90 µL台盼蓝溶液中。取10 µL该混合液加入血细胞计数板，根据试剂盒说明书计数未染成蓝色的细胞。
- 将CD34+细胞以每毫升含10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）溶液进行活性冻存，直至小鼠移植当日。
- 分别对分离得到的CD34+细胞及流穿组分（CD34-）中的一小部分进行活性冻存，用于后续评估CD34+....
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结果
干细胞纯度分析的设门策略如图1所示。图1A–C显示了纯化的CD34+细胞群，图1D–F显示了CD34-流穿组分，用于说明在分离过程中仅有极少量CD34+细胞丢失。分离获得的CD34+干细胞纯度介于85%–95%之间，T细胞污染少于1%。图1G显示了一名成年健康对照供体（CCR5Δ32/wt基因型）的CCR5条带，随后为两名CCR5wt/wt基因型和一名CCR5Δ32/wt基因型干细胞供体的条带。在19名供体组成的群体中，CCR5Δ32/wt基因型的频率为15.8%（
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讨论
严重免疫缺陷小鼠品系 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac（NOG）小鼠极适用于人源细胞和组织的移植。这些小鼠的先天性和适应性免疫通路均存在缺陷。NOG和NSG小鼠均携带Prkdcscid 导致T细胞和B细胞功能缺陷的突变。此外，这些小鼠缺乏功能性白细胞介素-2受体γ链（common gamma chain, IL2rg），该链是多种关键细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21）结合复合物中不可或缺的组成部分。将人免疫系统移植到NOG等免疫缺陷小鼠体内，已成为研究HIV传播和免疫学的有力工具。利用人源化小鼠在这些领域所取得的研究进展已有大量综述。2,23,24,25,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢奥胡斯大学生物医学动物实验中心的工作人员，特别是Jani Kær女士在小鼠品系维护及体重监测方面所做的工作。作者感谢Florian Klein教授在制定标准护理cART方案以及研究指导方面提供的帮助。以下试剂由美国国家卫生研究院（NIH）艾滋病试剂项目、艾滋病研究部（NIAID，NIH）提供：来自John Kappes博士和Christina Ochsenbauer博士的pRHPA.c/2635（货号# 11744）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蓝色垫片 | VWR | 56616-031 | 使用前应进行灭菌 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A8022 | |
| CD19（克隆号 sj25c1）PE-Cy7 | BD 生物科学 | 557835 | |
| CD3（克隆OKT3）FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3（克隆SK7）BUV395 | BD生物科学 | 564001 | |
| CD34（克隆 AC136）FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4（克隆SK3）BUV 496 | BD生物科学 | 564652/51 | |
| CD45（克隆 2D1）APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8（克隆 RPA-T8）BV421 | BD生物科学 | 562428 | |
| 探针法ddPCR超级混合液（不含dUTP） | 伯乐（Bio-Rad） | 1863025 | |
| DMSO | 默克 | 10,02,95,21,000 | |
| DNA酶 | Sigma | D4263 | 用于悬浮缓冲液 |
| dNTP混合液 | Life Technologies | R0192 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep 人脐带血 CD34 阳性选择试剂盒 II | 干细胞 | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS溶血液 10X | BD | 349202 | 使用前用去离子水按1:10比例稀释 |
| FACS 管（Falcon 5 mL 圆底） | Falcon | 352052 | |
| Fc受体阻断液（Human Trustain FcX） | Biolegend | 422302 | |
| 胎牛血清 | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| 纱布 | Mesoft | 157300 | 使用前应进行灭菌 |
| 加热灯 | 定制 | ||
| 血细胞计数板（Bürker-Türk | VWR | DOWC1597418 | |
| 异氟烷气体 | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 流式细胞仪 | BD | ||
| 微量离心管，经PCR-PT认证 | Sarstedt | 72692405 | |
| 小鼠cART食物 | ssniff Spezialdiäten GmbH | 定制产品 | |
| 小鼠固定器 | 定制产品 | ||
| 针头，Microlance 3，30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG小鼠 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| 无核酸酶水 | VWR 化学品 | 436912C | |
| Nucleospin 96 病毒 DNA 和 RNA 提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740691 | |
| 经PCR验证的微量离心管 | Sarstedt | 72.692.405 | |
| 青霉素-链霉素溶液 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA聚合酶 | Life Technologies | F549S | |
| 移液器吸头，无菌，ART 20P 防护型 | 赛默飞世尔科技 | 2149P | |
| 蛋白酶K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft 软件 | Bio-Rad | ||
| QX100 微滴生成仪 | 伯乐（Bio-Rad） | 1886-3008 | |
| QX100 微滴读取仪 | 伯乐（Bio-Rad） | 186-3003 | |
| 红细胞裂解液 | Biolegend | 420301 | |
| 无RNase的DNA酶F+反应缓冲液 | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | 溶于 H2O |
| Softject 1 mL 注射器 | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III 逆转录酶 | 赛默飞世尔科技 | 18080044 | |
| 恒温混匀仪 | VWR | 89370-910 | |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | |
| 超纯 0.5 EDTA，pH 8.0 | 赛默飞世尔科技 | 15575-020 | |
| Virkon S（病毒消毒剂） | 杜邦 | 7511 |
参考文献
- WHO. GHO | By category | Antiretroviral therapy coverage - Data and estimates by WHO region (2018). World Health Organization. , Available from: http://apps.who.int/gho/data/node.main.626 (2018).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
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