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方法文章

用于阴道内HIV暴露及HIV感染治疗研究的人源化NOG小鼠

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DOI：

10.3791/60723

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2020年1月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Infectious Diseases, Aarhus University Hospital, 3Department of Biomedicine, Aarhus University, 4Department of Gynecology and Obstetrics, Aarhus University Hospital, 5Department of Biology, University of Nebraska at Omaha

本文内容

摘要

我们建立了一种基于干细胞移植、阴道内人类免疫缺陷病毒暴露以及液滴数字PCR RNA定量的人源化且感染人类免疫缺陷病毒的NOG小鼠模型的制备与评价方案。

摘要

人源化小鼠为研究人类免疫缺陷病毒（HIV）的病毒学特性以及测试抗病毒药物提供了先进的研究平台。本方案描述了在成年NOG小鼠中建立人类免疫系统的方法。本文详细阐述了从脐带血中分离人CD34+细胞、将其经静脉移植至小鼠体内，到通过HIV感染、联合抗逆转录病毒治疗（cART）及采血等操作对模型进行干预的全部实验步骤。每只小鼠经静脉注射约75,000个人CD34+细胞后，可通过流式细胞术对小鼠外周血中的人源嵌合率（即人源化水平）进行长达数月的纵向评估。注射75,000个hCD34+细胞后，小鼠外周血中可达到20%–50%的人源CD45+细胞比例。该小鼠模型可经阴道途径感染HIV，且可每周采血一次用于分析，或在较长时间内每两周采血两次。本方案还介绍了一种利用微滴数字PCR（ddPCR）定量血浆病毒载量的检测方法。我们展示了如何通过饮食给予标准护理方案的cART药物，从而有效治疗这些小鼠。将cART药物掺入常规小鼠饲料中给药，是对该实验模型的重要优化。该模型可用于系统性或局部使用暴露前预防药物的临床前分析，也可用于新型治疗方法及HIV治愈策略的评估。

引言

人类免疫缺陷病毒（HIV）是一种慢性感染，全球感染者超过3700万人1。联合抗病毒治疗（cART）是一种挽救生命的疗法，但仍需要实现治愈。因此，需要能够模拟人类免疫系统及其应答反应的动物模型，以推动HIV的持续研究。通过将人类细胞移植到重度免疫缺陷小鼠体内，已开发出多种能够支持细胞和组织移植的人源化小鼠模型2。这类人源化小鼠可感染HIV，为非人灵长类猴免疫缺陷病毒模型提供了重要的替代方案，且相较于非人灵长类动物，其成本更低、使用更简便。人源化小鼠已广泛应用于HIV病毒传播、发病机制、预防和治疗等方面的研究3,4,5,6,7,8,9,10,11。

我们介绍了一种用于HIV研究的灵活人源化模型系统，该系统通过将脐带血来源的人类干细胞移植到NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac（NOG）背景的小鼠体内而建立。除非胎源性外，与涉及血液-肝脏-胸腺（BLT）结构移植的显微外科手术相比，这些小鼠的实际生物工程操作在技术上要求更低。

我们展示了如何通过阴道内传播建立HIV感染，以及如何利用基于高灵敏度微滴数字PCR（ddPCR）的系统监测血浆病毒载量。随后，我们描述了将标准cART作为小鼠日常饮食一部分给药的方法。这些联合方法的目的是减少动物应激，并便于开展大规模实验，从而限制每只动物的操作时间12。

在人类中，CCR5Δ32/wt 或 CCR5Δ32/Δ32 基因型可降低个体对传播/创始型 HIV 病毒感染的易感性13，因此在利用干细胞构建用于 HIV 研究的人源化小鼠模型时，必须采取一些预防措施。这一点在我们地区尤为重要，因为 CCR5 基因的天然变异（尤其是 Δ32 缺失突变）在斯堪的纳维亚和波罗的海原住人群中的发生率明显高于世界其他地区14,15。因此，我们的实验方案包含了一种简便、高通量的检测方法，可在移植前对供体造血干细胞中的 CCR5 变异进行筛查。

在阴道内暴露实验中，我们选择了从一名处于感染早期且通过阴道途径感染的女性体内分离出的传播/奠基型 R5 病毒 RHPA425916。我们给予小鼠的病毒感染剂量足以在大多数小鼠中实现成功传播，但传播率低于100%。选择此类剂量可使传播率具有足够的动态范围，从而在HIV预防实验中，抗病毒药物候选物的作用可表现为部分动物受到保护；在治疗研究中则表现为病毒载量降低。

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方案

所有脐带血样本均严格按照当地批准的方案获取，并包括父母匿名捐赠的知情同意。所有动物实验均根据许可证2017-15-0201-01312，依照丹麦国家法规批准并严格实施。

警告：处理暴露于 HIV 的小鼠和血液时需极度谨慎。所有接触过 HIV 的表面和液体均须使用经证实可灭活 HIV 的消毒剂进行去污处理（材料表）。

1. 人CD34+干细胞的分离

  1. 根据当地伦理审批，在计划的剖宫产或阴道分娩后，使用EDTA抗凝采血管收集脐带血样本。
  2. 按照试剂盒说明书，通过密度梯度离心法从脐带血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
  3. 从PBMC群体中分离CD34+细胞，首先使用针对成熟细胞常见标志物的抗体进行预富集，诱导非目标谱系细胞与红细胞交联。随后按照试剂盒说明书，利用磁珠法进一步富集CD34+细胞。
    1. 通过标准台盼蓝排斥法测定活细胞数量：将10 µL细胞悬液重悬于90 µL台盼蓝溶液中。取10 µL该混合液加入血细胞计数板，根据试剂盒说明书计数未染成蓝色的细胞。
    2. 将CD34+细胞以每毫升含10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）溶液进行活性冻存，直至小鼠移植当日。
    3. 分别对分离得到的CD34+细胞及流穿组分（CD34-）中的一小部分进行活性冻存，用于后续评估CD34+干细胞纯度（每份样本约30,000个细胞）。或者，也可在新鲜富集的细胞上直接检测纯度（见下文步骤2）。
    4. 将部分未离心沉淀的流穿组分（CD34-）冻存，用于检测CCR5Δ32基因型。细胞可直接冻存，无需使用程序性冻存液，但如果流穿组分经过离心形成沉淀，其中残留的红细胞可能抑制后续PCR反应。

2. 通过流式细胞术评估 CD34+ 干细胞纯度

  1. 解冻分离的细胞（CD34+）和流穿细胞（CD34-）。将每支冻存管中的细胞用9 mL室温（RT）FACS缓冲液重悬，以洗涤细胞，FACS缓冲液由含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）组成。
  2. 在室温下以300 × g 离心5分钟，使细胞沉淀。
  3. 倒去上清液，将细胞重悬于残留液体中，并转移至FACS管。用3 mL FACS缓冲液重复洗涤一次。第二次离心后，倒去上清液，将细胞重悬于残留液体中。
  4. 加入5 µL Fc受体阻断液（材料表），室温孵育10分钟。无需洗去Fc受体阻断液。
  5. 加入含有针对人CD3（克隆SK7）BUV395、CD34（克隆AC136）FITC和CD45（克隆2D1）APC的预确定体积抗体的混合液（表1）。将细胞在室温避光孵育30分钟。荧光染料的选择应基于可用流式细胞仪可检测的参数，且无需进行补偿矩阵校正。
  6. 用3 mL FACS缓冲液洗涤细胞。
  7. 在室温下以300 × g 离心5分钟，使细胞沉淀。
  8. 倒去上清液，将细胞重悬于残留液体中。
    1. 重复此洗涤步骤两次，以确保所有未结合的抗体均被去除。
  9. 在流式细胞仪（材料表）上采集样本数据，并使用适当的软件进行数据分析。门控策略见图1A–F。

3. 脐带血中CCR5Δ32 变异的基因筛查

  1. 将1.25 µL未离心的流穿液与11.25 µL PCR反应液混合，反应液包含200 µM dNTP混合物、0.01 U/µL高保真DNA聚合酶以及表2中详述的正向和反向引物。
    1. 用无核酸酶水将每份PCR反应体系调整至约12.5 µL。
  2. 使用表3中详述的PCR循环程序扩增基因组片段。
  3. 在2%琼脂糖凝胶上分离PCR产物13。
    1. 野生型等位基因和Δ32等位基因的PCR产物分别产生196个碱基对和164个碱基对的条带，可通过凝胶电泳轻松区分13（图1G）。

4. 静脉内干细胞移植

注意：由一人在实验室中准备细胞，另一人同时准备小鼠和移植所需的工作环境，是一种高效的方法。

  1. 在动物实验设施中，在计划进行干细胞移植前 4–6 小时，使用 Cs137 放射源对 6–7 周龄的雌性 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac（NOG）小鼠（材料表）进行 0.75 Gy 的照射。最佳预处理剂量可能因小鼠年龄、辐射源及其他因素而异。此过程可使动物适应，以成功植入人源干细胞。
  2. 在动物实验设施中，在将小鼠或细胞带入操作区域前，准备好超净工作台的操作空间及所有试剂。
    1. 铺设无菌蓝色垫巾以覆盖超净工作台的操作表面。准备无菌纱布和锐器收集容器。
    2. 将用 70% 乙醇消毒过的加热灯置于超净工作台内，并在加热灯下方放置一个无菌的空小鼠笼。
  3. 在实验室中，将分离的 CD34+ 细胞解冻，并用 9 mL 37 °C 的普通 RPMI 培养基稀释。
  4. 在室温下以 350 x g 离心 5 分钟，用移液器弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 37 °C 的普通 RPMI 培养基中。
  5. 通过台盼蓝染色法测定细胞数量，并将体积调整为每只小鼠 200 µL。额外多准备一些细胞，以补偿后续操作步骤中可能发生的损失。
    1. 准备将每 200 µL 悬液中含有 75,000 个 CD34+ 细胞的细胞悬液移植至每只小鼠体内。
    2. 细胞在移植前运输至动物实验设施期间可保存在 4 °C 环境中。避免将细胞置于冰上，以减少细胞聚集或结块。
  6. 在动物实验设施中，将装有小鼠的笼子移入超净工作台，将小鼠转移至加热灯下的空笼中以扩张其血管。将笼子的一端远离热源，以便小鼠在感到过热时可自行移开。当小鼠移动至远离热源的一端时，表明其体温已足够高，适合进行尾静脉注射。
  7. 用含细胞悬液的润滑注射器吸取超过 800 µL 刻度的液体。使用润滑过的 1 mL 注射器可显著简化静脉注射操作，并提高该技术的精确性。
  8. 安装 30 G 13 mm 针头，并准备用于注射的针头和注射器。此操作顺序可加快注射器的装载速度，同时保护待移植细胞的完整性，避免因细胞快速通过如此细小的针头时可能造成的损伤。通过推动推杆使针头接头处充满液体，然后将液体排出至针筒上 200 µL 刻度处。
  9. 将一只已加热的小鼠（步骤 4.6）放入用于静脉注射的固定器中。小心地将 200 µL 细胞悬液注射入小鼠尾静脉。推注过程持续约 2 秒，注射完成后保持针头插入状态约 2 秒。这可确保在拔出针头前，细胞已充分远离注射部位。
  10. 如有需要，用无菌纱布擦拭小鼠尾巴以清除可见血液。将小鼠放回其非加热的原饲养笼中。对剩余小鼠重复注射操作。

5. 用于分析的血液采集与处理

注意：在人干细胞移植后3–5个月，可通过流式细胞术评估外周血中的人类细胞植入情况。

  1. 采用本机构动物 care 和使用委员会（IACUC）批准的技术从小鼠采集血液样本。
  2. 将最多 70–100 µL 的血液收集到无菌 PCR 微离心管中，管内预先加入 10 µL 的 0.5 M EDTA（pH = 8.0），以防止血液凝固。

6. 通过流式细胞术评估人源细胞植入情况

  1. 将 40–50 µL 血液转移至流式管中。
  2. 加入 5 µL Fc 受体阻断液，以防止抗体非特异性结合，室温孵育 10 分钟。
  3. 加入含以下小鼠抗人抗体的混合液：CD4（克隆 SK3）BUV 496、CD8（克隆 RPA-T8）BV421、CD3（克隆 OKT3）FITC、CD19（克隆 sj25c1）PE-Cy7、CD45（克隆 2D1）APC（表 4），避光室温孵育 30 分钟进行染色。荧光染料的选择应基于现有流式细胞仪可检测的参数，无需进行补偿矩阵校正。
  4. 向每管中加入 2 mL 适当的红细胞裂解缓冲液，以裂解红细胞。使用专为抗体染色后红细胞裂解设计的裂解缓冲液（参见材料表中的合适示例）。短暂涡旋震荡，确保细胞在裂解液中均匀分布，室温孵育 10 分钟。细胞均匀分布至关重要。
  5. 加入 2 mL FACS 缓冲液以终止裂解反应。
  6. 室温下以 300 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞。
  7. 倾去上清液，轻轻涡旋震荡直至细胞完全重悬。
  8. 加入 3 mL FACS 缓冲液，室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
  9. 倾去上清液，重悬细胞。
  10. 使用适当的流式细胞仪采集样本数据，并用相应软件进行分析（材料表）。代表性分析结果见图 2 和 图 3。

7. 阴道内 HIV 暴露

注意：用于小鼠阴道内暴露的病毒可通过先前发表的方案制备17。病毒应保存在 -80 °C 环境中，并在运输过程中使用干冰保存，遵循当地批准的操作规程。在对小鼠进行暴露前，病毒需一直保存在干冰上。在暴露前可将病毒稀释至基础 RPMI 培养基中（避免使用含抗生素或血清添加剂的 RPMI），以达到所需的浓度（本实验中阴道内暴露使用了 21,400 IU）。稀释后，整个操作过程中应将稀释的病毒储存在湿冰上，避免反复冻融，因为一旦解冻后再放回干冰会导致冻融循环。

  1. 在将小鼠或病毒带入生物安全柜之前，按照图4所示准备所有设备和生物安全柜工作区域（类似于步骤4.2）。
    1. 将加热灯的焦点置于工作区中央，即小鼠在HIV暴露过程中所处的位置。加热灯可防止小鼠体温下降。也可使用其他控温设备（例如加热凝胶垫或循环温水毯），具体应遵循当地IACUC规定18。
    2. 将无菌的20 µL移液器吸头和相应的移液器带入生物安全柜内。在柜内放置一个装有液体消毒剂（材料表）的容器，用于立即灭活与病毒接触过的材料和液体。
  2. 将一只小鼠放入含有3%异氟烷气体和纸巾的麻醉 chamber 中。该浓度的气体可在2–4分钟内使动物进入麻醉状态。与所有用于免疫缺陷小鼠的材料一样，麻醉装置在使用前必须经过适当消毒。
  3. 待小鼠麻醉后，将其转移至加热灯下的无菌蓝色垫上。将小鼠鼻部插入持续供给3%异氟烷气体的面罩中以维持麻醉状态。用手握住小鼠尾根部，使其腹部朝上，手掌支撑其背部，如图4所示。
  4. 使用无菌移液器吸头，从下向上轻轻擦拭生殖区域，刺激直肠排空，减轻对阴道的压力。
  5. 通过将小鼠尾巴缠绕在手指上，使阴道口自然张开，必要时可用无菌移液器吸头轻微推动，以充分暴露阴道开口。
  6. 更换移液器吸头，将20 µL病毒液轻柔地加入小鼠阴道内，避免产生气泡。切勿将吸头深入阴道内部；应在阴道口张开的情况下，将移液器吸头置于阴道口水平位置，避免插入过深，以防接种过程中造成擦伤，然后释放病毒液，让重力将其自然导入阴道内。或者，可使用Veselinovic等6所述的22 G 1.25 mm钝头直针。
  7. 接种后保持小鼠阴道朝上的体位5分钟，以防止病毒悬液因重力作用而泄漏。
    1. 小心将小鼠放回饲养笼中，注意使其仰卧放置。

8. 病毒载量分析前血液样本的处理

  1. 按照上述第5节所述方法采集血液。
  2. 将血液样本在室温下以500 × g 离心5分钟，以分离血浆和细胞。
  3. 取40 µL血浆转移至新的无菌、经PCR认证的微量离心管中，用于病毒载量测定，并于-80 °C保存至少1小时，待后续处理。在进行RNA提取前，所有样本均需先行冷冻，以避免因部分样本在RNA提取前未冷冻而导致RNA水平比较时引入偏差。
  4. 加入40 µL悬浮培养基（含2.5%牛血清白蛋白、50 U/mL青霉素G和链霉素、10 U/mL DNase，经0.22 µm滤膜无菌过滤），将血液体积调整至原始体积。
  5. 将调整后的血液体积中的15 µL转移至新的经PCR认证的微量离心管中。
  6. 加入1 mL 1×红细胞裂解液（材料表），涡旋混匀，在室温下孵育10分钟。
  7. 在室温下以9,600 × g 离心1分钟，使细胞沉淀。
  8. 吸除上清液，仅保留少量白色细胞沉淀，因为红细胞污染可能抑制PCR反应。
  9. 将细胞沉淀于-80 °C保存至少1小时，待后续处理。
    注：可选地，步骤8.4中剩余的任何血液均可按照上述第6步所述用于流式细胞术分析。

9. 使用蛋白酶K提取法进行DNA提取

  1. 使用蛋白酶K提取法从外周血细胞沉淀（在步骤8.8中制备）中提取DNA，具体方法如下所述。该方法已被证明可从小体积血液（如本研究中采用的系列血液采集所需样本量）中提取出最高的DNA产量19。
  2. 将25 μL蛋白酶K（20 μg/mL）加入1 mL 0.1 M Tris缓冲液中。
  3. 短暂涡旋混匀蛋白酶K溶液。
  4. 向每个待消化的细胞沉淀中加入50 μL蛋白酶K溶液。
  5. 通过移液反复吹打混匀，并确认细胞沉淀完全重悬。
  6. 在热振荡仪（材料表）中，于56 °C、400 rpm条件下振荡1小时。如有必要，用胶带将离心管固定以防止脱落。
  7. 立即在同一热振荡仪中，将温度升至95 °C并继续振荡20分钟，以灭活蛋白酶K。
  8. 涡旋混匀每个样品。
  9. 将各样品置于-80 °C条件下冷冻，时间不少于30分钟。
  10. 解冻后，在室温下以17,000 x g 离心1分钟，使不需要的细胞碎片沉淀。
  11. 将含有DNA的上清液转移至新的微量离心管中。
  12. DNA模板现已可用于PCR扩增。DNA模板可于-80 °C长期保存。

10. 病毒RNA的提取、cDNA合成及数字PCR定量

  1. 按照制造商的说明（材料表），使用病毒RNA提取试剂盒从解冻的小鼠血浆中提取RNA。
  2. 将样品加入柱后，增加一步柱上DNase处理，以确保彻底去除血浆样品中的所有DNA。
    1. 对于每个样品，在柱上加入95 µL无RNase的DNase溶液（将2 µL无RNase的DNase与98 µL反应缓冲液混合），室温孵育15分钟。
  3. 将RNA样品在-80 °C下保存至少1小时后再进行后续处理。RNA提取后必须冷冻所有样品，以避免未冷冻样品与已冷冻样品比较时引入偏差。
  4. 使用逆转录酶步骤合成cDNA，所用试剂如先前所述20。务必在cDNA反应中加入0.5 µL RNase抑制剂，以防止RNA降解。
    1. 按照表5中详述的程序进行cDNA合成。
  5. 将cDNA样品在-80 °C下保存至少1小时。cDNA合成后必须冷冻所有样品，以避免未冷冻样品与已冷冻样品比较时引入偏差。
  6. 按如下方法准备ddPCR样品20：
    1. 将3 µL cDNA样品与11 µL ddPCR探针混合液（不含dUTP）20、250 nM小沟结合探针以及每种正向和反向引物各900 nM混合，具体引物浓度见表6。
    2. 用无核酸酶水将PCR总反应体积调整至22 µL。
  7. 根据制造商的说明和先前的描述20，在液滴生成仪上使用探针用液滴生成油对PCR混合物进行乳化。
  8. 按照表7中详述的程序运行PCR。
    注意：此处显示的引物/探针序列和PCR程序是专门为灵敏检测HIV毒株RHPA4259而设计和优化的。引物和探针序列可轻松调整，以检测任何其他所需的HIV毒株。
  9. 在液滴读取仪上检测样品的液滴荧光信号，并根据制造商的说明使用相应软件分析结果。

11. 使用含cART饲料进行治疗

  1. 使用含有标准cART方案的颗粒饲料喂养小鼠，该饲料包含每千克4,800 mg的拉替拉韦（raltegravir, RAL）、720 mg的富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate, TDF）和520 mg的恩曲他滨（emtricitabine, FTC）21（表8）。这些剂量是基于小鼠体重为25 g、每日摄食量为4 g饲料的假设计算得出，相当于每日给予768 mg/kg RAL、2.88 mg/kg TDF和83 mg/kg FTC21。
  2. 使用由外部供应商（参见材料表）制备的含cART处方药饲料，其他公司也可能生产该配方。使用红色染色的cART饲料，以便与普通小鼠饲料轻易区分。
    1. 制备不含cART的标准棕色对照饲料，以便于区分。
  3. 开始cART治疗时，准备无菌小鼠笼，并加入含cART的饲料，然后将小鼠从旧笼转移至新笼。
    1. 通过视觉观察监测小鼠体重及含cART饲料的摄食情况，以确保小鼠适应该变化。

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结果

干细胞纯度分析的设门策略如图1所示。图1A–C显示了纯化的CD34+细胞群，图1D–F显示了CD34-流穿组分，用于说明在分离过程中仅有极少量CD34+细胞丢失。分离获得的CD34+干细胞纯度介于85%–95%之间，T细胞污染少于1%。图1G显示了一名成年健康对照供体（CCR5Δ32/wt基因型）的CCR5条带，随后为两名CCR5wt/wt基因型和一名CCR5Δ32/wt基因型干细胞供体的条带。在19名供体组成的群体中，CCR5Δ32/wt基因型的频率为15.8%（

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讨论

严重免疫缺陷小鼠品系 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac（NOG）小鼠极适用于人源细胞和组织的移植。这些小鼠的先天性和适应性免疫通路均存在缺陷。NOG和NSG小鼠均携带Prkdcscid 导致T细胞和B细胞功能缺陷的突变。此外，这些小鼠缺乏功能性白细胞介素-2受体γ链（common gamma chain, IL2rg），该链是多种关键细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21）结合复合物中不可或缺的组成部分。将人免疫系统移植到NOG等免疫缺陷小鼠体内，已成为研究HIV传播和免疫学的有力工具。利用人源化小鼠在这些领域所取得的研究进展已有大量综述。2,23,24,25,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢奥胡斯大学生物医学动物实验中心的工作人员，特别是Jani Kær女士在小鼠品系维护及体重监测方面所做的工作。作者感谢Florian Klein教授在制定标准护理cART方案以及研究指导方面提供的帮助。以下试剂由美国国家卫生研究院（NIH）艾滋病试剂项目、艾滋病研究部（NIAID，NIH）提供：来自John Kappes博士和Christina Ochsenbauer博士的pRHPA.c/2635（货号# 11744）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蓝色垫片VWR56616-031使用前应进行灭菌
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA8022
CD19（克隆号 sj25c1）PE-Cy7BD 生物科学557835
CD3（克隆OKT3）FITCBiolegend317306
CD3（克隆SK7）BUV395BD生物科学564001
CD34（克隆 AC136）FITCMiltenyi130-113-740
CD4（克隆SK3）BUV 496BD生物科学564652/51
CD45（克隆 2D1）APCBiolegend368511/12
CD8（克隆 RPA-T8）BV421BD生物科学562428
探针法ddPCR超级混合液（不含dUTP）伯乐（Bio-Rad）1863025
DMSO默克10,02,95,21,000
DNA酶SigmaD4263用于悬浮缓冲液
dNTP混合液Life TechnologiesR0192
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）BiowestL0615-500
EasySep 人脐带血 CD34 阳性选择试剂盒 II干细胞17896
EDTAInvitrogen15575-038
FACS溶血液 10XBD349202使用前用去离子水按1:10比例稀释
FACS 管（Falcon 5 mL 圆底）Falcon352052
Fc受体阻断液（Human Trustain FcX）Biolegend422302
胎牛血清SigmaF8192-500
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17144002
Flowjo v.10
纱布Mesoft157300使用前应进行灭菌
加热灯定制
血细胞计数板（Bürker-TürkVWRDOWC1597418
异氟烷气体Orion Pharma9658
LSR Fortessa X20 流式细胞仪BD
微量离心管，经PCR-PT认证Sarstedt72692405
小鼠cART食物ssniff Spezialdiäten GmbH定制产品
小鼠固定器定制产品
针头，Microlance 3，30G ½"BD304000
NOG小鼠 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTacTaconicNOG-F
无核酸酶水VWR 化学品436912C
Nucleospin 96 病毒 DNA 和 RNA 提取试剂盒Macherey-Nagel740691
经PCR验证的微量离心管Sarstedt72.692.405
青霉素-链霉素溶液 100XBiowestL0022-100
Phusion Hot Start II DNA聚合酶Life TechnologiesF549S
移液器吸头，无菌，ART 20P 防护型赛默飞世尔科技2149P
蛋白酶KNEB100005398
QuantaSoft 软件Bio-Rad
QX100 微滴生成仪伯乐（Bio-Rad）1886-3008
QX100 微滴读取仪伯乐（Bio-Rad）186-3003
红细胞裂解液Biolegend420301
无RNase的DNA酶F+反应缓冲液Macherey-Nagel740963
RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂赛默飞世尔科技10777-019
RPMIBiowestL0501-500溶于 H2O
Softject 1 mL 注射器Henke Sass Wolf5010-200V0
Superscript III 逆转录酶赛默飞世尔科技18080044
恒温混匀仪VWR89370-910
台盼蓝SigmaT8154
超纯 0.5 EDTA，pH 8.0赛默飞世尔科技15575-020
Virkon S（病毒消毒剂）杜邦7511

参考文献

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