基于TurboID的邻近标记法用于植物体内蛋白质-蛋白质相互作用网络的鉴定

摘要

本文介绍了一种用于鉴定Nicotiana benthamiana叶片组织中NLR免疫受体TIR结构域相互作用蛋白的邻近标记方法。同时提供了一份详细方案，可用于在Nicotiana及其他植物物种中利用该技术鉴定其他目标蛋白之间的相互作用。

摘要

利用工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX）的邻近标记（PL）技术 大肠杆菌 生物素连接酶BirA（即BioID）已成功用于鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。然而，该方法对有毒的过氧化氢（H₂O₂）的依赖带来了使用上的限制。₂O₂) 在基于 APEX 的邻近标记（PL）中，需要较长的生物素孵育时间（16–24 小时），而在基于 BioID 的邻近标记中，需要较高的孵育温度（37 °C），这些因素严重限制了它们在植物中的应用。最近报道的基于 TurboID 的邻近标记克服了 BioID 和 APEX 的诸多局限性。TurboID 能够在仅 10 分钟内快速实现蛋白质的邻近标记 在室温（RT）条件下进行。尽管TurboID在动物模型中的应用已得到证实，但我们最近的研究表明，在植物中，与BioID相比，基于TurboID的邻近标记（PL）在标记目标蛋白邻近蛋白方面表现更优。本文提供了一种以核苷酸结合富亮氨酸重复蛋白（NLR）家族N端Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域为模型，用于鉴定蛋白质互作伙伴的分步实验方案。该方法包括载体构建、农杆菌浸润表达蛋白载体、生物素处理、蛋白质提取与脱盐、定量，以及通过亲和纯化富集生物素化蛋白。本文所述方案可轻松适用于研究植物中其他目标蛋白 烟草属 及其他植物物种。

引言

蛋白质相互作用（PPI）是多种细胞过程的基础。传统的蛋白质相互作用鉴定方法包括酵母双杂交（Y2H）筛选以及免疫共沉淀结合质谱分析（IP-MS）¹。然而，这两种方法均存在一些局限性。例如，Y2H筛选依赖于目标植物或动物物种的Y2H文库是否可获得，而构建此类文库耗时且成本高昂。此外，Y2H实验是在异源的单细胞真核生物酵母中进行的，可能无法真实反映高等真核细胞的细胞内状态。

相比之下，免疫共沉淀-质谱联用技术（IP-MS）在捕获瞬时或弱相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）方面效率较低，且不适用于丰度低或高度疏水的蛋白质。许多参与植物信号通路的重要蛋白质，例如类受体激酶（RLKs）或NLR免疫受体家族，通常表达水平较低，并常与其他蛋白质发生瞬时相互作用。因此，这极大地限制了对这些蛋白质调控机制的理解。

近年来，基于工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX）及突变体的邻近标记（PL）方法 大肠杆菌 生物素连接酶 BirA^R118G （称为 BioID）已被开发并用于蛋白质相互作用（PPIs）的研究^2,3,4PL 的原理是将目标蛋白与一种酶融合，该酶可催化生成....

方案

注意：方法的概述见图1。

1. 植物材料准备

1. 将N. benthamiana种子高密度种植于湿润土壤中，并在气候培养箱中培养，光照周期为16小时光照（约75 μmol/m²s）和8小时黑暗，温度保持在23–25 °C。
2. 约1周后，将每株幼苗小心移栽至4' x 4'的花盆中，并继续将幼苗置于同一培养箱中培养。
3. 在培养箱中继续培养植株约4周，直至植株生长至4–8片叶阶段，用于后续的农杆菌浸润实验¹⁵。

2. TurboID 融合蛋白的构建

1. 使用标准的分子克隆技术，将目标蛋白与 TurboID 融合（通过 Addgene 质粒 #107177 中的 PCR 扩增获得 TurboID）。在此实验中，我们选用 NLR 免疫受体的 N 端 TIR 结构域作为目标蛋白，并构建了在花椰菜花叶病毒 35S 启动子（p35S::TIR-TurboID）驱动下的 TIR-TurboID 融合蛋白。
   注意：TurboID 酶与目标蛋白的羧基末端或氨基末端融合，取决于具体的目标蛋白。通常情况下，对于细胞质蛋白，只要 TurboID 融合不影响目标蛋白的功能，两个....

结果

代表性数据基于所述实验方案的预期结果，改编自Zhang等人的研究¹¹。图1总结了在N. benthamiana中进行基于TurboID的邻近标记（PL）的操作流程。图2展示了在侵染的N. benthamiana叶片中目标蛋白的表达及生物素标记情况。图3显示，侵染叶片中生物素标记的蛋白质能够被高效富集，用于后续质谱分析。需要注意的是，在使用链霉亲和素-C1偶联磁珠富集生物素化蛋白后，捕获到了不同分子量大小的多种蛋白质，对富集产物进行Western印迹分析时观察到弥散条带（图3）。这一现象在近期发表的多项研究中均有报道^6,7,13

讨论

TurboID生物素连接酶是通过基于酵母展示系统的定向进化技术对BioID¹⁰改造而获得的。与其他邻近标记（PL）酶相比，TurboID具有多种优势。TurboID使得邻近标记技术可应用于其他模式生物系统，包括最适生长温度约为25 °C的果蝇和线虫¹⁰。尽管邻近标记技术已在动物系统中被广泛使用，但其在植物中的应用仍较为有限。本文所述方案提供了在模式植物弯孢状烟草（N. benthamiana）中建立基于TurboID的邻近标记技术的逐步操作流程，该植物已被广泛用于植物-病原体互作研究。本方案涵盖了叶片样品制备、游离生物素的去除、提取蛋白的定量以及生物素化蛋白的富集等步骤。

尽管动物细胞培养系统中的游离生物素可通过PBS缓冲液洗涤细胞而基本去除⁴，但叶片组织中的游离生物素无法通过简单的洗涤清除。最近一项研究表明，游离生物素会严重影响后续生物素化蛋白的富集效果¹¹。在本实验方案中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
721 分光光度计	Metash，中国制造	Q/SXFZ6	对于 OD600 测量
碳酸氢铵	Sigma	A6141-500G
生物素	Sigma	B4639-1G	50 mM 储存液
离心	Eppendorf	离心机 5702
离心	Eppendorf	Centrifuge 5417R
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11697489001
脱氧胆酸	Sigma	D2510-100G
DL-二硫苏糖醇（DTT）	VWR生命科学	0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65001	用于亲和纯化
EDTA	Sigma	E6758-500G
ELISA 板	康宁	Costar 3590
HEPES	Sigma	H3375-1KG
盐酸（HCl）	Fisher Scientific	A144S-212
Immobilon-P PVDF 膜	Millipore	IPVH00010	用于蛋白质印迹分析
8 M 氯化锂溶液（LiCl）	Sigma	L7026-500ML
低速冷冻离心机	Zonkia，中国制造	KDC-2046	用于脱盐
氯化镁六水合物（MgCl₂·6H₂O）2·6H2O	Sigma	M9272-500G
磁力架	Invitrogen	123.21D	用于珠子吸附
Multiskan FC 微孔板光度计	赛默飞世尔科技	N07710	对于OD595 测量
NP-40（IGEPAL CA-630）	Sigma	I8896-100ML
抗HA大鼠单克隆抗体	罗氏	11867423001
旋转混匀仪	Kylin-Bell 实验室仪器	WH-986	用于免疫沉淀
震荡培养箱	实验室，中国制造	ZQPZ-228
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S271-3
脱氧胆酸钠	Sigma	D2510-100G
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma	L4390-1KG
链霉亲和素-辣根过氧化物酶	Abcam	ab7403
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Trizma 碱	Sigma	T1503-1KG
涡旋	科学工业公司	G-560E
水套式培养箱	中国产的蓝豹	GHP-9080	对于 农杆菌 孵育
Zeba 脱盐柱	赛默飞世尔科技	89893	用于去除生物素