基于TurboID的邻近标记法用于植物体内蛋白质-蛋白质相互作用网络的鉴定

摘要

本文介绍了一种用于鉴定Nicotiana benthamiana叶片组织中NLR免疫受体TIR结构域相互作用蛋白的邻近标记方法。同时提供了一份详细方案，可用于在Nicotiana及其他植物物种中利用该技术鉴定其他目标蛋白之间的相互作用。

摘要

利用工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX）的邻近标记（PL）技术 大肠杆菌 生物素连接酶BirA（即BioID）已成功用于鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。然而，该方法对有毒的过氧化氢（H₂O₂）的依赖带来了使用上的限制。₂O₂) 在基于 APEX 的邻近标记（PL）中，需要较长的生物素孵育时间（16–24 小时），而在基于 BioID 的邻近标记中，需要较高的孵育温度（37 °C），这些因素严重限制了它们在植物中的应用。最近报道的基于 TurboID 的邻近标记克服了 BioID 和 APEX 的诸多局限性。TurboID 能够在仅 10 分钟内快速实现蛋白质的邻近标记 在室温（RT）条件下进行。尽管TurboID在动物模型中的应用已得到证实，但我们最近的研究表明，在植物中，与BioID相比，基于TurboID的邻近标记（PL）在标记目标蛋白邻近蛋白方面表现更优。本文提供了一种以核苷酸结合富亮氨酸重复蛋白（NLR）家族N端Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域为模型，用于鉴定蛋白质互作伙伴的分步实验方案。该方法包括载体构建、农杆菌浸润表达蛋白载体、生物素处理、蛋白质提取与脱盐、定量，以及通过亲和纯化富集生物素化蛋白。本文所述方案可轻松适用于研究植物中其他目标蛋白 烟草属 及其他植物物种。

引言

蛋白质相互作用（PPI）是多种细胞过程的基础。传统的蛋白质相互作用鉴定方法包括酵母双杂交（Y2H）筛选以及免疫共沉淀结合质谱分析（IP-MS）¹。然而，这两种方法均存在一些局限性。例如，Y2H筛选依赖于目标植物或动物物种的Y2H文库是否可获得，而构建此类文库耗时且成本高昂。此外，Y2H实验是在异源的单细胞真核生物酵母中进行的，可能无法真实反映高等真核细胞的细胞内状态。

相比之下，免疫共沉淀-质谱联用技术（IP-MS）在捕获瞬时或弱相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）方面效率较低，且不适用于丰度低或高度疏水的蛋白质。许多参与植物信号通路的重要蛋白质，例如类受体激酶（RLKs）或NLR免疫受体家族，通常表达水平较低，并常与其他蛋白质发生瞬时相互作用。因此，这极大地限制了对这些蛋白质调控机制的理解。

近年来，基于工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX）及突变体的邻近标记（PL）方法 大肠杆菌 生物素连接酶 BirA^R118G （称为 BioID）已被开发并用于蛋白质相互作用（PPIs）的研究^2,3,4PL 的原理是将目标蛋白与一种酶融合，该酶可催化生成不稳定的生物素化腺苷酸（bio-AMP）。PL 酶释放出游离的 bio-AMP，扩散至目标蛋白附近，从而在约 10 nm 半径范围内对邻近蛋白的伯胺基团进行生物素标记。⁵.

与传统的酵母双杂交（Y2H）和免疫共沉淀-质谱（IP-MS）方法相比，该方法具有显著优势，例如能够捕获瞬时或弱相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。此外，邻近标记（PL）技术可在目标蛋白所处的天然细胞环境中，对其邻近蛋白进行标记。不同的PL酶在应用于不同系统时各有其局限性。例如，尽管APEX相较于BioID具有更快的标记动力学，并已在哺乳动物系统中成功应用，但该方法需要使用有毒的过氧化氢（H₂O₂），因此不适用于植物中的邻近标记研究。

相比之下，基于 BioID 的邻近标记（PL）无需使用有毒的 H₂O₂，但其标记速率较慢（完成生物素化需要 18–24 小时），因此对瞬时蛋白质相互作用（PPIs）的捕获效率较低。此外，BioID 实现高效邻近标记所需的较高孵育温度（37 °C）会对某些生物体（如植物）引入外部胁迫⁴。因此，基于 BioID 的邻近标记在植物中的应用较为有限，目前仅有少数报道，包括在水稻原生质体、Arabidopsis 和 N. benthamiana 中的应用^6,7,8,9。最近报道的 TurboID 酶克服了 APEX 和基于 BioID 的邻近标记的缺陷。TurboID 表现出高活性，可在室温下 10 分钟内完成邻近标记¹⁰。基于 TurboID 的邻近标记已成功应用于哺乳动物细胞、果蝇和线虫¹⁰。最近，我们课题组及其他研究团队独立优化并拓展了基于 TurboID 的邻近标记技术在不同植物体系中的应用，包括 N. benthamiana 和 Arabidopsis 植物以及番茄毛状根^11,12,13,14。比较分析表明，TurboID 在植物邻近标记中的表现优于 BioID^11,14。该技术还通过鉴定出 NLR 免疫受体的多个新相互作用蛋白，证明了其在植物体内应用的稳健性¹¹，而该类蛋白通常难以通过传统方法获得其相互作用伙伴。

本方案阐述了基于TurboID的邻近标记方法 在植株内 通过描述NLR免疫受体N端TIR结构域相互作用蛋白的鉴定 N. benthamiana 植物。该方法可扩展至任何感兴趣的蛋白质 N. benthamiana更重要的是，它为研究其他植物物种中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）提供了重要参考，例如 拟南芥、番茄及其他作物。

方案

注意：方法的概述见图1。

1. 植物材料准备

1. 将N. benthamiana种子高密度种植于湿润土壤中，并在气候培养箱中培养，光照周期为16小时光照（约75 μmol/m²s）和8小时黑暗，温度保持在23–25 °C。
2. 约1周后，将每株幼苗小心移栽至4' x 4'的花盆中，并继续将幼苗置于同一培养箱中培养。
3. 在培养箱中继续培养植株约4周，直至植株生长至4–8片叶阶段，用于后续的农杆菌浸润实验¹⁵。

2. TurboID 融合蛋白的构建

1. 使用标准的分子克隆技术，将目标蛋白与 TurboID 融合（通过 Addgene 质粒 #107177 中的 PCR 扩增获得 TurboID）。在此实验中，我们选用 NLR 免疫受体的 N 端 TIR 结构域作为目标蛋白，并构建了在花椰菜花叶病毒 35S 启动子（p35S::TIR-TurboID）驱动下的 TIR-TurboID 融合蛋白。
   注意：TurboID 酶与目标蛋白的羧基末端或氨基末端融合，取决于具体的目标蛋白。通常情况下，对于细胞质蛋白，只要 TurboID 融合不影响目标蛋白的功能，两个末端均可接受。然而，对于定位于膜上的蛋白，在确定 TurboID 融合位点之前，应预先明确该蛋白的拓扑结构。
2. 在同一启动子下构建 TurboID 融合的柠檬黄色荧光蛋白（citrine），作为后续定量蛋白质组分析的对照。
   注意：构建 TurboID 融合对照对于鉴定与目标蛋白邻近的蛋白质组至关重要。TurboID 融合对照的表达水平应与 TurboID 融合目标蛋白相近，可通过农杆菌浸润过程中调整农杆菌（Agrobacterium）浓度来经验性地优化。此外，对照蛋白的亚细胞定位模式应与目标蛋白相似。

3. 农杆菌浸润

1. 质粒转化 农杆菌
   1. 将步骤 2.1 和 2.2 中获得的质粒各 0.5 μg 加入 50 μL 的 根癌农杆菌 GV3101 感受态细胞，按先前所述方法制备¹⁶.
      注意：其他 农杆菌 菌株（如 GV2260）也可使用。
   2. 冰上孵育30分钟。
   3. 在42 °C水浴中热激60秒。
   4. 加入400 μL LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl；pH = 7.0）至 农杆菌 在28 °C下孵育90分钟。
   5. 将试管中的全部内容物接种于添加了适当抗生素的LB琼脂平板上，以筛选质粒，并用于后续实验 农杆菌 （对于GV3101：50 mg/L庆大霉素和50 mg/L利福平）。
   6. 在28 °C下孵育平板36–48小时，直至出现可见的单菌落。
2. 挑取数个单菌落，在含抗生素的新鲜LB琼脂平板上划线（见步骤3.1.5），于28 °C过夜培养。
   注意：对菌落进行PCR以确认特定双元载体的存在更为理想 农杆菌根据我们的经验，超过95%的菌落含有导入的双元载体。
3. 接种3 mL含适当抗生素（见步骤3.1.4）的LB培养基 农杆菌 含有目标构建体的菌落，于28 °C振荡培养过夜，直至OD₆₀₀ 的 农杆菌 培养物达到2.0。
4. 将细胞在 3,000 x g 并重悬至OD₆₀₀ = 1.0，置于农杆菌浸润缓冲液（10 mM MgCl₂）中₂，10 mM MES（pH = 5.6），250 μM 乙酰丁香酮。
   注意：尽管在农杆菌浸润前于室温下将接种物孵育2小时为最佳条件，但根据我们使用GV3101菌株的经验，目标蛋白的表达水平在孵育与未孵育之间差异并不显著 与 无需孵育。
5. 使用1 mL无针注射器将接种物注入完全成熟叶片的（远轴面）表皮 N. benthamiana 叶片
   注意：为准备三个生物学重复所需的足够叶片材料，通常每株植物注射三片叶片，每片完整的叶片均进行注射，每个载体使用三至四株植物。每片叶片注射1.5–2.0 mL重悬的农杆菌菌液即可。
6. 接种后36小时（hpi），用200 μM生物素（溶于10 mM MgCl₂）进行浸润₂ 将溶液注入已用TurboID质粒预浸润的叶片中。
7. 在按照第4节所述收获叶片组织之前，将植物继续培养3–12小时。
   注意：选择在感染后36小时进行生物素渗透的原因是，根据以往研究，目标蛋白的表达在此时间点达到峰值¹¹建议确定目标蛋白表达达到最佳所需的时间。生物素渗透后的孵育时间取决于实验设计及所研究的目标蛋白。通常，3–12小时的生物素处理可使TurboID融合蛋白对目标蛋白邻近的大多数蛋白进行有效标记。

4. 叶片样品采集

注意：后续处理叶片样品时，应佩戴无菌手套，以避免样品受到角蛋白污染。所有试剂也应尽可能不含角蛋白。

1. 在叶柄基部切下浸润的叶片，去除叶脉，然后将叶片组织在液氮中迅速冷冻。
2. 使用研钵和研杵研磨叶片组织，并将叶片粉末储存于15 mL或50 mL离心管中，于-80 °C保存以备后续使用。
   注意：从不同植株中分别取三到四片叶片作为三个生物学重复。本方案可在此暂停。在进行后续步骤前，建议通过免疫印迹分析检测目标蛋白的表达及生物素化情况。典型的Western blot结果见图2。

5. 叶片总蛋白的提取

1. 取约 0.35 g 叶片粉末转移至 2 mL 离心管中。每个样品准备两管。
   注意：接触任何经液氮冷却的物体时，请佩戴手套。
2. 向 0.35 g 叶片粉末中加入 700 µL RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH = 7.5]，500 mM NaCl，1 mM EDTA，1% NP40 [v/v]，0.1% SDS [w/v]，0.5% 脱氧胆酸钠 [w/v]，1 mM DTT，1 片蛋白酶抑制剂混合物）。
3. 涡旋振荡管子 10 分钟。
4. 将样品置于冰上静置 30 分钟。
5. 每隔 4–5 分钟将离心管上下颠倒数次，以混匀内容物。

6. 通过脱盐去除游离生物素

注意：本步骤约需 50 分钟。

1. 平衡脱盐柱。
   1. 移除脱盐柱底部的密封盖，将柱置于一个50 mL离心管中。
   2. 在1000 × g、4 °C条件下离心2分钟以去除保存液，并确保盖子已松开。
   3. 将脱盐柱放入一个新的50 mL离心管中。用5 mL RIPA裂解缓冲液重复平衡3次，每次在1000 × g、4 °C条件下离心2分钟，并弃去穿流液。
   4. 将脱盐柱转移至一个新的50 mL离心管中，暂时保存于4 °C，以备后续使用。
2. 将步骤5.4中的离心管在16,500 × g、4 °C条件下离心10分钟，然后将两管中的上清液转移至一个新的2 mL离心管中。
3. 将1,500 µL蛋白提取物加至已平衡的脱盐柱（来自步骤6.1.4）树脂顶部。当蛋白提取物进入树脂后，再加入100 µL RIPA裂解缓冲液。
   注意：尽管从叶片中提取蛋白时使用了1,400 μL RIPA裂解缓冲液，但在蛋白提取和脱盐后总体积通常会略有增加。因此，按照步骤5.1和5.4所述合并每组样品后，每个样品至少可获得1,500 µL蛋白提取物。
4. 在1000 × g、4 °C条件下离心2分钟，随后将脱盐后的样品暂时置于冰上保存。

7. 使用 Bradford 法对脱盐后的蛋白质提取物进行定量

1. 配制每种梯度BSA溶液各50 µL：0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1 mg/mL。
2. 将脱盐后的蛋白质提取物稀释：取5 µL样品与45 µL的ddH₂O混合。
3. 通过将5x Bradford试剂（含100 mg考马斯亮蓝G250、47 mL甲醇、100 mL 85%磷酸和53 mL ddH₂O）稀释来制备1x Bradford试剂。
4. 将每种梯度BSA溶液50 µL以及稀释后的蛋白质提取物50 µL分别加入2.5 mL的1x Bradford试剂中。
5. 室温孵育10分钟。
6. 将每份样品溶液200 µL加入ELISA板的一个孔中（每个样品设三个技术重复）。
7. 使用酶标仪测定OD₅₉₅。
8. 根据梯度BSA溶液的测定值绘制标准曲线，并计算脱盐蛋白质样品的浓度。通常，从0.7 g叶片中获得的总蛋白浓度范围为3–6 mg/mL。
9. 为后续亲和纯化准备6–8 mg脱盐蛋白质提取物。

8. 生物素化蛋白的富集

1. 取 200 µL 链霉亲和素-C1 偶联的磁珠至 2 mL 离心管中。
2. 用 1 mL RIPA 裂解缓冲液在室温下平衡链霉亲和素-C1 偶联磁珠 1 分钟。
3. 每次洗涤后，将磁珠置于磁力架上吸附 3 分钟，然后用移液器轻轻吸除上清液。
4. 重复步骤 8.2 和 8.3。
5. 将脱盐后的蛋白提取物转移至已平衡的链霉亲和素-C1 偶联磁珠中。
6. 将离心管置于 4 °C 条件下，在旋转仪上孵育 12 小时（或过夜），以亲和纯化生物素化蛋白。
7. 将离心管置于磁力架上室温静置 4 分钟，直至磁珠吸附至管壁一侧，然后用移液器轻轻吸除上清液。
8. 向离心管中加入 1.7 mL 洗涤缓冲液 I（水中含 2% SDS），在室温下置于旋转仪上孵育 8 分钟。重复步骤 8.3。
9. 向离心管中加入 1.7 mL 洗涤缓冲液 II（50 mM HEPES：pH = 7.5，500 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% 脱氧胆酸钠 [w/v]，1% Triton X-100），在室温下置于旋转仪上孵育 8 分钟。重复步骤 8.3。
10. 向离心管中加入 1.7 mL 洗涤缓冲液 III（10 mM Tris-HCl：pH = 7.4，250 mM LiCl，1 mM EDTA，0.1% 脱氧胆酸钠 [w/v]，1% NP40 [v/v]），在室温下置于旋转仪上孵育 8 分钟。重复步骤 8.3。
11. 加入 1.7 mL 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH = 7.5）以去除去垢剂，然后重复步骤 8.3。
12. 将磁珠转移至新的 1.5 mL 离心管中，并重复步骤 8.11 和 8.3。
13. 用 50 mM 碳酸氢铵缓冲液在室温下洗涤磁珠 6 次，每次 5 分钟。
14. 向磁珠中加入 1 mL 50 mM 碳酸氢铵缓冲液并充分混匀。
15. 取 100 µL 磁珠用于免疫印迹分析，以确认生物素化蛋白的富集效果。典型的 Western 印迹结果见 图 3。
16. 将剩余的蛋白样品迅速冷冻，并于 -80 °C 保存，或立即置于干冰上送至实验室进行 LC-MS/MS 分析。
    注：典型的质谱结果已在先前发表的文章中展示（Zhang et al. 2019；图 2，补充数据 1 和补充数据 2）¹¹。完整数据集可通过标识符 MSV000083018 和 MSV000083019 在 MassIVE（网址：<http://massive.ucsd.edu>）获取。

结果

代表性数据基于所述实验方案的预期结果，改编自Zhang等人的研究¹¹。图1总结了在N. benthamiana中进行基于TurboID的邻近标记（PL）的实验流程。图2展示了在侵染的N. benthamiana叶片中目标蛋白的表达及生物素标记情况。图3显示，侵染叶片中生物素标记的蛋白质能够被高效富集，用于后续质谱分析。需要注意的是，在使用链霉亲和素-C1偶联磁珠富集生物素化蛋白后，捕获到多种不同分子量的蛋白，对富集产物进行Western印迹分析时观察到弥散条带（图3）。这一现象在近期发表的多项研究中均有报道^6,7,13,

讨论

TurboID生物素连接酶是通过基于酵母展示系统的定向进化技术对BioID¹⁰改造而获得的。与其他邻近标记（PL）酶相比，TurboID具有多种优势。TurboID使得邻近标记技术可应用于其他模式生物系统，包括最适生长温度约为25 °C的果蝇和线虫¹⁰。尽管邻近标记技术已在动物系统中被广泛使用，但其在植物中的应用仍较为有限。本文所述方案提供了在模式植物弯孢状烟草（N. benthamiana）中建立基于TurboID的邻近标记技术的逐步操作流程，该植物已被广泛用于植物-病原体互作研究。本方案涵盖了叶片样品制备、游离生物素的去除、提取蛋白的定量以及生物素化蛋白的富集等步骤。

尽管动物细胞培养系统中的游离生物素可通过PBS缓冲液洗涤细胞而基本去除⁴，但叶片组织中的游离生物素无法通过简单的洗涤清除。最近一项研究表明，游离生物素会严重影响后续生物素化蛋白的富集效果¹¹。在本实验方案中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
721 分光光度计	Metash，中国制造	Q/SXFZ6	对于 OD600 测量
碳酸氢铵	Sigma	A6141-500G
生物素	Sigma	B4639-1G	50 mM 储存液
离心	Eppendorf	离心机 5702
离心	Eppendorf	Centrifuge 5417R
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11697489001
脱氧胆酸	Sigma	D2510-100G
DL-二硫苏糖醇（DTT）	VWR生命科学	0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65001	用于亲和纯化
EDTA	Sigma	E6758-500G
ELISA 板	康宁	Costar 3590
HEPES	Sigma	H3375-1KG
盐酸（HCl）	Fisher Scientific	A144S-212
Immobilon-P PVDF 膜	Millipore	IPVH00010	用于蛋白质印迹分析
8 M 氯化锂溶液（LiCl）	Sigma	L7026-500ML
低速冷冻离心机	Zonkia，中国制造	KDC-2046	用于脱盐
氯化镁六水合物（MgCl₂·6H₂O）2·6H2O	Sigma	M9272-500G
磁力架	Invitrogen	123.21D	用于珠子吸附
Multiskan FC 微孔板光度计	赛默飞世尔科技	N07710	对于OD595 测量
NP-40（IGEPAL CA-630）	Sigma	I8896-100ML
抗HA大鼠单克隆抗体	罗氏	11867423001
旋转混匀仪	Kylin-Bell 实验室仪器	WH-986	用于免疫沉淀
震荡培养箱	实验室，中国制造	ZQPZ-228
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S271-3
脱氧胆酸钠	Sigma	D2510-100G
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma	L4390-1KG
链霉亲和素-辣根过氧化物酶	Abcam	ab7403
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Trizma 碱	Sigma	T1503-1KG
涡旋	科学工业公司	G-560E
水套式培养箱	中国产的蓝豹	GHP-9080	对于 农杆菌 孵育
Zeba 脱盐柱	赛默飞世尔科技	89893	用于去除生物素