本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。
本文内容
摘要
摘要
研究蛋白质的多种翻译后修饰（PTM）是理解PTM之间串扰并更全面揭示蛋白质功能的关键步骤。尽管多PTM富集研究具有重要意义，但目前仅有少数研究能够同时分析一种以上的PTM，部分原因在于开展多次全局蛋白质组学分析所需的高昂成本、耗时以及大量蛋白质样本需求。本方案中详述的“"一步法"亲和富集策略克服了这些障碍，能够在样本投入量极低的情况下，同时实现对含有乙酰化和琥珀酰化PTM的赖氨酸残基肽段的鉴定与定量。该方案包括从小鼠肝脏（SIRT5基因敲除小鼠）制备蛋白裂解液、进行胰蛋白酶消化、PTM富集，以及采用数据非依赖性采集（DIA）工作流程进行质谱分析。由于该工作流程允许从同一样本中同时富集两种PTM，因此为研究PTM之间的串扰提供了实用工具，无需大量样本，并显著缩短了样本制备、数据采集和分析所需的时间。该工作流程中的DIA组分可提供全面的PTM特异性信息，这在研究PTM位点定位时尤为重要，因为DIA能够提供完整的碎片离子谱图，可通过计算方法解析以区分不同PTM定位的异构体形式。
引言
大量翻译后修饰通过影响蛋白质的活性1、信号传导2以及周转过程3,4，动态调控蛋白质和信号通路。例如，蛋白激酶可通过添加磷酸基团被激活或失活5，组蛋白乙酰化及其他修饰则提供了改变染色质结构并作为转录调控机制的途径6,7。近年来，越来越多的证据表明，多种翻译后修饰协同作用或相互竞争，共同调控蛋白质功能或活性8,9,10,11。因此，理解翻译后修饰之间的串扰已成为翻译后修饰研究中的新兴需求。然而，目前大多数可用于鉴定和定量翻译后修饰位点的蛋白质组学工作流程主要集中于单一修饰，而非多种修饰之间的相互作用。本文所述的工作流程旨在关联特定蛋白质修饰"热点区域"以及被多种不同翻译后修饰所修饰的赖氨酸残基。
科学界日益需要可行的方法来同时研究多种蛋白质翻译后修饰（PTM）12。目前大多数用于全局鉴定和定量多种类型PTM位点的方法均面临挑战，主要由于成本高昂且所需组织量较大12,13。多PTM富集实验不仅在样品制备、数据采集和数据分析方面耗时较长，而且这类研究通常需要大量蛋白质，其用量往往难以满足11。本文描述了一种可同时富集和分析多种PTM的实验方案，该方案克服了上述多项障碍，能够实现大规模PTM谱型分析，并评估不同PTM之间的相互作用14。这一“单管”工作流程为生物医学研究人员提供了一种实用方法，可在全球范围内对多种PTM进行谱型分析，识别共修饰肽段，并以高效且经济的方式研究PTM间的相互调控14,15。
本文通过研究线粒体蛋白质酰化修饰来展示该方法，此类修饰的探索最早可追溯到50多年前16。本研究特别聚焦于赖氨酸乙酰化17和琥珀酰化18，包括这些修饰在蛋白质上的共存现象，甚至在肽段水平上的共修饰。由于本研究采用了Sirtuin 5（SIRT5）基因敲除小鼠模型，因此选择重点富集乙酰化和琥珀酰化位点。这一决策的依据在于，琥珀酰化位点是SIRT5去琥珀酰化酶的作用靶点，预期在基因敲除小鼠中会显著上调，因而成为本研究中最相关的翻译后修饰（PTM）。这两种PTM均具有重要的生物学意义，Carrico等人最近对此进行了综述19。总体而言，乙酰化在基因表达和代谢调控中发挥重要作用，而琥珀酰化已被报道可调节心脏的代谢与功能20。
所述方案可在蛋白起始材料用量较低的情况下进行（例如，1 mg 蛋白裂解液），并通过缩短样品处理、质谱采集和数据分析所需时间，显著减少实验总时长。实验流程示意图见图1。我们还尝试使用更少的起始材料（低至100 µg蛋白裂解液，并相应减少磁珠用量），虽然如预期般会降低鉴定出的酰化肽段的总体得率，但仍可获得高度有价值的结果以及可定量的酰化肽段。
尽管所谓的自上而下（top-down）或中间向下（middle-down）工作流程通常不采用蛋白酶解消化方法（从而保持单个蛋白质内多个翻译后修饰之间的连接性），本方案则聚焦于一种基于肽段的亲和富集方法，以提高翻译后修饰鉴定与定量的深度和灵敏度（图1）。此外，这种以肽段为中心的工作流程采用了现代质谱技术，包括：1）结合数据依赖性采集（DDA）生成谱图库；以及 2）采用数据非依赖性采集（DIA）在无标记工作流程中实现翻译后修饰的精确定量。
数据非依赖采集（DIA）工作流程通过全面碎裂所采样 m/z 范围内所有肽段信号，克服了典型数据依赖采集（DDA）扫描方案中存在的采样随机性21。这一特性在修饰位点定位方面也具有显著优势，因为它更易于获取有关肽段中具体哪些碎片离子发生修饰的信息。此外，DIA 工作流程能够对具有相同前体离子的低丰度翻译后修饰（PTM）肽段异构体进行鉴定和定量。DIA 方法还可以基于始终被全面检测的特异性对应碎片离子，确定肽段中特定的 PTM 修饰位点。然而，DDA 方法通常采用"动态排除"策略，避免对同一前体离子重复采集 MS/MS 谱图，从而可能遗漏低丰度的 PTM 异构体。
本文所述的同时富集策略非常适用于需要对多种翻译后修饰进行全局分析和定量、研究翻译后修饰间的相互作用以及理解翻译后修饰动态交互关系的研究。已有研究通过以下方法在单一整合工作流程中实现多种富集翻译后修饰的鉴定：对含有翻译后修饰的蛋白水解肽段进行全局性、串联式或并行式富集，或者通过对完整蛋白质进行分析。与乙酰化和琥珀酰化的串联富集方法直接比较，一锅法的富集效率已被证实非常相近14。这些替代性方案通常需要大量起始材料，耗时较长，且成本可能极为高昂。相比之下，一锅法提供了一种经济高效的方法，可用于同时富集多种翻译后修饰，并进行后续分析与鉴定。
小鼠肝脏组织取自SIRT5基因敲除小鼠，并在此作为起始材料。本实验方案也可用于来自不同组织或细胞培养实验的蛋白裂解液。该方案适用于从组织或细胞培养沉淀中获得的蛋白裂解液。
方案
本方案中描述的所有实验均遵循巴克研究所机构动物研究委员会的指导原则。
1. 从匀浆组织中提取蛋白质并用蛋白酶消化
- 用HPLC级水新鲜配制裂解缓冲液，终浓度为8 M尿素、50 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）、1 µM曲古抑菌素A（TSA）、20 mM烟酰胺、75 mM氯化钠（NaCl）和1×蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（PIC）。
- 向一个与珠磨匀浆器兼容的2 mL离心管中加入一颗无菌钢珠，然后将组织块（约豌豆大小）放入管中。加入裂解缓冲液（500 µL），短暂涡旋以确保缓冲液完全覆盖组织块（如有需要，可添加更多裂解缓冲液）。将离心管置于预冷的适配器中，确保匀浆器两侧适配器上的离心管保持平衡。
- 在4 °C条件下，以25 Hz频率匀浆样品2次，每次3分钟。若组织未完全匀浆，可短暂离心后将已匀浆的裂解液转移至新标记的1.5 mL离心管中。向残留的组织块中加入额外裂解缓冲液，再次以25 Hz匀浆2次，每次3分钟。通常经过两轮匀浆即可充分破碎组织。
- 用镊子取出金属珠。每处理一个样品后，依次用HPLC级水、HPLC级甲醇和HPLC级水冲洗镊子。
- 若进行了两轮匀浆，合并匀浆后的裂解液，并使用超声破碎仪在4 °C、高功率条件下进行超声处理，共10个循环，每个循环30秒开启/30秒关闭。
- 在4 °C条件下，以14,000 x g离心10分钟，清除裂解液中的不溶物。将上清液（澄清裂解液）转移至新的1.5 mL微量离心管中，注意避免吸取上清液表面可能存在的脂质层以及管底的沉淀物。
- 采用二辛可宁酸（BCA）法测定澄清裂解液的蛋白浓度，需进行适当稀释（例如1:20和/或1:200）。根据BCA检测结果，从每个样品中取1 mg蛋白分装。
- 在37 °C、1,400 rpm振荡条件下，使用4.5 mM二硫苏糖醇（DTT）还原蛋白30分钟。随后在室温（RT）避光条件下（置于抽屉或柜子中），用10 mM碘乙酰胺（IAA）烷基化蛋白30分钟。
注：可使用其他替代试剂，例如N-乙基马来酰亚胺（NEM）替代IAA。 - 向样品中加入50 mM TEAB，将尿素浓度稀释至2 M以下。取1 µL样品点于pH试纸上，确保稀释后样品的pH值在7.0–8.5之间。按胰蛋白酶与蛋白质量比1:50（wt/wt）加入胰蛋白酶，在37 °C振荡条件下过夜消化蛋白（约14–16小时）。
- 次日加入10%甲酸终止消化反应，使终浓度为1%甲酸。涡旋混匀并短暂离心。取1 µL样品点于pH试纸，确认消化产物pH为2–3。在室温下以1,800 x g离心15分钟，沉淀不溶性物质。
2. 通过大规模固相萃取对非富集的蛋白水解肽进行脱盐
- 获取可结合最多 10 mg 蛋白质的 C18 树脂柱。将这些柱子安装到真空装置中，以便在以下每个步骤中利用真空负压使液体通过柱子。每个肽样品指定使用一个独立的柱子。
- 向柱子中加入 800 µL 含 19.8% 水的 80% 乙腈（ACN）和 0.2% 甲酸溶液，并通过真空负压使液体流过柱子。重复此步骤一次，注意避免柱子完全干燥。
- 通过加入 800 µL 水中的 0.2% 甲酸溶液并利用真空负压使全部液体通过滤膜，对柱子进行平衡。重复此步骤两次。在真空负压下将肽样品加载至柱子中。再用 800 µL 水中的 0.2% 甲酸溶液在真空负压下洗涤肽样品两次。
- 在每个柱子下方放置 1.5 mL 微量离心管，用于收集最后一步洗脱的肽。在真空负压下，首先用 800 µL 含 19.8% 水的 80% 乙腈（ACN）和 0.2% 甲酸溶液，然后用 400 µL 相同溶液从柱子中洗脱肽。将去盐后的肽样品在真空浓缩仪中完全干燥（2–3 小时）。
3. 使用免疫亲和磁珠同时富集K-乙酰化和K-琥珀酰化肽段
- 将干燥的多肽重悬于 1.4 mL 冷的 1× 免疫亲和纯化（IAP）缓冲液中。涡旋混匀，确保 pH 约为 7。将样品在 10,000 ×g 离心 x g 4 °C下离心10分钟。可能会出现少量沉淀。
- 将多肽置于冰上备用，同时准备抗体-磁珠。取一管K-乙酰化和一管K-琥珀酰化抗体-磁珠悬液（每管悬液体积为100 µL），分别加入1 mL预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS），用移液器吹打混匀。将全部溶液转移至新的1.5 mL离心管中，在室温下使用微型离心机以30 s离心。
- 吸去 PBS，注意避免吸走任何珠粒。用 1 mL 冷的 1×PBS 重复洗涤 3 次，每次在室温下离心 30 秒，然后吸去 PBS。
- 将磁珠重悬于约 440 µL 的 PBS 中。每管 PTM 磁珠（由制造商提供，100 µL）取四分之一用于单管富集（每种固定化抗体，包括 K-乙酰化和 K-琥珀酰化抗体磁珠，约含 62.5 µg）。用移液器反复吹打混匀磁珠。吸取 100 µL 乙酰化赖氨酸抗体磁珠，转移至含 200 µL 预切枪头的离心管中，确保主混合液始终保持充分混匀状态。
- 用移液器吸取100 µL丁二酰-赖氨酸抗体磁珠加入管中，使每管中乙酰-赖氨酸抗体与丁二酰-赖氨酸抗体的体积相等。在微型离心机中离心30秒，用凝胶加样枪头吸去上清液（磁珠将变为白色）。
注意：每根试管底部应有相似的珠粒沉淀。 - 将重悬的肽溶液直接移液至洗涤后的磁珠上。注意避免接触任何沉淀（快速加入以防止磁珠干燥）。将肽与磁珠在4 °C下避光振荡孵育过夜。
4. 抗体磁珠结合肽段的洗脱
- 在 4 °C 条件下，以 2,000 x g 离心肽样品 30 秒。移除含有未结合肽的上清液，如需要可保存用于后续实验。向珠粒中加入 1 mL 冷的 1x IAP 缓冲液，通过倒置混合 5 次进行洗涤。在 4 °C 条件下，以 2,000 x g 离心 30 秒。吸除 IAP 溶液，并重复 IAP 洗涤步骤一次，共完成两次洗涤。
- 向珠粒中加入 1 mL 冷的 HPLC 级水，通过倒置混合 5 次。在 4 °C 条件下，以 2,000 x g 离心 30 秒。吸除水相。重复水洗步骤两次，共完成三次洗涤。再额外以 2,000 x g 在 4 °C 离心 30 秒，使管底残留的水分聚集。使用平头凝胶加样吸头吸除可能积聚的多余水分，注意避免吸走珠粒。
- 向珠粒中加入 55 µL 含 0.15% 三氟乙酸的水溶液。室温孵育 10 分钟，期间偶尔轻敲管底以混匀。在室温下使用微型离心机离心 30 秒。使用平头凝胶加样吸头收集洗脱的肽段，并暂时保存。
- 向珠粒中加入 45 µL 含 0.15% 三氟乙酸的水溶液。室温孵育 10 分钟，期间偶尔轻敲管底以混匀。在室温下使用微型离心机离心 30 秒。使用平头凝胶加样吸头收集第二次洗脱液，并与第一次洗脱液合并。
- 将合并后的洗脱肽段在室温下以 12,000 x g 离心 5 分钟，使可能残留的珠粒沉淀。将肽段溶液转移至新的 500 µL 离心管中。
注意：此步骤可暂停实验流程。
5. 富集肽段的脱盐
注意：为了使样品与含有 C18 树脂的吸头达到最佳结合效果，样品的 pH 应小于 4。使用含有 0.6 µL C18 树脂的 10 µL 吸头，并用 10 µL 移液器控制该吸头。
- 用移液器吸取10 µL乙腈加入C18吸头中以预润湿。将乙腈排入废液。重复此步骤两次。
- 用含0.2%甲酸的水溶液各10 µL清洗枪头3次以达到平衡。每次平衡后将溶液排入废液。
- 通过反复吸液和排液，将样品中的肽段加载到移液枪头中。用枪头对富集的肽段样品至少上下吹打20次，然后将枪头中剩余溶液排出。
- 用含有0.2%甲酸的水溶液10 µL清洗含有结合肽的枪头，将溶液排入废液。重复此步骤9次。
- 使用含有0.2%甲酸、50%乙腈和49.8%水的洗脱缓冲液，将肽段洗脱至新管中，体积为10 µL。在新管中反复吹打10 µL溶液15次。再用额外的10 µL洗脱缓冲液重复此步骤，将溶液反复吹打加入与前次洗脱相同的同一管中。
- 在真空浓缩仪中将肽段完全干燥（约20分钟）。用适量含0.2%甲酸的水溶液重新溶解干燥的肽段。
注意：此处可暂停本实验方案。
6. 使用 DDA 和 DIA 进行数据采集
注意：使用 DDA 和 DIA LC-MS/MS 方法分析样品，具体方法可根据可用的质谱仪器进行调整。此处样品采用与高分辨率质谱仪联用的纳米液相二维高效液相色谱系统进行分析。
- 使用高效液相色谱系统（HPLC）与基于芯片的HPLC平台，并直接连接至质谱仪（也可使用多种其他LC-MS配置和系统）。
- 采用反相HPLC-ESI-MS/MS分析样品
- 进样后，将肽段混合物转移至C18预柱芯片，并以流动相A在2 µL/min流速下洗脱10分钟以脱盐。随后将肽段转移至分析柱，在流动相A和B的2–3小时梯度下以300 nL/min流速进行洗脱。具体而言，使用线性梯度在80分钟内从5%流动相B升至35%流动相B。
- 接着在5分钟内将流动相B升至80%，保持80% B浓度8分钟，然后恢复至5% B并进行25分钟的重新平衡。
- 建立用于数据依赖性采集（DDA）的质谱仪器方法，并定义以下仪器扫描实验
- 实验1：对m/z 400–1,500范围内的母离子进行MS1扫描（累积时间为250 ms）。设定触发MS/MS扫描的离子强度阈值为200计数，适用于电荷态为2–5的离子。设定母离子的动态排除时间为60秒。
- 实验2：进行产物离子MS/MS扫描，MS2扫描范围为m/z 100–1,500（每个循环中每30次产物离子扫描的累积时间为100 ms）。设定碰撞能量扩散为CES = 5，然后选择"高灵敏度产物离子扫描模式"。
注：DDA方法将在每次循环的全扫描MS1之后，对丰度最高的30个母离子进行MS/MS谱图采集，总循环时间约为3.3秒。DDA采集数据将用于构建谱图库，具体方法见第7节。
- 建立用于数据非依赖性采集（DIA）的质谱仪器方法，并定义以下仪器扫描实验。
- 实验1：对m/z 400–1,250范围内的母离子进行MS1扫描（累积时间为250 ms）。
- 实验2：对64个可变SWATH窗口进行MS/MS产物离子扫描，MS2扫描范围为m/z 100–1,500（每个循环中每64次产物离子扫描的累积时间为45 ms）。设定碰撞能量扩散为CES = 10，然后选择"高灵敏度产物离子扫描模式"。
- 采用Schilling等人22所述的64个可变窗口DIA/SWATH采集策略，实现无标记定量分析，总循环时间约为3.2秒。简而言之，在该采集模式中，四极杆Q1不再仅传输狭窄的质量范围至碰撞池，而是以可变窗口宽度（5–90 m/z）在全质量范围（m/z 400–1,250）内逐步递进扫描，共分为64个SWATH段，每段累积时间为45 ms，总循环时间为3.2秒（包括一次累积时间为250 ms的MS1扫描）。
注：可变窗口宽度根据特定m/z范围内观察到的典型MS1离子流复杂程度，通过可变窗口计算器算法进行调整22（在"密集"的m/z范围内选择较窄窗口，在洗脱母离子较少的m/z范围内使用较宽窗口）。在其他质谱仪器平台上，也可采用不同的DIA窗口策略。
7. 数据分析
注意：某些数据分析设置应根据具体实验进行更改和调整。例如，所选择的蛋白质数据库（FASTA 文件）取决于样品来源的物种（此处为 Mus musculus）。以下描述的是对富集了乙酰化和琥珀酰化肽段的小鼠样品进行数据分析的过程。
- 使用 MS 数据库搜索引擎分析 DDA 采集数据。创建数据库搜索引擎方法，步骤如下：
- 对于样本描述参数：选择 "鉴定" 在“样本类型”下，选择 "碘乙酸" 下 "半胱氨酸烷基化"，选择 "胰蛋白酶" 在……下方 "消化" （假设在赖氨酸和精氨酸处发生C端切割），选择 "TripleTOF 6600" 在“仪器”下，于“特殊因素”中，勾选 乙酰化重点 和 琥珀酰化富集，并选择 Mus musculus 在物种下
- 针对特定处理参数：选择 "生物修饰" 在“ID Focus”下，选择 "SwissProt" 在“数据库”下，勾选 "彻底的身份验证" 在“搜索努力”下，选择 "0.05 (10%)" 在……下方 "检测蛋白阈值"，并检查 "运行错误发现率分析" 在……下方 "结果质量"保存搜索引擎方法，并使用生成的方法提交质谱原始文件以供数据库搜索引擎处理。
注意：在迭代过程中，搜索引擎会根据初始注释和结果自动对所有 MS 和 MS/MS 扫描进行重新校准。
- 点击 "导出肽段摘要" 搜索完成后，通过以下方式对所有肽段鉴定结果进行筛选： "置信度阈值" 在电子表格软件（如 Excel）中进行 99 次比较（错误发现率 [FDR] 为 1%）
- 在 "多肽概述" 电子表格文件，筛选所有包含 PTM 注释的肽段 "乙酰化" 和 "琥珀酰化" 在修饰列中进行修改，以生成仅展示酰化肽段及其相应蛋白质的结果报告。
- 为构建用于进一步处理DIA原始文件及进行相对定量分析的MS/MS谱图库，打开DIA定量分析软件。选择 "图书馆" 点击选项卡，然后（在页面底部）点击 "生成谱图库" 从 "数据库搜索引擎" 并打开数据库搜索引擎 FDR 报告 （自动生成的 *FDR.xlsx 文件），该文件是 DDA 原始文件数据库搜索过程的一部分。然后，单击 "下一步" 并选择 "库设置 架构" 和 "下一步"选择 "Uniprot_mouse_proteome" 作为数据库，然后单击 "下一步" 和 "goa_mouse" 作为基因注释（本体）文件。最后，单击 "完成"，光谱库将被生成。
注意：来自DDA原始数据文件的乙酰化和琥珀酰化肽段信息，包括MS1的前体离子扫描和MS2的碎片离子扫描，将被纳入谱图库中（包含保留时间、MS/MS碎裂模式等）。 - 使用DIA定量蛋白质组学分析软件对乙酰化和琥珀酰化水平进行相对定量分析，并生成包含候选翻译后修饰肽段的电子表格，用于后续数据分析。
- 打开DIA定量分析软件以分析和定量翻译后修饰（PTM）肽段，使用模板分析方案。该模板方案可在软件中通过选择相应选项获得 "视角设置" | "DIA 分析" | "BGS PTMs" （根据实验的不同，可能显著或稀少）。
注意：除了使用DIA定量分析软件中的BGS PTM分析模板外，也可根据以下说明手动设置所有与PTM相关的参数：1）在 "鉴定"，选择 "PTM 定位" （概率阈值 = 0.75）；2）在 "定量分析"，选择 "小肽分类" | "修饰序列"；以及 3）在 "分析后"，选择 "差异丰度分组" | "次要群组" （定量设置）。这些设置将激活PTM定位功能，从而使修饰肽段以独立条目列出，并在肽段水平上进行差异分析。 - 要开始定量分析，请选择 "管道" 标签，然后单击 "从文件设置DIA分析"，打开用于相对定量的MS DIA原始文件。选择 "分配谱库" 并选择上述构建的文库，点击 "加载" | "下一步". 选择 "BGS PTMs" 分析方案并点击 "下一步". 选择合适的数据库FASTA文件 "Uniprot_mouse_proteome" | "下一步"定义条件设置，将不同条件分配给样品，然后单击 "下一步"选择 "goa_小鼠" 作为基因注释（本体）文件并点击 "下一步". 查看分析概览（实验设置的摘要）并选择 "输出目录" | "完成"最后，单击 "运行流程" 进行无标记定量分析。
注意：DIA 定量分析软件中的统计模块可自动执行 FDR 分析，生成比较不同条件的热图和火山图，生成已鉴定和定量的肽段与蛋白质列表，并提供 Q 值以及不同条件间相对倍数变化。
- 打开DIA定量分析软件以分析和定量翻译后修饰（PTM）肽段，使用模板分析方案。该模板方案可在软件中通过选择相应选项获得 "视角设置" | "DIA 分析" | "BGS PTMs" （根据实验的不同，可能显著或稀少）。
- 作为替代方案，可使用软件去除DIA数据集的干扰，处理数据，并在导出乙酰化和琥珀酰化位点的提取峰面积后进行统计分析。
8. 修饰肽段的数据可视化及PTM位点定位评估
- 要打开生成的DIA定量分析，请依次选择 "分析" 选项卡和 "加载定量分析软件实验"（从已保存的实验中打开一个*.SNE文件）。浏览至*.SNE结果文件，然后选择 "打开"。
- 在左侧面板中，单击顶部第三个原始数据*.wiff文件左侧的箭头，以展开并查看所有64个SWATH片段。单击片段[428.7-437.3]左侧的箭头，展开该特定片段，并显示为此质量范围鉴定出的修饰肽段。单击三价肽段KQYGEAFEK[乙酰化]R。
注：默认情况下，右上方面板通常显示MS2的提取离子色谱图（XIC），下方面板显示MS1同位素包络的提取离子色谱图（XIC）- 在上方面板中，选择 "PTM定位图"；在下方面板中，选择 "PTM定位图"。
- 在PTM定位图中，选择顶部的肽段序列 "KQYGEAFEK[乙酰化]R"，其总PTM定位得分为18.32。单击左侧箭头展开视图，以查看支持离子和排除离子。单击 "支持离子" 旁边的箭头，然后选择离子 "y3 [+42]" 以高亮显示该特定离子，从而确认乙酰化位点位于肽段序列的K2位置。
- 在PTM定位图中，选择第二个肽段序列 "K[乙酰化]QYGEAFEKR"，其总PTM定位得分极低，仅为1。单击左侧箭头展开视图，以查看支持离子和排除离子。单击 "支持离子" 旁边的箭头，然后单击 "排除离子" 旁边的箭头，再选择若干碎片离子，以查看其提取离子色谱图和MS/MS谱图（图5）。
注：分配的PTM定位得分及视觉检查结果表明，正确的PTM异构体为KQYGEAFEK[乙酰化]R，而对于另一种可能的PTM异构体K[乙酰化]QYGEAFEKR，则无或仅有极少证据支持。
结果
图1 展示了实验流程的总体示意图，包括从小鼠肝脏中收获组织，取1 mg蛋白质用于胰蛋白酶消化蛋白质裂解液，将肽段与抗体偶联的磁珠孵育，上机进行质谱检测，最后利用多种定量蛋白质组学软件包（学术及商业软件）对数据进行DIA/SWATH分析。
图2A展示了与当前用于多PTM富集研究的其他方法相比，该工作流程的时间线以及所需样品和蛋白质的用量。与替代方法相比，一锅法所需时间缩短一半，样品数量也减少一半。与两种单PTM富集方法相比，一锅法所需的蛋白质用量也减少一半。
该方案已被证明是一种可行且经济有效的替代方法。 图2B 表明一锅法中修饰肽段面积的中位变异系数（CV）低于单一PTM富集和连续PTM富集方法。 图2C，D 表明，在比较单锅法PTM与单一PTM富集方法时，两种修饰在位点水平定量的相关性之间未显示出显著差异。在肽段水平和片段水平的相关性中也观察到相同结果。在比较单锅法与串联PTM富集方法时，上述三种相关性均呈现一致的观察结果。所有原始质谱数据及与Basisty等近期研究报告相关的处理后Excel结果表格14 可从 MassIVE (MSV00081906) 和 ProteomeXchange (PXD008640) 获取并下载。
总体而言，尽管抗体富集策略可能存在某些局限性，例如潜在的表位遮蔽或特异性有限，但本研究中使用的抗体是由独立制备的克隆混合而成，因此具有更广泛的特异性。
实验结果证明了检测和评估翻译后修饰串扰的可能性。图3展示了成功富集的数据，并提供了一个包含多种不同酰基化修饰的肽段示例，用以可视化翻译后修饰的串扰现象。图3A显示一条肽段在一个赖氨酸残基上发生乙酰化修饰，而在另一个赖氨酸残基上发生琥珀酰化修饰；图3B则显示同一条肽段的两个赖氨酸残基均发生了琥珀酰化修饰。这表明同一赖氨酸残基可被两种不同的酰基化基团修饰，提示在该位点可能存在修饰间的串扰。图4展示了如7.1–7.3节所述被鉴定为同时携带两种修饰的赖氨酸残基数量，进一步提示可能存在翻译后修饰串扰。
如图5所示，使用定量蛋白质组学软件处理DIA PTM数据集，可精确定位发生修饰的特定赖氨酸残基。这一概念称为位点定位，是分析潜在PTM串扰的必要步骤。图5展示了两种可能的异构体，以及每种异构体对应的确认离子和排除离子，这些离子可按照第8.1–8.3节（特别是步骤8.3.2和8.3.3）所述进行可视化和评估。基于这些信息，我们能够明确鉴定出原始样品中存在的两种异构体中的具体一种。经确认的异构体KQYGEAFEKacR的MS/MS谱图清晰显示，包含乙酰化赖氨酸残基的y离子（y2–y5）发生了42 m/z的质量偏移（乙酰基团的增量质量），从而确认了该肽段中发生修饰的特定赖氨酸残基。
图 1：PTM 一步富集的典型工作流程。 从小鼠（此处为肝脏）中采集 SIRT5 敲除（KO）和野生型（WT）组织，裂解蛋白质后用胰蛋白酶消化成肽段，并进行脱盐处理。随后使用琥珀酰化和乙酰化抗体磁珠组合通过免疫亲和法富集肽段。平行的质谱工作流程同时检测：1）全裂解液中少量蛋白表达变化（用于蛋白标准化）；以及 2）富集的含酰基肽段，用于酰化位点鉴定（DDA-MS）和定位，随后进行定量分析（DIA-MS）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：一锅法工作流程与替代方法的比较。（A）一锅法工作流程、串联PTM富集以及两次单独PTM富集在所需时间、成本和材料方面的比较。（B）一锅法工作流程、单独的乙酰赖氨酸PTM富集和单独的琥珀酰赖氨酸PTM富集之间的变异系数（CVs）比较。斯皮尔曼相关性分析比较了一锅法工作流程与单独PTM富集所获得的酰化肽峰面积：对应于（C）乙酰化位点和（D）琥珀酰化位点的log2峰面积结果的散点图。各子图中显示了回归斜率和相关系数14。每种条件下均处理了两个独立的生物学重复。本图经Basisty等14修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：赖氨酸残基乙酰化与琥珀酰化修饰之间的相互作用。 线粒体3-酮酰辅酶A硫解酶的胰蛋白酶肽段的MS/MS谱图，显示相同的氨基酸序列，但在两个赖氨酸残基上具有不同的翻译后修饰。(A) 肽段AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK的MS/MS谱图；(B) 肽段AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK的MS/MS谱图。本图改编自Basisty等14。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：乙酰化与琥珀酰化赖氨酸残基之间的重叠与相互作用——蛋白质复合物中的具体示例。（A）显示2,235个乙酰化位点与2,173个琥珀酰化位点之间重叠的维恩图。其中，943个位点同时存在乙酰化和琥珀酰化修饰。分析了SIRT5（去琥珀酰化酶）基因敲除小鼠的肝脏，鉴定出大量琥珀酰化位点，其丰度甚至高于正常小鼠肝脏中观察到的水平（修饰肽段的筛选条件为Q值<0.05）。（B）显示其亚基中同时含有乙酰化和琥珀酰化位点的蛋白质复合物所占百分比（红色粗线表示经Fisher精确检验确定的显著性）。（C）ATP合酶复合物示意图：红色标注的蛋白亚基表示含有乙酰化和琥珀酰化位点的亚基。该图改编自Basisty等14。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：定量蛋白质组学软件解析翻译后修饰（PTM）的肽段位点定位。 基于肽段的 MS/MS 碎裂，可以提供关于乙酰基所修饰的具体赖氨酸残基的信息。这展示了该软件在翻译后修饰位点定位方面提供有价值信息的能力。（A）赖氨酸残基修饰与翻译后修饰位点定位的两种可能性：KQYGEAFEKacR（左）和 KacQYGEAFEKR（右）。针对该肽段的每种可能的位点定位异构体，分别展示了“确认”和“排除”作用的碎片离子。根据这些信息，赋予确认得分和排除得分，从而确认样品中存在异构体 KQYGEAFEKacR。（B）对应于已确认异构体 KQYGEAFEKacR 的 MS/MS 谱图，显示所有包含乙酰化赖氨酸残基的 y 离子（y2 及更高）均携带 +42 m/z 的增量质量，这与乙酰化修饰相符。观测到的 b 离子则不包含该修饰。（C）提取的离子色谱图（XIC），其中 y2 和 y3 离子产生显著的峰面积，这两个离子共同构成了已确认异构体 KQYGEAFEKacR 中的乙酰化位点。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案描述了一种用于同时富集多种蛋白质翻译后修饰（PTM）的新技术，以更有效地理解PTM之间的相互作用。实现该目标的其他方法通常耗时过长、成本过高，并且需要大量蛋白质才能成功11,13。本方案提出了一种多PTM富集工作流程，通过将样本同时与两种PTM特异性抗体偶联的磁珠共同孵育，从而提高实验的整体效率。该方法还包括使用数据依赖性采集（DDA）生成谱图库，以及采用数据非依赖性采集（DIA）质谱技术进行检测和定量，以减少碎片离子的干扰22,23。对于DDA采集所得数据，可使用质谱数据库搜索引擎等软件进行分析与定量；而DIA采集所产生的复杂谱图则需借助定量蛋白质组学软件24及特定的DIA定量分析软件25进行解析。
本方案中有多个关键步骤需要严格遵循。由于本方案的主要目标是同时富集多种蛋白质翻译后修饰，抗体亲和富集步骤（第2节）对实验成功至关重要。在对磁珠进行洗涤时，必须确保不会意外吸走任何磁珠。在使用胰蛋白酶消化前（步骤1.8），必须确保尿素浓度已稀释至1 M。尽管在方案前期需要8 M尿素以实现蛋白质溶解，但高于1 M的尿素浓度会抑制胰蛋白酶的酶活性。此外，在整个实验过程中持续监测样品的pH值也非常重要，尤其是在消化反应之前。如果在孵育前样品和胰蛋白酶溶液的pH未被适当中和，可能导致消化效率低下，许多切割位点无法被识别，从而减少可鉴定的肽段数量。
在准备样品时，对实验方案进行一些修改可能会有所帮助。对于从1 mg起始材料中获得的蛋白裂解液，可使用每管PTM扫描管中提供的抗体珠的四分之一，作为节省成本的替代方案。只要相应地增加抗体珠的使用量，使用更多的起始材料可以获得更好的结果。另一种可优化流程的修改是，在胰蛋白酶之外，使用另一种蛋白酶对样品进行消化。该修改将导致被切割肽段的多样性增加，从而提高蛋白质残基的覆盖度。尽管并非必需，但由于胰蛋白酶具有高度的切割特异性，建议在PTM分析中将其作为所用酶之一26。
本方案的一个局限性在于，所研究的翻译后修饰（PTMs）必须具有相似的化学性质，才能实现同时富集14。不同抗体偶联磁珠的操作步骤必须相似，需使用相似的溶剂和溶液，包括相似的洗脱条件，并且最好来自同一供应商。因此，本文所述方法始终以乙酰化和琥珀酰化为例进行说明，二者均使用抗体偶联磁珠（Cell Signaling Technology, Inc）。尽管该方法理论上可应用于任意数量的翻译后修饰，但仍需进一步研究以明确本方案在此方面的具体限制。此外，由于该方法基于抗体富集，因此只能对翻译后修饰位点进行相对定量。
与现有的多PTM富集方法相比，该实验流程是一种更可行且成本效益更高的替代方案。本实验观察到，该方法的效果与单独富集或串联富集等替代方法相比表现极为优异。图2B 显示，与单PTM富集和串联PTM富集相比，一锅法中修饰肽段峰面积的中位变异系数（CV）实际上有所降低13。我们进一步分析了乙酰化或琥珀酰化位点水平的定量结果。此外，Spearman相关性分析（图2C,D）表明，一锅法PTM富集与单PTM富集流程的表现相似，这一结果在肽段水平和碎片离子水平的相关性中也一致成立。在将一锅法与串联PTM富集进行比较时，三种相关性分析均得到相同结论。
本方案使研究人员能够以快速且经济高效的方式，对翻译后修饰（PTM）之间的相互作用获得引人入胜的生物学见解。该工作流程中的DIA组分可帮助研究人员更深入地理解PTM，因为它提供了位点定位信息，并克服了诸如PTM位点占有率低等挑战。在DDA模式下，前体离子往往被排除，这在研究PTM时尤为关键，因为位点占有率通常极低，导致这些肽段无法被选中进行MS/MS分析，但仍可能包含重要信息。后续实验可进一步评估该方法在同时富集PTM种类数量上的上限。未来对该工作流程的改进可能包括开发更先进的软件平台，以进一步实现位点定位和PTM位点占有率分析的自动化。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）共享仪器资助项目对Buck研究所TripleTOF系统的支持（1S10 OD016281）。本研究还获得了美国过敏与传染病研究所（NIAID，R01 AI108255，授予B.S.）以及美国糖尿病与消化道和肾脏疾病研究所（NIDDK，R24 DK085610，授予Eric Verdin；R01 DK090242，授予Eric Goetzman）的资助。X.X. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（T32GM8806，授予Judith Campisi和Lisa Ellerby）的支持；N.B. 获得了 Glenn 医学研究基金会博士后奖学金的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M 三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB） | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | T7408 | |
| 乙腈，Burdick and Jackson LC-MS 级 | Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国 | 36XL66 | |
| Bioruptor 超声波破碎仪 | Diagenode，德文斯维尔，新泽西州，美国 | B01020001 | |
| C18 预柱芯片（200 µm × 6 mm ChromXP C18-CL 芯片，3 μm，120 Å | SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉 | 5015841 | |
| C18-CL芯片（75 µm × 15 cm ChromXP, 3 µ米，300 Å) | SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉 | 804-00001 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D9779-5G | |
| Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG，德国汉堡 | T1317-1EA | |
| Eppendorf管（2.0 mL Safelock） | Eppendorf AG，德国汉堡 | 22363352 | |
| 甲酸 | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | F0507-500ML | |
| 保留时间（iRT）归一化肽段标准品 | Biognosys AG，瑞士苏黎世州施利伦 | Ki-3002-2 | |
| 碘乙酰胺（IAA） | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | I1149-25G | |
| mapDIA | 网页链接 | 用于去除DIA数据集干扰的软件 | |
| 甲醇，Burdick and Jackson LC-MS 级 | Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国 | BJLC230-4 | |
| PURELAB flex 1 超纯水 dispenser | VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 89204-088 | |
| Skyline 中的 mProphet | 整合至 Skyline | 用于FDR评估的集成统计算法 | |
| Oasis HLB SPE 小柱 | Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德 | WAT094225 | 用于脱盐蛋白质裂解液的层析柱，最多可处理50 mg样品 |
| 磷酸盐缓冲液 | Life Technologies | 10010023 | |
| Pierce BCA 法测定 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 23225 | |
| ProteinPilot 5.0 - 质谱数据库搜索引擎 | SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉 | 软件下载 SCIEX | 质谱数据库搜索引擎 |
| PTMScan 琥珀酰赖氨酸基序 [Succ-K] 试剂盒 #13764 | 细胞信号技术公司 | 13764 | 用于亲和富集的抗体磁珠 |
| PTMScan 乙酰化赖氨酸基序 [Ac-K] 试剂盒 #13416 | 细胞信号技术公司 | 13416 | 用于亲和富集的抗体磁珠 |
| 测序级冻干胰蛋白酶 | Life Technologies | 23225 | |
| Skyline - “定量蛋白质组学软件” | MacCoss 实验室（学术机构） | 开源软件 | 定量蛋白质组学软件（学术版） |
| Spectronaut - “DIA 定量分析软件” | Biognosys AG，瑞士苏黎世州施利伦 | Sw-3001 | DIA 定量分析软件 / 翻译后修饰位点定位 |
| 赛默飞世尔科技 Savant SPD131DDA Speedvac 浓缩仪 | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | SPD131DDA-115 | 用于浓缩样品液体体积的仪器 |
| TissueLyser II | Qiagen，德国希尔登 | 85300 | 用于组织高效裂解的仪器 |
| 三氟乙酸（TFA） | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | T6508-1L | |
| TripleTOF 6600：正交四极杆飞行时间（QqTOF）质谱仪 | SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉 | 按报价 | 高分辨率质谱仪 |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC 系统 | 美国马萨诸塞州弗雷明汉，SCIEX 公司 Eksigent 分部 | 型号 #845 | 色谱分离系统 |
| 尿素 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | PI29700 | |
| 水，Burdick and Jackson LC-MS | Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国 | 600-30-76 | |
| C18 ZipTip 吸头，P10 | 默克密理博有限公司，塔拉格林，卡里戈威，科克郡，爱尔兰 | ZTC18S096 | 用于肽混合物脱盐的C-18树脂预装小柱 |
参考文献
- Christensen, D. G., et al. Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions. Frontiers in Microbiology. 10, 1604(2019).
- Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. Post-translational modifications in signal integration. Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).
- Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases. Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).
- Swaney, D. L., et al. Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation. Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Mocciaro, A., Rape, M. Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control. Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).
- Lopez-Otin, C., Hunter, T. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer. Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).
- Du, Z., et al. DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination. Science Signalling. 3 (146), (2010).
- McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach. Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).
- Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).
- Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment. Proteomics. 18 (17), e1800123(2018).
- Wang, G., et al. Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation. Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Rardin, M. J., et al. Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).
- Rardin, M. J., et al. SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks. Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).
- Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications. Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).
- Sadhukhan, S., et al. Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).
- Collins, B. C., et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications. 8 (1), 291(2017).
- Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers. Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).
- Meyer, J. G., Schilling, B. Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques. Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Sticker, A., Martens, L., Clement, L. Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about. Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
重印与许可
