方法文章

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

DOI：

10.3791/60808

⸱

2020年4月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

转基因小鼠的应用对于理解基因功能和解析人类疾病潜在机制至关重要。CRISPR/Cas9 系统使研究人员能够以前所未有的效率、准确性和简便性对基因组进行修饰。利用该技术，研究人员正致力于建立一种快速、高效且操作简便的转基因小鼠制备方案。本文介绍了一种改进的一细胞胚胎冷冻保存方法，可显著提高冻融后胚胎的发育率。结合优化的电穿孔条件，该方案可在短时间内高效地获得低嵌合率的基因敲除和基因敲入小鼠。此外，我们逐步详细阐述了优化后的实验流程，涵盖 CRISPR 试剂制备、体外受精、一细胞胚胎的冷冻保存与复苏、CRISPR 试剂的电穿孔、小鼠品系建立以及 founder 小鼠的基因型鉴定。采用本方案，研究人员将能够以前所未有的便捷性、速度和效率制备转基因小鼠。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统是一项科学突破，可在基因组中实现前所未有的靶向修饰1。CRISPR/Cas9 系统由 Cas9 蛋白和向导 RNA（gRNA）组成，其中 gRNA 包含两个分子组分：靶点特异性的 CRISPR RNA（crRNA）和反式激活的 CRISPR RNA（tracrRNA）2。gRNA 将 Cas9 蛋白引导至基因组中的特定位点，该位点包含与 crRNA 互补的 20 个核苷酸序列，并紧邻原间隔序列邻近基序（PAM）。Cas9 蛋白结合靶序列后，诱导产生双链断裂（DSBs），这些断裂可通过易错的非同源末端连接（NHEJ）或高保真的同源定向修复（HDR）进行修复3,4,5。NHEJ 会导致插入和/或缺失（indels），当编码序列被靶向时，从而引起基因功能丧失。HDR 则在存在包含同源序列的修复模板时，实现精确的基因组编辑3,4,5。NHEJ 和 HDR 已分别被用于构建基因敲除和基因敲入小鼠模型。

尽管CRISPR/Cas9系统显著加快了高效且精准的转基因小鼠的制备，但应用这些方法的科研人员常面临技术上的挑战。首先，传统方案需要通过显微注射将CRISPR编辑工具导入受精卵的原核中6,7。该技术耗时较长，通常需要大量培训。因此，多个研究团队已用电穿孔技术取代显微注射8,9,10,11,12,13。然而，在早期的电穿孔方案中，需使用新鲜胚胎进行电穿孔，这带来了另一个问题，即每次实验前准备新鲜胚胎较为困难14。

近期，我们及其他研究者将冻融胚胎与电穿孔技术相结合用于基因组编辑，从而促进了转基因小鼠的制备15,16。该方案使不具备高级胚胎操作技能的研究人员也能高效、快速地构建人类疾病动物模型。该方案还显著降低了制备转基因小鼠过程中的实际困难，例如首建鼠（founders）中存在的遗传异质性问题16。为克服嵌合现象，我们在胚胎解冻后1小时内即进行CRISPR试剂的电穿孔操作，以确保基因编辑发生在基因组首次复制之前。另一项改进是使用Cas9蛋白而非Cas9 mRNA，以减少不必要的嵌合效应17。此外，我们开发了一种优化的一细胞胚胎冷冻保存方法，可提高胚胎发育至二细胞阶段的比率16：使用胎牛血清（FBS）可显著改善冻融卵母细胞受精后的存活率，其机制可能与提高冻融未受精卵母细胞抗逆性的作用机制相同18。

本文介绍了一种利用冻融胚胎制备转基因小鼠的综合实验方案，其中包括对单细胞C57BL/6J胚胎进行冷冻保存的改良方法。本方案涵盖以下步骤：1）gRNA设计、CRISPR试剂的制备与组装；2）单细胞胚胎的体外受精（IVF）、冷冻保存及解冻；3）将CRISPR试剂通过电穿孔导入冻融后的胚胎；4）将胚胎移植至假孕雌鼠的输卵管中；以及5）对F0代 founder 动物进行基因型鉴定和序列分析。

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方案

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本研究中所有动物护理和操作均按照《实验动物护理和使用指南》的规定和要求进行。实验方案已获得富山大学、东京大学、慈惠医科大学和马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所实验动物护理委员会的批准。所有试剂的相关信息见材料表。

1. CRISPR 试剂设计

  1. crRNA 设计
    1. 访问 CRISPR direct19（https://crispr.dbcls.jp/）以设计特异性高且脱靶位点较少的 crRNA。
      注意：还有许多其他有用的工具可用于设计 crRNA20（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/）。
    2. 输入目标核苷酸序列，并进行以下设置：
      PAM 序列要求 = NGG
      特异性检查 = 小鼠（Mus musculus）基因组，GRCm38/mm10（2011 年 12 月）
      注意：例如，为构建酪氨酸酶（Tyr）基因敲除小鼠，选择外显子 2（核苷酸序列 9476–9692）作为靶向区域。
    3. 点击 Design，为获得高度特异性的结果，勾选 Show Highly Specific Target Only。
    4. 为降低潜在的脱靶效应，应选择在 "12 mer+PAM" 和 "8 mer+PAM" 列中数值最低的靶序列。
      注意：这些列中的数值（"1"）表示该序列仅在目标位点有唯一完全匹配，大于 1 的数值则表明存在潜在的脱靶位点。
    5. 向 crRNA 合成公司订购所得的寡核苷酸（补充表 1）。
      注意：针对 Tyr 基因外显子 2，本研究使用的靶序列如下：GGACCACTATTACGTAATCC，其 PAM 序列为 +TGG（图 2A）。
  2. 用于 HDR 介导编辑实验的单链寡脱氧核苷酸（ssODN）设计（例如，用于构建基因敲入小鼠）。
    1. 设计 ssODN 的长度约为 80–180 bp，两侧包含 30–60 个核苷酸（nt）的同源臂。
      注意：长度为 75–85 nt 的 ssODN，包含 30–35 nt 的同源臂且与 gRNA 互补，已显示出较高的基因敲入编辑效率21。
    2. 在 PAM 序列处或若不可行时，在 PAM 序列的 5′ 邻近碱基处引入预期的修饰和沉默突变，以防止基因组编辑后被再次切割。
      注意：本研究中使用的 crRNA 和 ssODN 列于 补充表 1 中。

2. 体外受精、胚胎冷冻保存及冻融

  1. 体外受精
    1. 通过腹腔注射使4周龄或8周龄的C57BL/6J雌性小鼠超数排卵 孕马血清促性腺激素（PMSG）处理，48小时后注射7.5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
      注意：使用超数排卵技术可使排卵卵母细胞数量增加约3倍22.
    2. 从性成熟的 C57BL/6J 雄性小鼠（3–5 月龄）中取出附睾尾。
      注意：可以在不处死雄性小鼠的情况下收集精子。
    3. 用解剖针提取精子凝块，并将其孵育于200 µL人输卵管液滴中 液态（HTF）在CO中2 孵育器中孵育1.5小时以进行获能。
    4. 从hCG注射后16–18小时的输卵管中收集卵丘-卵母细胞复合体（COCs），并在新鲜的200 µL液滴中孵育 HTF 培养基覆盖石蜡油置于 CO₂ 培养箱中2 培养箱（5% CO₂）2，37 °C）孵育不超过2小时。
      注意：最好在麻醉状态下通过颈椎脱位处死小鼠，因为通过CO₂安乐死2 吸入影响体外受精与胚胎发育23.
    5. 将1–5 µL受精培养基界面处的精子悬液加入含有卵母细胞-冠丘复合体（COCs）的200 µL HTF培养基液滴中，并在CO₂培养箱中孵育2 3小时恒温培养箱培养。
    6. 用添加钾的简单优化培养基（KSOM）清洗卵母细胞3次，以去除残留的精子和卵丘细胞。
    7. 使用倒置显微镜检查原核形成情况及单细胞胚胎的等级。
  2. 单细胞胚胎的冷冻保存
    1. 将单细胞胚胎在含有20% FBS（不覆盖石蜡油）的200 µL HTF液滴中，于CO₂培养箱中孵育10分钟。2 培养箱
    2. 将20–100个胚胎转移至50 µL的1 M二甲基亚砜（DMSO）溶液中24.
    3. 将含有100个胚胎的5 µL溶液转移至冻存管底部，使用冷却器或冰上于0 °C冷却5分钟。
    4. 沿管壁缓慢加入45 µL DAP213溶液（含2 M二甲基亚砜、1 M乙酰胺和3 M丙二醇），盖紧管盖，于0 °C冰箱或冰上静置5分钟。
      注意：不要将管盖拧得过紧，以便在样本解冻时能够轻松打开。
    5. 将试管迅速置于液氮中保存。
  3. 胚胎解冻
    1. 打开冻存管盖，弃去残留的液氮，加入900 µL预热至37 °C的0.25 M蔗糖溶液。
      注意：0.25 M 蔗糖溶液必须预先加热至 37 °C，因为使用低温溶液会降低胚胎解冻后的存活率。
    2. 快速移液10次，将冻存管中的内容物转移至塑料培养皿中。
      注意：移液操作应小心进行，避免产生气泡，以免损伤胚胎。
    3. 用石蜡油覆盖的KSOM培养基将形态正常的受精卵清洗两次，并置于CO₂培养箱中2 孵育至电穿孔。

3. CRISPR 试剂的组装与电穿孔

注意：对于电穿孔，我们使用了先前描述过的铂板电极（高度：0.5 mm，长度：10 mm，宽度：3 mm，间隙：1 mm）和一种一步式电穿孔仪8（材料表）。也可使用两步式电穿孔仪（材料表）。

  1. CRISPR 试剂的准备与组装
    1. 订购 CRISPR 试剂（即 crRNA、tracrRNA 和 Cas9 蛋白），若进行 HDR 介导的编辑实验，还需订购 ssODN（材料表 和 补充表 1）。
    2. 按以下步骤配制退火溶液。
      1. 将 crRNA 和 tracrRNA 分别用低血清最低必需培养基溶液配制成 1 μg/µL（材料表），各取 6 µL 加入 42 µL 无核酸酶缓冲液中。
      2. 将混合液在干式加热器中 95 °C 孵育 3 分钟，随后在室温冷却 5 分钟。
      3. 将 HiFi Cas9 蛋白用 Opti-MEM I 稀释至 1 μg/µL，取 6 µL 加入上述混合液中，总体积为 60 µL。
      4. 若进行 HDR 介导的编辑实验，加入 6 µL 浓度为 1 μg/µL 的 ssODN。由于最终体积应为 60 µL，因此在步骤 3.1.2.1 中使用 36 µL 无核酸酶水。
        注：crRNA、tracrRNA、Cas9 蛋白和 ssODN 的最终浓度均为 100 ng/µL。
      5. 将最多 100 个胚胎转移至 25 µL 的最终混合液（RNP 复合物）中，置于单孔载玻片上，在 37 °C 孵育 10 分钟。
  2. 电穿孔
    1. 用 6 µL 新配制的 CRISPR 试剂混合液填充电极间隙，并将 20–25 个胚胎加入该混合液中。
      注：应避免胚胎与电穿孔电极接触，以防电脉冲过程中损伤胚胎。
    2. 使用单步型电穿孔仪时，设置如下条件进行电穿孔：
      电压：25 V，脉冲方向（Pd）+
      开启时间（ON）：3 ms，关闭时间（OFF）：97 ms
      重复次数：5 次
      注：电穿孔应在解冻后 1 小时内完成，以确保基因组编辑在首次 DNA 复制前发生，防止嵌合体产生。
    3. 使用双步型电穿孔仪时，设置条件如下：
      穿孔脉冲 = 40 V，Pd +
      开启时间（ON）= 1 或 2.5 ms；脉冲间隔 = 50 ms
      重复次数：4 次，衰减 10%

      转移脉冲 = 5 或 7 V；Pd +/–
      开启时间（ON）：50 ms；脉冲间隔 = 50 ms
      重复次数 = 5 次；衰减 = 40%
      注：必须调整液体体积，以维持阻抗在制造商指定的特定范围内。
    4. 用改良 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液 2（M2）清洗胚胎 3 次，随后用石蜡油覆盖的 KSOM 培养基液滴清洗 2 次。
    5. 将清洗后的胚胎（置于 KSOM 培养基中）在 CO2 培养箱中孵育过夜，以备后续移植。

4. 胚胎移植

  1. 准备假孕雌性小鼠。在胚胎移植（ET）前一天，将ICR品系雌性小鼠（3–6月龄）与结扎雄性小鼠交配。
    注意：应在次日早晨检查小鼠是否有交配栓。有交配栓的小鼠视为假孕小鼠，可用于胚胎移植（ET）。
  2. 交替吸取空气和KSOM（不含石蜡油）进入玻璃毛细管中，每段2–3 mm，作为成功植入的标记。
  3. 将20–24枚胚胎移入200 μL KSOM液滴中（不加石蜡油），并用玻璃毛细管各吸取10–12枚胚胎，分别植入每侧输卵管。
  4. 使用异氟烷（吸入）或腹腔注射混合溶液（分别含美托咪啶 0.3 mg/kg、咪达唑仑 4.0 mg/kg 和布托啡诺 5.0 mg/kg）对雌性小鼠进行麻醉。将麻醉后的小鼠俯卧位固定于加热垫上。用保湿凝胶保护麻醉小鼠的眼睛。
  5. 沿背部中线的下部剃毛，并用聚维酮碘消毒，随后用70%乙醇擦拭。
  6. 沿背侧中线平行方向做一个长约1厘米的切口。
  7. 取出输卵管并置于无菌塑料铺巾上，使用温热的无菌生理盐水保持湿润。
  8. 将输卵管置于体视显微镜下。
  9. 用微弹簧剪在输卵管漏斗部与壶腹部之间、靠近壶腹部上游几毫米处的管壁上打一个小孔。
  10. 将装有胚胎的玻璃毛细管尖端插入孔中，轻轻向毛细管持握器的吹嘴吹气，排出胚胎直至在膨大部可见到一个气泡。
    注意：每侧输卵管移植10–12枚胚胎。
  11. 将玻璃毛细管从输卵管壁撤出，并轻轻将生殖器官推回体腔内。
  12. 重复上述步骤，将胚胎引入另一侧输卵管。
  13. 完成ET手术后，使用单纯间断缝合法缝合腹膜（5­0，可吸收合成编织缝线）缝合，然后采用单纯间断缝合或皮下间断埋线方式（6­0 非­可吸收单股合成缝线
  14. 将小鼠置于37 °C加热板上保温，直至其从麻醉状态恢复。
  15. 术后每天监测动物健康状况，持续7天。

5. 基因分型与序列分析

  1. 基因组DNA提取
    注意：我们使用NucleoSpin组织DNA提取试剂盒，按照制造商的建议从小鼠耳组织中提取基因组DNA。
    1. 向样品中加入180 µL Buffer T1和25 µL蛋白酶K溶液，涡旋混匀10秒。
    2. 在56 °C孵育2小时，或直至组织完全裂解。每30分钟涡旋10秒。
    3. 加入200 µL Buffer B3，剧烈涡旋30秒，然后在70 °C孵育10分钟。
    4. 向样品中加入210 µL 100%乙醇，并剧烈涡旋。
    5. 对每个样品，将一个组织柱放入收集管中，然后将样品加入柱中。
    6. 在11,000 x g离心1分钟，弃去穿流液，并将柱重新放回收集管中。
    7. 加入500 µL Buffer BW洗涤样品（第一次洗涤），在11,000 x g离心1分钟，弃去穿流液，并将柱重新放回收集管中。
    8. 向柱中加入600 µL Buffer B5（第二次洗涤），在11,000 x g离心1分钟，弃去穿流液，并将柱重新放回收集管中。
    9. 在11,000 x g离心1分钟以干燥硅胶膜，然后将NucleoSpin组织柱转移至一个1.5 mL微量离心管中。
    10. 加入100 µL Buffer BE，在室温孵育1分钟，然后在11,000 x g离心1分钟。
  2. PCR扩增与纯化
    1. 使用primer3 plus网站（https://primer3plus.com/）设计引物，以扩增目标位点周围400–500 bp的序列。
    2. 设计新的PCR程序并进行实证测试。
    3. 纯化PCR产物，以去除不需要的酶、核苷酸、引物和缓冲液成分。可采用以下标准纯化方法：
      1. 向50 µL PCR产物中加入50 µL苯酚，涡旋混匀。
      2. 在11,000 x g离心1分钟，将上层透明液体转移至新管中。
      3. 加入120 µL 99.5%乙醇和20 µL 5 M醋酸铵，涡旋30秒。
      4. 室温放置10分钟，然后在11,000 x g离心10分钟。
      5. 弃去上清液，用1 mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。
      6. 在室温干燥沉淀10分钟，然后溶于10 µL无RNase的水中。
        注意：推荐使用基于PCR柱的纯化试剂盒，因为苯酚对人体具有毒性。
  3. Sanger测序
    1. 进行DNA定量分析（参见材料表），以定量纯化的PCR扩增产物。
    2. 将PCR产物和测序引物送至测序服务提供商。
    3. 使用现有的在线网站分析序列。
      注意：本研究中使用CRISP-ID25（http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/）进行序列分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们改进的一细胞胚胎冷冻保存方法，包括在含20% FBS的HTF中孵育10分钟，随后在1 M DMSO和DAP213溶液中进行冷冻保存，显著提高了冻融胚胎发育至二细胞阶段的发育率（图1，p = 0.009，Student’s t检验）。冻融后的胚胎用于转基因小鼠的制备，并对电穿孔条件进行了优化：使用方案部分所述的电穿孔仪，以25 V电压进行5次重复脉冲，每次脉冲持续3 ms，间隔97 ms。通过制备白化病酪氨酸酶基因（Tyr）敲除小鼠验证了该方案的适用性（图2）。为此，设计了靶向外显子2的gRNA（图2A），并按照方案部分所述方法制备CRISPR试剂。在胚胎解冻后1小时内进行电穿孔，以确保基因组编辑发生在基因组首次复制之前，从而避免 founder 小鼠出现嵌合现象（图2B）。所有获得的小鼠均表现为白化表型，仅有一只为嵌合体，其毛色呈现白色与黑色斑块相间（图2...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案可高效、低嵌合率地制备转基因小鼠（表1）。该方法利用了生殖工程与基因组编辑技术领域的最新且最具实用价值的进展——CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物与冻融胚胎的电穿孔技术，使不具备高级胚胎操作技能的研究人员也能便捷地构建突变小鼠。这些技术进步显著简化并加速了转基因小鼠的制备过程。如图3所示，制备转基因小鼠约需4周时间。与其他采用类似策略的方案相比26，本方法在效率、出生率和嵌合率方面均具有优势。

在冷冻保存前，将单细胞胚胎在胎牛血清（FBS）中孵育，对于提高胚胎的发育率至关重要。方案中所述的冷冻保存胚胎的电穿孔条件，能够在CRISPR试剂的编辑效率与胚胎存活率之间取得平衡。事实上，过于剧烈或过于温和的电穿孔条件可能分别影响胚胎的发育率和编辑效率16。电穿孔的时机（图2B）至关重要，可克服 founder 个体中的嵌合现...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有相关的财务披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢佐田仁美和伊丽莎白·加西亚在动物护理方面提供的帮助。本研究由KAKENHI（15K20134、17K11222、16H06276和16K01946）以及北海道医学研究基金（资助H.N.）和Jichi医科大学青年研究者奖（资助H.U.）提供支持。 大塚利志美奖学金基金会为M.D.提供了资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25 M 蔗糖ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)SUCROSE
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)1M DMSO
布托啡诺Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (东京, 日本)Vetorphale 5mg
Cas9 蛋白：Alt-R® S.p. HiFi Cas9 核酸酶 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1081060
C57BL/6J 小鼠Japan SLC (滨松, 日本)N/A
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (东京, 日本)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)HTF
ICR 小鼠Japan SLC (滨松, 日本)N/A
异氟烷Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)KSOM
液氮罐Chart Industries (Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)M2
美托咪定Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (郡山, 日本)1124401A1060
显微镜Nikon Co. (东京, 日本)SMZ745T
咪达唑仑Sandoz K.K. (东京, 日本)1124401A1060
无核酸酶缓冲液Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1072570
Nucleospin DNA 提取试剂盒Takara Bio Inc (草津, 日本)740952 .5
单孔载玻片Matsunami Glass Ind., Ltd. (岸和田, 日本)S339929
一步法电穿孔仪BEX Co., Ltd. (东京, 日本)CUY21EDIT II
石蜡油NACALAI TESQUE Inc. (京都, 日本)SP 26137-85
铂金板电极BEX Co., Ltd. (东京, 日本)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (东京, 日本)SEROTROPIN 1000
聚维酮碘Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
减血清最低必需培养基：OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
两步法电穿孔仪Nepa Gene Co., Ltd. (市川, 日本)NEPA21

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
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  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355(2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
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  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382(2014).
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