我们描述了一种通过根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的遗传转化方法，用于在苦荞（Fagopyrum tataricum）中诱导产生毛状根。该方法可用于研究苦荞中基因功能及次生代谢产物的生成，适用于任何遗传转化实验，或经优化后用于其他药用植物的研究。
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摘要
摘要
苦荞（TB）[Fagopyrum tataricum （L.）Gaertn] 因含有丰富的黄酮类等次生代谢产物，特别是芦丁，而具有多种生物活性和药理活性。 根癌农杆菌 已在世界范围内逐渐被用于诱导药用植物产生毛状根，以研究基因功能并提高次生代谢产物的产量。在本研究中，我们描述了一种生成毛状根的详细方法 A. rhizogenes-在TB中诱导毛状根。选取7–10天龄的子叶和下胚轴作为外植体进行感染。 A. rhizogenes 携带一个双元载体，该载体诱导产生不定毛状根，毛状根在1周后出现。通过形态学特征、抗性筛选（卡那霉素）和报告基因表达（绿色荧光蛋白）鉴定所获得的毛状根转化。随后，根据需要对转化的毛状根进行自体扩增。同时，一个骨髓母细胞病病毒癌基因（MYB）转录因子， FtMYB116，通过TB基因组转化 A. rhizogenes介导的毛状根以验证其功能 FtMYB116 在合成类黄酮方面。结果表明，类黄酮相关基因的表达以及类黄酮化合物（芦丁和槲皮素）的产量均显著升高（p < 0.01）促进的 FtMYB116，表明 A. rhizogenes介导的毛状根可作为研究基因功能和次生代谢物生产的有效替代工具。本研究中描述的毛状根诱导的详细逐步操作方案，经适当调整后，可适用于任何遗传转化或其他药用植物。
引言
苦荞麦（TB）（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn）是一种双子叶植物，属于蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）1。作为一种药食同源的植物，苦荞麦因其独特的化学成分以及对多种疾病的广泛生物活性而受到广泛关注。苦荞麦富含碳水化合物、蛋白质、维生素、类胡萝卜素，以及多酚类物质，如酚酸和黄酮类化合物1。研究表明，黄酮类化合物具有多种生物学和药理学活性，包括抗氧化、抗高血压2、抗炎、抗癌和抗糖尿病等特性3。
Agrobacterium rhizogenes 是一种土壤细菌，可通过感染伤口位点导致多种高等植物（尤其是双子叶植物）产生毛状根病4,5。该过程始于根诱导（Ri）质粒中的T-DNA转移5,6，通常伴随着外源基因在Ri质粒上的整合与表达，以及随后毛状根表型的形成7。A. rhizogenes ....
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方案
本研究中使用的结核分枝杆菌被命名为BT18，该菌株来源于 "金桥二号" 由中国农业科学院山西小杂粮研究中心培育。本方案的主要步骤如图所示。 图1.
注意：操作外植体相关步骤时应迅速进行，尽可能保持培养皿处于关闭状态，以避免外植体失水萎蔫和污染。除非另有说明，所有外植体的培养均在25 °C、14小时光照/10小时黑暗的光周期条件下进行。除非另有说明，所有涉及外植体或细菌的操作均须在超净工作台内的无菌条件下完成。A. rhizogenes 及离体植物培养所用培养基成分详见表1。调节pH后，所有培养基均在120 °C下高压灭菌20分钟。制备固体培养基时，将25 mL培养基倒入直径为9 cm的培养皿中，静置使其凝固。
警告：将所有基因改造细菌和植物放入适当的废弃物容器中。所有危险化学品须在通风橱内操作，并将其放入危险废弃物容器中。
1. 结核病组织外植体的制备
- 结核种子的准备
- 选取饱满且无损伤的结核种子（图1A1），该种子应保存在低于−20 °C的条件下，保存时间不超过2年。
- 将种子置于....
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结果
Agrobacterium rhizogenes介导的TB毛状根转化
本研究描述了利用A. rhizogenes获得遗传转化毛状根所建立的逐步实验方案。从TB种子接种到鉴定并收获毛状根，整个过程大约需要5–6周，其中一些关键步骤如图1（A–H）所示。简要而言，经灭菌处理的去壳种子被接种（图1B），以实现快速的无菌萌发。A. rhizogenes（图1D）和无菌外植体应分别提前活化和准备。随后进行若干关键步骤，包括用活化的A. rhizogenes感染外植体（图1E）、共培养（图1
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讨论
结核病已在多个与次级代谢产物相关的遗传和代谢水平研究中被使用1,2,5,27,28毛状根培养作为一种独特的代谢物生产来源，在代谢工程中发挥着关键作用29 并通过插入相关基因来改变代谢通路。Kim 等2 首次提出通过TB诱导建立毛状根培养体系 A. rhizogenes-介导的转化以实现酚类化合物的生产。他们在TB毛状根中获得的芦丁含量比野生型根高出10倍以上。在本研究中，引入了 FtMYB116 导致rutin相关基因的表达升高，并显著增加了TB毛状根中rutin的产量。该技术已被证实适用于苯丙烷代谢途径相关基因的表型鉴定及其表达分析，例如 FtF3H 和 FtFLS.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金ZXKT17002资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab，中国 | PC0901 | |
| 琼脂粉 | Solarbio生命科学，北京，中国 | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 梯度PCR仪 | ThermoFisher Scientific，美国 | A37834 | |
| AS | Solarbio生命科学，北京，中国 | A8110 | 用DMSO溶解，100 mM |
| 双元载体 | ThermoFisher Scientific (invitrogen)，美国 | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| 头孢噻肟钠 | Solarbio生命科学，北京，中国 | C8240 | 用水溶解，200 mg/mL |
| CF15RXII高速冷冻离心机 | 日立，日本 | No. 90560201 | |
| 一次性培养皿 | 广华医疗器械厂，扬州，中国 | / | |
| DYY-6C电泳仪 | 北京六一，中国 | ECS002301 | |
| EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒 | Aidlab，中国 | RN38 | |
| ELGA purelab ultra bioscience纯水系统 | ELGA LabWater，英国 | 82665JK1819 | |
| Epoch微孔板分光光度计 | biotek，美国 | / | |
| Gateway BP/LR反应酶 | ThermoFisher Scientific (invitrogen)，美国 | 11789100/11791110 | |
| HYG-C多功能摇床 | 苏州培英实验设备有限公司，中国 | / | |
| Kan | Solarbio生命科学，北京，中国 | K8020 | 用水溶解，100 mg/mL |
| MLS-3750高压灭菌器 | 三洋，日本 | / | |
| 含维生素的MS盐 | Solarbio生命科学，北京，中国 | M8521 | |
| NaCl | Solarbio生命科学，北京，中国 | S8210 | |
| 其他未指明化学品 | 北京化工厂，中国 | 乙醇、升汞等 | |
| PHS-3C pH计 | 上海仪电科学仪器股份有限公司，中国 | a008 | |
| 植物基因组DNA提取试剂盒 | 天根生化科技（北京）有限公司 | DP305 | |
| 利福平 | Solarbio生命科学，北京，中国 | R8010 | 用DMSO溶解，50 mg/mL |
| 壮观霉素 | Solarbio生命科学，北京，中国 | S8040 | 用水溶解，100 mg/mL |
| 蔗糖 | Solarbio生命科学，北京，中国 | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | 全式金生物技术，北京，中国 | BM101-01 | |
| 胰蛋白胨 | Solarbio生命科学，北京，中国 | LP0042 | |
| Whatman直径9 cm滤纸 | 杭州沃华滤纸有限公司 | / | |
| 酵母提取物粉末 | Solarbio生命科学，北京，中国 | LP0021 |
参考文献
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al.
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重印与许可
