利用无细胞细菌提取物、脂质体和乳剂转移制备蛋白质合成型人工细胞

摘要

本方案描述了自下而上构建可合成RNA和蛋白质的人工细胞的方法、材料、设备及步骤。人工细胞的内部水相包含S30细菌裂解液，该裂解液通过水包油乳液转移法被封装于脂质双层（即稳定的脂质体）内。

摘要

自下而上的合成细胞构建方法是一种在模拟细胞环境中分离和研究细胞过程的有效工具。此外，无细胞表达系统的开发已证明能够在受控条件下重建蛋白质合成、转录和翻译过程（DNA→RNA→蛋白质），从而利用合成生物学技术。本文描述了一种制备无细胞表达系统的方案，包括制备高效的细菌裂解液，并将其包裹在富含胆固醇的脂质基巨大单层囊泡（GUVs）（即稳定的脂质体）内，以形成合成细胞。该方案详细介绍了合成细胞各组分的制备方法，包括活性细菌裂解液的制备，随后基于水包油乳液转移法逐步构建合成细胞。该方法能够以简单且经济的方式大量生成数百万个合成细胞，具有高度的灵活性，可用于生产多种不同类型的蛋白质。所获得的合成细胞可用于在隔离环境中研究蛋白质/RNA的生成与活性，应用于定向进化研究，也可作为可控的药物递送平台，在体内按需生产治疗性蛋白质。

引言

合成细胞是一类人工构建的类细胞颗粒，可模拟活细胞的一种或多种功能，例如分裂能力、膜相互作用以及基于遗传密码合成蛋白质的能力^1,2,3。包裹了无细胞蛋白合成（CFPS）系统的合成细胞由于能够在DNA模板改变后产生各种蛋白质和RNA序列，因而具有高度的模块化特性。CFPS系统以细胞裂解物、纯化组分或合成组分为基础，包含蛋白质合成所需的全部转录和翻译机制，如核糖体、RNA聚合酶、氨基酸以及能量来源（例如3-磷酸甘油酸和三磷酸腺苷），为当前的蛋白质生产方法提供了一种极具吸引力的替代方案^4,5,6,7,8,9。将CFPS系统封装于脂质囊泡内，可在不依赖活细胞的情况下实现蛋白质的简单高效生产¹⁰。此外，该平台还能够合成在天然细胞内易被降解的肽段，生产对活细胞有毒性的 蛋白质，并利用非天然氨基酸对蛋白质进行修饰^11,12。合成细胞已被用作研究模型，从进化角度探究实现细胞生命所需的最小细胞组分^1,13。合成细胞还被用于构建和实施基因线路，并作为定向进化的模型系统^14,15,16。其他研究则聚焦于合成细胞模拟天然细胞生物学活性的能力，旨在替代受损的天然细胞，例如糖尿病患者的β细胞¹⁷。此外，这些封装CFPS的合成细胞能够生产多种治疗性蛋白质，显示出其在临床应用中具备广阔的应用潜力¹⁸。

在此我们介绍一种自下而上的实验室规模方案（图1用于基于脂质体包封的无细胞蛋白表达系统（CFPS）合成细胞中RNA和蛋白质的生产。这展示了合成细胞平台作为新型药物递送系统在体内原位生产治疗性蛋白药物的潜在应用¹⁹先前的研究已探讨了优化CFPS反应及细胞裂解液制备流程的方法^4,8,20此外，已有多种技术被应用于制备细胞尺寸的脂质体，例如微流控技术和基于聚合物的液滴稳定化方法。^21,22,23，这也导致脂质体的脂质组成不同^24,25,26在本方案中，采用水包油乳液转移法制备合成细胞，且封装过程在低温条件下进行（<4 °C^{5,10,24,27,28}这些温和的条件有利于保持分子机器（即核糖体和蛋白质）的生物功能完整性。^27,29,30颗粒的脂质组成包含胆固醇和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）。前者存在于所有哺乳动物细胞膜中，对膜的稳定性、刚性以及降低通透性具有重要作用；后者则模拟了哺乳动物磷脂的组成。^11,13细胞的转录和翻译分子机器提取自 BL21 (DE3) 大肠杆菌 表达T7 RNA聚合酶以增强无细胞蛋白表达系统（CFPS）活性和蛋白质合成的大肠杆菌（E. coli）菌株，该菌株经含有pAR1219质粒的转化。该系统已被用于生产分子量高达66 kDa的诊断和治疗用蛋白质 体外 和 体内^19,31以下方案提供了一种简单且高效的合成细胞系统制备方法，可用于研究自然界中蛋白质合成相关的多种基本科学问题，并可应用于药物递送。

方案

注意：完整的合成细胞制备流程示意图见图1。根据用户需求，该方案中的蛋白质表达（第3.2节）和合成细胞形成（第4节）部分也可独立进行（需做适当调整）。

1. S30-T7 裂解液的制备

1. 在添加了50 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上划线接种转化了表达T7 RNA聚合酶的pAR1219质粒的E. coli BL21(DE3)菌株，以获得单菌落。
2. 制备种子液：挑取单菌落接种于含有50 µg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，置于100 mL锥形瓶内，在摇床培养箱中于37 °C、250 rpm条件下过夜培养。设置重复样本。
3. 将每份5 mL种子液分别接种至装有500 mL添加了50 µg/mL氨苄青霉素的TB培养基的2 L带挡板锥形瓶中，在摇床培养箱中于37 °C、250 rpm条件下培养至OD₆₀₀ 达到0.8–1.0。定期使用分光光度计监测。
4. 加入2–3 mL的100 mM IPTG储备液（终浓度为0.4–0.6 mM），诱导T7 RNA聚合酶表达，并继续培养至OD₆₀₀≈4。
5. 将每个锥形瓶中的培养液转移至两个250 mL无菌离心管中。
6. 在4 °C条件下以7,000 × g离心10分钟，弃去上清液。
   注意：此步骤获得的菌体沉淀可在-20 °C保存数天，之后再进行后续操作。
7. 将每个沉淀用250 mL预冷（4 °C）的S30裂解缓冲液重悬，然后在4 °C条件下以7,000 × g离心10分钟。
   注意：S30裂解缓冲液用于在步骤1.9使用均质器进行细胞裂解后维持蛋白质稳定性。从本步骤开始，直至步骤1.12的所有操作应连续且迅速完成。
   注意：在进行下一步前，预先冷却后续用于储存裂解液的枪头和1.5 mL离心管。
8. 弃去上清液，将所有沉淀合并后用15 mL预冷的S30裂解缓冲液重悬，并用纱布过滤悬浮液。
   注意： 15 mL溶液量是由于均质器的最小处理体积限制。应注意细菌浓度同样重要。
9. 在15,000 psi工作压力和4 bar气压下进行两次均质处理，以实现细胞破碎。避免溶液稀释，以获得更高浓度和活性的裂解液。
10. 每10 mL均质后的悬浮液中加入100 μL的0.1 M DTT （注意）。
11. 在4 °C条件下以24,700 × g离心30分钟。
12. 为保持裂解液活性，请迅速完成以下操作：将上清液逐份分装至预冷的1.5 mL离心管中，每管200 μL，并立即用液氮速冻。储存于-80 °C以备后续使用。 
    注意：DTT被归类为刺激性与有害物质，操作时应小心谨慎。

2. 油溶液中脂质的制备

1. 分别将POPC和胆固醇溶于氯仿（注意）中，每种物质的终浓度为100 mg/mL。分别涡旋混匀各管。
   1. 在2 mL玻璃小瓶中混合组分：加入50 µL溶于氯仿的POPC、50 µL溶于氯仿的胆固醇以及500 µL矿物油。每制备100 µL合成细胞，需使用2瓶脂质油溶液。
   2. 涡旋混匀后，在化学通风橱中于80 °C加热约1小时，以蒸发氯仿。通过遵循指定的时间/条件并监测溶液体积，确保氯仿完全蒸发。
      注意：所得的脂质油溶液可在室温下保存最多两周。为获得更佳实验结果，建议每次实验前新鲜配制。可根据所需膜组成调整脂质与胆固醇的比例。胆固醇浓度过高可能导致最终合成细胞溶液中形成聚集体。
      注意：氯仿被归类为刺激性且有害物质，操作时应谨慎，并在具备排风设施的区域进行。

3. 外液、预内液和饲喂溶液的制备

1. 储备液的配制
   1. 使用超纯水（UPW）配制 表2 中所列的储备液。
      注意：储备液应预先配制，并于 -20 °C 保存，直至后续使用。试剂7容易形成聚集体，加热至 37 °C 可减少聚集现象，轻微聚集不会显著影响反应。试剂8溶液呈乳白色且浑浊。
2. 外层溶液
   1. 将葡萄糖溶解于无DNase/RNase的H₂O中，使其终浓度为 200 mM。
   2. 每 100 µL 内层溶液，需配制 1.6 mL 外层溶液。
3. 预内层溶液
   1. 根据 表2 中列出的用量和浓度，加入试剂1-14。例如，若合成细胞的终体积为 100 µL，则配制 100 µL 内层溶液。
      注意：应加入超纯水以补足最终所需体积。此阶段混合物可在 4 °C 下保存数小时。
4. 喂养溶液
   1. 根据 表3 中列出的用量和浓度，加入所有试剂。
      注意：喂养溶液与内层溶液的使用比例为 1:1。若合成细胞终体积为 100 µL，则需配制 100 µL 喂养溶液。建议外层、内层及喂养溶液均配制少量多余体积。

4. 合成细胞的制备

注意：以下体积是针对制备 100 µL 合成细胞进行调整的。

1. 合成细胞蛋白质生产
   1. 在15 mL离心管中加入12 mL外相溶液，然后缓慢地在其上层加入500 µL油相脂质溶液。室温孵育20分钟。
   2. 完成内相溶液的配制：在碎冰上将内相溶液组分混合，通过解冻并加入S30-T7裂解液（试剂15）和DNA质粒（试剂16）至储存的混合物中，最终体积为100 µL。
   3. 向另一个含有500 µL油相脂质溶液的2 mL玻璃小瓶中， 加入100 µL内相溶液。剧烈吹打1分钟，然后在5档转速下涡旋震荡1分钟。
      1. 在碎冰上孵育10分钟，然后将所得乳液缓慢地加至15 mL离心管（来自4.1.1步骤）中油相的上层。
   4. 在100 × g 和4 °C条件下离心10分钟，随后在400 × g 和4 °C条件下再离心10分钟。离心结束后，应在管底观察到沉淀。
      注：建议使用摆桶式转子离心机，以便在水包油液滴穿过界面时更好地形成第二层脂质覆盖。若未观察到明显沉淀，可将离心速度提高至1000 × g。否则，请参见讨论部分关于外相溶液比重的说明。
   5. 提取沉淀。
      1. 去除多余的油相层。
      2. 使用剪裁过的移液枪头，预先吸入约400 µL外相溶液，用于提取沉淀。在穿过油相时释放外相溶液，以确保仅收集水相中的沉淀。
         1. 提取沉淀后擦拭枪头，避免带入残留油相，并将沉淀转移至洁净的1.5 mL离心管中。
   6. 在1,000 × g 和4 °C条件下离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于100 µL喂养溶液中（内相与喂养溶液按1:1比例混合）。
      注：此处也可使用固定角转子离心机。
   7. 为进行蛋白质表达，在37 °C条件下静置孵育2小时。
      注：不同蛋白质的最佳孵育时间可能有所差异。
   8. 根据目标蛋白质的特性，采用合适的方法检测所表达的蛋白质含量。
2. 推荐的对照组设置
   1. 内相溶液及裂解液活性验证
      1. 配制完整的内相溶液（含DNA & S30-T7裂解液）。
      2. 立即使用台式摇床孵育仪（250 rpm）或恒温混匀仪（1200 rpm），在37 °C恒温条件下孵育2小时。
         注：孵育时间应与合成细胞的孵育时间保持一致。
   2. 合成细胞
      1. 阴性对照组：按照4.1节所述方案操作，但内相溶液中不添加DNA。
      2. 阳性对照：按照4.1节所述方案操作，但内相溶液中包含编码报告基因的T7质粒。
         注：建议在实验组之外同时设置包含报告基因（如sfGFP）的阳性对照组，以验证包封效率。

结果

我们介绍了一种通过将基于BL21 E. coli 的S30-T7无细胞蛋白表达系统（CFPS）封装于脂质囊泡内来制备合成细胞的实验方案。制备过程的示意图以及各阶段的图像见图2。合成细胞制备的成功取决于各个步骤的正确执行，并受多种参数影响。该方案应根据目标蛋白的特定生产需求进行相应调整。

在T7启动子控制下表达模型蛋白超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）和Renilla荧光素酶的质粒被引入无细胞蛋白合成（CFPS）整体反应体系和合成细胞中，并通过多种方法评估蛋白质的生成，包括蛋白质印迹（western blot）、流式细胞术、显微镜观察和光谱分析（图3）。图3A展示了通过蛋白质印迹分析验证sfGFP-His₆标签蛋白（约27 kDa³²）的表达情况。取30 µL合成细胞样品，稀释6倍后与10 µL常用的SD...

讨论

本方案介绍了一种简单且经济的方法，用于大量生产可合成蛋白质的人工细胞。活性细胞的产量取决于对本方案的仔细且准确的操作，尤其需关注几个关键步骤。在裂解液制备部分，必须在细菌裂解前达到适当的菌体密度，以确保细菌裂解液中含有足量的蛋白质。其次，裂解过程应在 4 °C 下进行，并使用液氮迅速冷冻裂解液，以维持蛋白质活性。此外，本方案中使用了携带表达 T7 RNA 聚合酶的 pAR1219 质粒的 E. coli BL21(DE3) 细胞。若使用其他细菌菌株，可能需要调整裂解液浓度，以获得足够量的 RNA 聚合酶和核糖体。即使使用相同的细菌菌株，不同批次制备的裂解液也可能存在批间差异。

囊泡制备环节还包括几个关键步骤。脂质的溶解以及从矿物油中去除氯仿，对于形成水包油乳液至关重要。将水包油液滴通过离心转入外层水相缓冲液，也是生成具有脂双层结构的合成细胞的关键步骤。如果囊泡内溶液或脂质组成发生变化，可能会导致液滴聚集在油水界面处，而无法观察到明显的沉淀。为解决此问题，一个快速的方法是在乳液转移步骤中将离心速度提高至1,000 × g。若此方法仍无法解决问题，可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A. 第1步所需试剂（S30-T7裂解液制备）
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	大肠杆菌 BL21 (DE3)
pAR1219	Sigma	T2076	用于转化的 TargeTron 载体
50 mg/mL 氨苄青霉素储备液	Sigma	A9518	储存于 -20 °C.
10 g/L 胰蛋白胨	BD生物科学	211705	用于制备Luria Bertani（LB）琼脂（1.5%）平板。
10 g/L 氯化钠（NaCl）	生物实验室	19030591
5 g/L Bacto-酵母提取物	BD 生物科学	212750
15 g/L 琼脂粉（纯化）	默克	1.01614.5007
50 µg/mL 氨苄青霉素	Sigma	A9518
10 g/L 胰蛋白胨	BD生物科学	211705	用于制备Luria Bertani (LB) 培养基（20 mL）。
10 g/L 氯化钠 (NaCl)	生物实验室	19030591
5 g/L Bacto-酵母提取物	BD生物科学	212750
50 µg/mL 氨苄青霉素	Sigma	A9518
12 g/L 胰蛋白胨	BD生物科学	211705	用于配制1 L优异肉汤（Terrific Broth，TB）培养基。
24 g/L Bacto-酵母提取物	BD 生物科学	212750
4% (v/v) 无水甘油	生物实验室	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum Chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum Chemical	P1380
50 µg/mL 氨苄青霉素	Sigma	A9518
100 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）储备液 β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	INALCO	INA-1758-1400	使用 0.2 微米滤膜过滤 µm 亲水性 PVDF 注射器滤器
0.1 M 二硫苏糖醇（DTT）储备液	TCI	D1071	使用 0.2 微米滤膜过滤 µm 亲水性聚偏氟乙烯（PVDF）注射器滤器
pH = 7.4 的 10 mM Tris-乙酸盐	Sigma	T1503	S30裂解缓冲液（1.5 L）
14 mM 醋酸镁	默克	1.05819.0250
60 mM 醋酸钾	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-巯基乙醇	Sigma	M6250
步骤1所需的设备
100 mL 无菌锥形瓶	赛默飞世尔科技	50-154-2846	2 个烧瓶
2 L 带挡板的灭菌锥形瓶	KIMAX-KIMBLE	25630	2 个烧瓶
落地式振荡培养箱	MRC	TOU-120-2	实验室摇床培养箱 450x450 mm，400 rpm，70 °C
离心	赛默飞世尔科技	75004270	(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX 固定角转子 应至少达到13,000 × g。     * 预冷至 4 °C.
高压均质机	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	预冷至 4 °C.
-80oC 冷冻箱	SO-LOW	U85-18
灭菌的 1.5 mL 塑料管	Eppendorf	30120086	最好预冷至 -20 °C.
分光光度计	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96孔透明板	赛默飞世尔科技	167008
灭菌量筒	康宁
无菌离心管	Eppendorf	30120086	最好预冷至 -20 °C.
无菌移液器吸头	康宁		最好预冷至 -20 °C.
碎冰桶	Bel-Art	M18848-4001
小型液氮罐	NALGENE	4150-4000
B. 第3步所需试剂（脂质油溶液的制备）：
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）	脂质	556400	粉末
胆固醇	Sigma	C8667	粉末
氯仿	生物实验室	3082301
矿物油	Sigma	M5904	轻质油
步骤2所需的设备
涡旋混合器	科学产业	SI-0256
加热块	TECHNE	FDB03AD	预热至 80 °C. 应能够控制温度。
2 mL 螺口玻璃小瓶	CSI 分析技术创新	VT009M-1232	对于更大规模的操作，使用50 mL离心管，并使用旋转蒸发仪蒸发氯仿。
9 mm 螺口盖	CSI 分析技术创新	C395R-09LC
C. 第3步所需试剂（内层反应混合物和喂养反应混合物）：
HEPES	光谱	H1089	1 M HEPES-KOH（pH = 8）— pH缓冲液
氢氧化钾（KOH）	Frutarom	55290
1 M 醋酸镁	默克	1.05819.0250	辅因子和负电荷稳定剂
1 M 醋酸钾	Carlo Erba	470147	负电荷稳定剂
5.2 M 醋酸铵	默克	1.01116.1000	稳定负电荷。
50% (w/v) 聚乙二醇 6000 (PEG)	默克	8.07491.1000	提高大分子的浓度。
0.5 M 3-磷酸甘油酸（3-PGA）	Sigma	P8877	次级能源
50 mM 氨基酸混合液 I	Sigma	LAA21-1KT	氨基酸添加剂 包含：以下17种物质各50 mM  天然氨基酸——丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
50 mM 氨基酸混合物 II	Sigma	LAA21-1KT	氨基酸添加剂 包含以下三种天然氨基酸，每种浓度为 50 mM：色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
100 mM 腺苷三磷酸（ATP）	Sigma	A3377	核苷酸 &和能源来源。
50 mM 鸟苷三磷酸（GTP）	Sigma	G8877	核苷酸 &和能源来源。
100 mM 尿苷三磷酸（UTP）	ACROS ORGANICS	226310010	核苷酸添加剂
100 mM 异丙基 β异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	INALCO	INA-1758-1400	基因表达诱导
2 M 蔗糖	J.T. Baker	1933078	生成密度梯度
2 M 葡萄糖	Sigma	16301	生成密度梯度
H2超纯水（UPW）	生物实验室	2321777500	DNase &且无RNase
S30-T7 裂解液	_	_	在步骤1中制备。                                                                        转录来源 &和翻译组分。 -80℃保存 °c. 使用前在碎冰上解冻。
目的DNA质粒储备液	_	_	包含目标蛋白的序列。 在T7启动子作用下
D. 第4步（合成细胞制备）所需设备
落地式培养摇床或 Thermomixer	MRC	TOU-120-2	实验室摇床培养箱 450×450 mm，400 rpm，70 °C
PHMT 拨款生物	PSC18	恒温混匀仪
离心	赛默飞世尔科技	75004270	(75003629) - TX-400 4 x 400 mL 摆桶转子 适用于15 mL规格的离心管。 优选摆动桶式转子。 应至少达到1000 × g。 预冷至 4 °C.
台式离心机	赛默飞世尔科技	75002420	(75003424) - 24 x 1.5/2.0 mL 角转子，带 ClickSeal 密封盖 适用于 Eppendorf 离心管。 预冷至 4 °C.
涡旋混合器	科学产业	SI-0256
碎冰桶	Bel-Art	M18848-4001
2 mL 螺口玻璃小瓶	CSI分析技术创新	VT009M-1232
无菌15 mL塑料管	赛默飞世尔科技	339651
经灭菌的1.5 mL塑料管	Eppendorf	30120086
无菌移液器吸头	康宁		经高压灭菌器灭菌。