利用无细胞细菌提取物、脂质体和乳剂转移制备蛋白质合成型人工细胞

摘要

本方案描述了自下而上构建可合成RNA和蛋白质的人工细胞的方法、材料、设备及步骤。人工细胞的内部水相包含S30细菌裂解液，该裂解液通过水包油乳液转移法被封装于脂质双层（即稳定的脂质体）内。

摘要

自下而上的合成细胞构建方法是一种在模拟细胞环境中分离和研究细胞过程的有效工具。此外，无细胞表达系统的开发已证明能够在受控条件下重建蛋白质合成、转录和翻译过程（DNA→RNA→蛋白质），从而利用合成生物学技术。本文描述了一种制备无细胞表达系统的方案，包括制备高效的细菌裂解液，并将其包裹在富含胆固醇的脂质基巨大单层囊泡（GUVs）（即稳定的脂质体）内，以形成合成细胞。该方案详细介绍了合成细胞各组分的制备方法，包括活性细菌裂解液的制备，随后基于水包油乳液转移法逐步构建合成细胞。该方法能够以简单且经济的方式大量生成数百万个合成细胞，具有高度的灵活性，可用于生产多种不同类型的蛋白质。所获得的合成细胞可用于在隔离环境中研究蛋白质/RNA的生成与活性，应用于定向进化研究，也可作为可控的药物递送平台，在体内按需生产治疗性蛋白质。

引言

合成细胞是一类人工构建的类细胞颗粒，可模拟活细胞的一种或多种功能，例如分裂能力、膜相互作用以及基于遗传密码合成蛋白质的能力^1,2,3。包裹了无细胞蛋白合成（CFPS）系统的合成细胞由于能够在DNA模板改变后产生各种蛋白质和RNA序列，因而具有高度的模块化特性。CFPS系统以细胞裂解物、纯化组分或合成组分为基础，包含蛋白质合成所需的全部转录和翻译机制，如核糖体、RNA聚合酶、氨基酸以及能量来源（例如3-磷酸甘油酸和三磷酸腺苷），为当前的蛋白质生产方法提供了一种极具吸引力的替代方案^4,5,6,7,8,9。将CFPS系统封装于脂质囊泡内，可在不依赖活细胞的情况下实现蛋白质的简单高效生产¹⁰。此外，该平台还能够合成在天然细胞内易被降解的肽段，生产对活细胞有毒性的 蛋白质，并利用非天然氨基酸对蛋白质进行修饰<....

方案

注意：完整的合成细胞制备流程示意图见图1。根据用户需求，该方案中的蛋白质表达（第3.2节）和合成细胞形成（第4节）部分也可独立进行（需做适当调整）。

1. S30-T7 裂解液的制备

1. 在添加了50 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上划线接种转化了表达T7 RNA聚合酶的pAR1219质粒的E. coli BL21(DE3)菌株，以获得单菌落。
2. 制备种子液：挑取单菌落接种于含有50 µg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，置于100 mL锥形瓶内，在摇床培养箱中于37 °C、250 rpm条件下过夜培养。设置重复样本。
3. 将每份5 mL种子液分别接种至装有500 mL添加了50 µg/mL氨苄青霉素的TB培养基的2 L带挡板锥形瓶中，在摇床培养箱中于37 °C、250 rpm条件下培养至OD₆₀₀ 达到0.8–1.0。定期使用分光光度计监测。
4. 加入2–3 mL的100 mM IPTG储备液（终浓度为0.4–0.6 mM），诱导T7 RNA聚合酶表达，并继续培养至OD₆₀₀≈4。
5. 将每个锥形瓶中的培养液转移至两个250 mL无菌离心管中。
6. 在4 °C条件下以7,000 × g离心10分钟，弃去上清液。

结果

我们介绍了一种通过将基于BL21 E. coli 的S30-T7无细胞蛋白表达系统（CFPS）封装于脂质囊泡内，以制备合成细胞的实验方案。制备过程的示意图以及各阶段的图像见图2。合成细胞制备的成功取决于各个步骤的正确执行，并受多种参数影响。该方案应根据特定蛋白质的生产需求进行相应调整。

在T7启动子控制下表达模型蛋白超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）和Renilla荧光素酶的质粒被引入无细胞蛋白合成（CFPS）整体反应体系和合成细胞中，并通过多种方法评估蛋白质的生成，包括蛋白质印迹（western blot）、流式细胞术、显微镜观察和光谱分析（图3）。图3A展示了通过蛋白质印迹分析验证sfGFP-His₆标签蛋白（约27 kDa³²）的表达情况。取30 µL合成细胞样品，稀释6倍后与10 µL常规SDS.......

讨论

本方案介绍了一种简单且经济的方法，用于大量生产可合成蛋白质的人工细胞。活性细胞的产量取决于对本方案的仔细且准确的操作，尤其需关注几个关键步骤。在裂解液制备部分，必须在细菌裂解前达到适当的菌体密度，以确保细菌裂解液中含有足量的蛋白质。其次，裂解过程应在 4 °C 下进行，并使用液氮迅速冷冻裂解液，以维持蛋白质活性。此外，本方案中使用了携带表达 T7 RNA 聚合酶的 pAR1219 质粒的 E. coli BL21(DE3) 细胞。若使用其他细菌菌株，可能需要调整裂解液浓度，以获得足够量的 RNA 聚合酶和核糖体。即使使用相同的细菌菌株，不同批次制备的裂解液也可能存在批间差异。

囊泡制备环节还包括几个关键步骤。脂质的溶解以及从矿物油中去除氯仿，对于形成水包油乳液至关重要。将水包油液滴通过离心转入外层水相缓冲液，也是生成具有脂双层结构的合成细胞的关键步骤。如果囊泡内溶液或脂质组成发生变化，可能会导致液滴聚集在油水界面处，而无法观察到明显的沉淀。为解决此问题，一个快速的方法是在乳液转移步骤中将离心速度提高至1,000 × g。若此方法仍无法解决问题，可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A. 第1步所需试剂（S30-T7裂解液制备）
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3)
pAR1219	Sigma	T2076	用于转化的 TargeTron 载体
50 mg/mL 氨苄青霉素储备液	Sigma	A9518	储存于 -20 °C.
10 g/L Bacto-胰蛋白胨	BD Bioscience	211705	用于制备Luria Bertani（LB）琼脂（1.5%）平板。
10 g/L 氯化钠 (NaCl)	生物实验室	19030591
5 g/L Bacto-酵母提取物	BD Bioscience	212750
15 g/L 琼脂粉纯化	默克	1.01614.5007
50 µg/mL 氨苄青霉素	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	用于制备LB（Luria Bertani）培养基（20 mL）。
10 g/L 氯化钠（NaCl）	生物实验室	19030591
5 g/L Bacto-酵母提取物	BD Bioscience	212750
50 µg/mL 氨苄青霉素	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	用于制备1 L超级肉汤（Terrific Broth，TB）培养基。
24 g/L Bacto-酵母提取物	BD Bioscience	212750
4% (v/v) 无水甘油	生物实验室	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum Chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum Chemical	P1380
50 µg/mL 氨苄青霉素	Sigma	A9518
100 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）储备液 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	INALCO	INA-1758-1400	使用滤膜过滤 0.2 µm 亲水性PVDF注射器滤器
0.1 M 二硫苏糖醇（DTT）储备液	TCI	D1071	过滤使用 0.2 µm 亲水性PVDF注射器滤器
pH = 7.4 的 10 mM Tris-乙酸盐	Sigma	T1503	S30 裂解缓冲液（1.5 L）
14 mM 醋酸镁	默克	1.05819.0250
60 mM 醋酸钾	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-巯基乙醇	Sigma	M6250
步骤1所需的设备
100 mL 无菌锥形瓶	Thermo Scientific	50-154-2846	2 个烧瓶
2 L 灭菌带挡板锥形瓶	KIMAX-KIMBLE	25630	2 个烧瓶
台式恒温振荡器	MRC	TOU-120-2	实验室摇床培养箱 450×450 mm，400 rpm 70 °C
离心	Thermo Scientific	75004270	(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX 固定角转子 应能承受至少 13,000 × g 的离心力。     * 预冷至 4 °C.
高压均质机	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	预冷至 4 °C.
-80oC冷冻箱	SO-LOW	U85-18
无菌 1.5 mL 塑料管	Eppendorf	30120086	最好预冷至 -20 °C.
分光光度计	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96孔透明板	Thermo Scientific	167008
灭菌量筒	康宁
无菌离心管	Eppendorf	30120086	最好预冷至 -20 °C.
无菌移液器吸头	康宁		最好预冷至 -20 °C.
碎冰桶	Bel-Art	M18848-4001
小型液氮罐	NALGENE	4150-4000
B. 第3步所需试剂（油相脂质溶液的制备）：
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（POPC）	Lipoid	556400	粉末
胆固醇	Sigma	C8667	粉末
氯仿	生物实验室	3082301
矿物油	Sigma	M5904	轻质油
步骤2所需设备
涡旋混合器	科研产业	SI-0256
加热块	技术方法	FDB03AD	预热至 80 °C. 应能实现温度控制。
2 mL 螺口玻璃小瓶	CSI 分析技术创新	VT009M-1232	对于更大规模的实验，使用50 mL离心管，并用旋转蒸发仪蒸发氯仿。
9 mm 螺口盖	CSI分析技术创新	C395R-09LC
C. 第3步所需试剂（内层反应混合物和喂养反应混合物）：
HEPES	光谱	H1089	1 M HEPES-KOH（pH = 8）— pH缓冲液
氢氧化钾（KOH）	Frutarom	55290
1 M 醋酸镁	默克	1.05819.0250	辅因子和负电荷稳定剂
1 M 醋酸钾	Carlo Erba	470147	负电荷稳定剂
5.2 M 醋酸铵	默克	1.01116.1000	稳定负电荷。
50% (w/v) 聚乙二醇 6000 (PEG)	默克	8.07491.1000	提高大分子的浓度。
0.5 M 3-磷酸甘油酸（3-PGA）	Sigma	P8877	次级能源
50 mM 氨基酸混合物 I	Sigma	LAA21-1KT	氨基酸添加剂 包含：以下 17 种物质各 50 mM  天然氨基酸——丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
50 mM 氨基酸混合物 II	Sigma	LAA21-1KT	氨基酸添加剂 包含以下3种天然氨基酸各50 mM：色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
100 mM 腺苷三磷酸（ATP）	Sigma	A3377	核苷酸 & 能量来源
50 mM 鸟苷三磷酸（GTP）	Sigma	G8877	核苷酸 & 能量来源
100 mM 尿苷三磷酸（UTP）	ACROS ORGANICS	226310010	核苷酸添加剂
100 mM 异丙基 β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	INALCO	INA-1758-1400	基因表达诱导
2 M 蔗糖	J.T. Baker	1933078	生成密度梯度
2 M 葡萄糖	Sigma	16301	生成密度梯度
H2O UltraPure Water (UPW)	生物实验室	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 裂解液	_	_	在步骤1中制备                                                                        转录来源 & 翻译组分 储存于 -80 °c，使用前在碎冰上解冻。
目的 DNA 质粒储备液	_	_	包含目标蛋白的序列。 在T7启动子下
D. 第4步（合成细胞制备）所需设备
卧式培养摇床或Thermomixer	医学研究委员会	TOU-120-2	实验室摇床培养箱 450x450 mm，400 rpm， 70 °C
PHMT 基金生物项目	PSC18	恒温混匀仪
离心	赛默飞世尔科技	75004270	(75003629) - TX-400 4 x 400 mL 摆桶转子 适用于15 mL规格的试管。 最好使用摆动桶式转子。 应能承受至少 1000 × g 的离心力。 预冷至 4 °C.
台式离心机	Thermo Scientific	75002420	(75003424) - 24 x 1.5/2.0 mL 带 ClickSeal 的转子 适用于 Eppendorf 离心管。 预冷至 4 °C.
涡旋混合器	科学产业	SI-0256
碎冰桶	Bel-Art	M18848-4001
2 mL 螺口玻璃小瓶	CSI 分析技术创新	VT009M-1232
无菌15 mL塑料管	Thermo Scientific	339651
已灭菌的 1.5 mL 塑料管	Eppendorf	30120086
无菌移液器吸头	康宁		经高压灭菌器灭菌。