目前分析患者是否遵守复杂耐药结核病(DR-TB)方案的方法可能不准确且资源密集。我们的方法分析头发,一个易于收集和储存的基质,浓度为11个DR-TB药物。使用LC-MS/MS,我们可以确定亚纳米格药物水平,可用于更好地了解药物依从性。
方法文章
目前分析患者是否遵守复杂耐药结核病(DR-TB)方案的方法可能不准确且资源密集。我们的方法分析头发,一个易于收集和储存的基质,浓度为11个DR-TB药物。使用LC-MS/MS,我们可以确定亚纳米格药物水平,可用于更好地了解药物依从性。
耐药结核病 (DR-TB) 是一个日益严重的公共卫生威胁,评估治疗药物水平可能具有重要的临床益处。血浆药物水平是当前的黄金标准评估,但需要肾切除术和冷链,并捕获只是最近依从。我们的方法使用头发,一个易于收集并反映长期依从性的矩阵,测试11种抗结核药物。我们小组以前的工作表明,头发中的抗逆转录病毒药物水平与艾滋病毒结果有关。我们的DR-TB药物方法使用2毫克的头发(3厘米接近根),这是粉碎和提取甲醇。用一种LC-MS/MS方法分析样品,在16分钟内量化11种药物。11种药物的定量(LLOQs)下限范围从0.01纳克/毫克到1纳克/毫克不等。 药物存在通过比较两种质谱过渡的比率得到确认。样品使用药物与脱硝、15N-或13C标记药物等值的面积比进行量化。我们使用的校准曲线范围为 0.001-100 ng/mg。 该方法在直接观察治疗(DOT)上从DR-TB患者采集的头发样本的方便样本中的应用表明,在11种药物中的9种(异酰胺、苯丙胺、ethambutol、线胶、levofloacin、莫西氟辛、氟胺、贝达奎林、头头体)的线性动态范围内,头发中的药物水平。没有病人使用蛋白苯酰胺,并且测得的液酰胺水平接近其LLOQ(通过进一步的工作,而不是检查依西酰胺的代谢物是否适合监测暴露)。总之,我们描述了头发DR-TB药物的多机解毒板的开发,作为耐药结核病治疗期间治疗药物监测的技术。
在21世纪,耐药结核病(DR-TB)是本已薄弱的国家结核病控制计划中不断演变的灾难,仅在过去5年中,确诊病例就翻了一番,占全球抗微生物药物耐药性死亡总数的近三分之一,。与治疗对药物敏感的结核病相比,成功治疗DR-TB通常要求更长、毒性更大的二线治疗方案。此外,DR-TB患者在依从性方面往往存在重大挑战,导致最初出现耐药性。
与HIV感染不同,病毒载量可用于监测治疗,结核病治疗反应的代理终点在个别4级延迟且不可靠。监测患者依从性是亚治疗抗结核药物浓度和治疗失败的重要预测器,也是一项挑战。自我报告的依从性有召回偏见和取悦供应商的愿望55,6。6丸数和药物事件监测系统(MEMS)可以更客观7,但不测量实际药物消耗88,9,10。9,10生物基质中的药物水平可以提供依从性和药代动力学数据。因此,血浆药物水平通常用于治疗药物监测11,12。11,然而,在药物依从性监测方面,血浆水平代表短期接触,在确定适当的依从性参考范围时,受患者体内和患者间变异性的限制。"白衣"效应,在临床或研究访问之前,依从性改善,进一步复杂化血浆水平的能力,提供准确的药物依从模式13。
头发是一种替代生物基质,可以测量长期药物暴露1414,15。15许多药物和内源性代谢物结合到头发蛋白基质从系统循环,因为头发生长。随着头发生长过程中这种动态过程的继续,沉积在头发基质中的药物量取决于药物在循环中的连续存在,使头发成为药物摄入量的极佳时间读出。头发作为生物基质具有另一个优点,即易于收集,无需与血液相比,冷链进行储存和装运。此外,头发是非生物危害的,这提供了额外的可行性优势,在外地。
头发药物水平早已用于法医申请16。在过去十年中,头发抗逆转录病毒(ARV)水平在评估药物在艾滋病毒治疗和预防方面是否得到效用,我们小组对此作出了贡献。头发中的抗逆转录病毒药物水平已被证明是HIV感染治疗结果的最独立预测变量17、18、19、20、21。17,18,19,20,21为了确定DR-TB患者的头发水平在预测治疗结果方面是否具有相同的效用,我们使用LC-MS/MS来开发和验证一种分析小头发样本中11种DR-TB药物的方法。作为对测定性能的初步评估,我们在南非西开普22号对接受直接观察治疗的DR-TB患者的方便样本中测量了DR-TB药物水平。
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所有患者在收集头发样本前都提供书面知情同意。我们获得了开普敦大学和加州大学旧金山分校的机构审查委员会的批准。
1. 头发取样
2. 药物提取
3. LC-MS/MS 制备
4. 数据分析
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图1显示了所有11种DR-TB药物的确诊水平的色谱图图图。使用不同的仪器和列时,每个护身奶的保留时间可能会更改,因此应单独确定确切的保留时间。
图2显示了一种特定药物(isoniazid,INH)在一种校准器(空白头发样本与DR-TB药物参考标准尖刺)的提取的Ion色谱仪(EIC)。定量器和限定符过渡用于定性地确认药物的存在,因为定量器面积和限定符区域之间的比率在样品之间保持不变。内部标准也得到监控,以确保每个样品注射都规范化。
为了进行演示,我们分析了来自南非西开普的96名在DOT条件下服用DR-TB药物的96名患者的15个头发样本的方便样本。表6列出了针对每种机解利剂测量的最低和最高水平的DR-TB药物的代表性水平。虽然提供了15个患者样本的数据,但每个的分析物没有报告15个级别,因为每个患者都服用了不同组合的DR-TB药物。没有一个病人服用蛋白酰胺,只有一个病人服用前体...
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我们在这里报告我们开发和验证的方法的协议,用于量化11种抗结核病药物,用于治疗使用LC-MS/MS的小头发样本中的DR-TB。以前没有其他方法来量化头发中的这11种药物,但已经开发、验证和发布。我们的方法可以量化亚纳米克的药物水平,只有20-30发丝长约3厘米(约2毫克),并已经过验证22。头发分析的低重量意味着参与研究的患者可以谨慎参与,并有可能返回重复测试,而不必担心暴露秃头皮。我们先前已公布有关头发DR-TB药物水平与DR治疗结果23日之间的关联数据。因此,这种多机类面板方法的开发和验证标志着DR-TB治疗药物监测领域的一个重大进展。
头发需要与液体生物基质所需的不同均质技术。毛丝的粉碎允许提取溶剂有效地进入头发基质中的分析物。因此,我们方法的一个重要特征是使用粉碎样品快速、简便地提取头发中的药物。提取过程中的孵育时间只有两小时,由于粉碎头发的表面面积大,而且由于样品体积小(2毫克),没有清理步骤。不过,必须注意在提取过程中限制药物降解。该协议使用双循环粉碎,周期之间的冷却周期为 ...
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这项工作得到了国家过敏和传染病研究所RO1 AI123024(共同机构:约翰·梅特卡夫和莫妮卡·甘地)的支持。
作者要感谢开普敦大学肺研究所的基尔坦·迪达教授、阿里·伊斯梅尔博士和玛丽特杰·普雷托利斯教授为这项研究收集头发样本提供便利。作者还感谢本研究参与者的贡献。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2毫升注射瓶 | 安捷伦科技 | 5182-0716 | |
| 250 uL 注射瓶插入件 | 安捷伦科技 | 5181-8872 | |
| 珠状破碎器24 | OMNI国际 | 19001 | |
| 破珠管(2 mL 珠子套件,2.8mm 陶瓷,2 mL 微管) | OMNI国际 | 19628 | |
| 贝达奎林 | 多伦多研究化学 | B119550 | |
| 贝达喹林-d6 | 多伦多研究化学 | B119552 | |
| 氯法齐明 | 多伦多研究化学 | C324300 | |
| 氯法齐明-d7 | 多伦多研究化学 | C324302 | |
| 一次性石灰玻璃培养管 | VWR | 60825-425 | |
| 乙胺丁醇 | 多伦多研究化学 | E889800 | |
| 乙胺丁醇-d4 | 多伦多研究化学 | E889802 | |
| 乙酰胺 | 多伦多研究化学 | E890420 | |
| 乙硫酰胺-d5 | 清合成器 | CS-O-06597 | |
| 甲酸 | 西格玛-奥尔德里奇 | F0507-100毫升 | |
| 玻璃瓶 | 康宁 | 1395-1L | |
| 热摇床 | 贝尔科玻璃公司 | 7746-32110 | |
| 高效液相色粘液析理 | 安捷伦科技 | 无限1260 | |
| 高效液相色谱级乙腈 | 霍尼韦尔 | 015-4 | |
| 高效液相色谱级甲醇 | 霍尼韦尔 | 230-1L | |
| 高效液相色谱级水 | Aqua 解决方案公司 | W1089-4L | |
| 异 烟 肼 | 多伦多研究化学 | I821450 | |
| 异烟肼-d4 | 多伦多研究化学 | I821452 | |
| LC柱,Synergi 2.5微米 极地 RP 100 A 100 x 2 毫米 | 现象 | 00D-4371-B0 | |
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| LC护罩弹夹 | 现象 | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS定量软件 | 科学版 | 多量化 2.1 | |
| 左氧氟沙星 | 西格玛-奥尔德里奇 | 1362103-200MG | |
| 左氧氟沙星-d8 | 多伦多研究化学 | L360002 | |
| 利奈唑胺 | 多伦多研究化学 | L466500 | |
| 利奈唑胺-d3 | 多伦多研究化学 | L466502 | |
| 微型离心管 | E&K科学 | 695554 | |
| 莫西氟沙星 | 多伦多研究化学 | M745000 | |
| 莫西氟沙星-13C,d3 | 多伦多研究化学 | M745003 | |
| MS/MS | 科学版 | 三四轮五联5500 | |
| OPC 14714 | 多伦多研究化学 | O667600 | |
| Pretomanid(PA-824) | 多伦多研究化学 | P122500 | |
| 前硫胺酰胺 | 多伦多研究化学 | P839100 | |
| 前硫胺酰胺-d5 | 多伦多研究化学 | P839102 | |
| 吡嗪酰胺 | 多伦多研究化学 | P840600 | |
| 吡嗪酰胺-15N,d3 | 多伦多研究化学 | P840602 | |
| 注射瓶用的隔膜盖 | 安捷伦科技 | 5185-5862 | |
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