目前用于分析患者对耐药结核病（DR-TB）复杂治疗方案依从性的方法可能存在不准确且资源消耗大的问题。我们的方法利用易于采集和保存的毛发样本，检测其中11种DR-TB药物的浓度。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可测定低至亚纳克水平的药物含量，从而更准确地评估患者的用药依从性。
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摘要
摘要
耐药结核病（DR-TB）正日益成为重大的公共卫生威胁，评估治疗药物浓度可能具有重要的临床意义。目前血浆药物浓度是评估的金标准，但其需要采血以及冷链运输，且仅能反映极短期内的服药依从性。我们的方法采用毛发作为检测基质，毛发易于采集，且能反映长期服药依从情况，可用于检测11种抗结核药物。本课题组先前的研究表明，毛发中抗逆转录病毒药物浓度与HIV治疗结局相关。本方法使用2 mg毛发（距发根最近的3 cm段），经研磨后用甲醇提取。样本通过单一的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行分析，在16分钟内定量检测11种药物。11种药物的定量下限（LLOQ）范围为0.01 ng/mg至1 ng/mg。通过比较两个质谱离子通道的比值来确认药物的存在。采用药物与其氘代、15N标记或13C标记的同位素异构体的峰面积比进行定量。校准曲线浓度范围为0.001–100 ng/mg。将该方法应用于在直接面视下服药治疗（DOT）的DR-TB患者毛发样本（便利抽样）时，结果显示11种药物中的9种（异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、利奈唑胺、左氧氟沙星、莫西沙星、氯法齐明、贝达喹啉、普托马尼）在毛发中的药物浓度处于线性动态范围内。所有患者均未使用丙硫异烟胺，而乙硫异烟胺的检测浓度接近其LLOQ（后续研究将进一步评估其代谢产物用于暴露监测的适用性）。综上所述，我们描述了一种针对DR-TB治疗药物的多组分毛发检测方法，可作为耐药结核病治疗过程中进行治疗药物监测的技术手段。
引言
在21世纪，耐药结核病（DR-TB）已成为本已薄弱的国家结核病控制项目的不断加剧的灾难，仅在过去5年中确诊病例数量翻倍，占全球与抗微生物药物耐药性相关死亡病例的近三分之一1,2。传统上，DR-TB的成功治疗需要比药物敏感型结核病更长且毒性更强的二线治疗方案。此外，DR-TB患者通常存在显著的既往依从性困难，这正是导致耐药性最初出现的重要因素3。
与HIV感染中可用病毒载量监测治疗效果不同，结核病（TB）治疗反应的替代性终点指标在个体层面上存在延迟且不可靠4。监测患者依从性也具有挑战性，而依从性是亚治疗性抗结核药物浓度和治疗失败的重要预测因素。自我报告的依从性易受回忆偏倚以及患者取悦医护人员意愿的影响5,6。药片计数和用药事件监测系统（MEMS）可能更为客观7，但无法测量实际的药物摄入情况8,9,10。生物基质中的药物浓....
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方案
所有患者在采集毛发样本前均签署了书面知情同意书。本研究获得了开普敦大学和加州大学旧金山分校机构审查委员会的批准。
1. 毛发取样
- 获得书面知情同意书。
- 使用洁净的剪刀从枕部区域尽可能贴近头皮处剪取约20-30根头皮发丝。
- 用胶带缠绕在发丝远端以标明方向性。将头发样本折叠入铝箔纸中，并在室温下保存。标记发丝远端，以避免因额外接触近端而可能造成的污染。
- 除患者样本外，还需采集“空白头发”：即来自未服用结核病药物人员的头皮头发样本。每20份患者样本需采集大量空白头发（>30 mg）。
2. 药物提取
- 标记珠子管。每个患者样本需要一个管。标记12个管，分别标为“C0”至“C11”，对应12个校准点。标记一个低浓度质控管、一个中浓度质控管和一个高浓度质控管。最后，标记一个基质空白管。
- 打开装有头发样本的铝箔纸。如果头发样本长度超过3 cm，则从近端起截取3 cm，并使用该近端部分进行分析。
- 称取2 mg头发样本加入珠子管中。
- 称取2 mg空白头发加入另外16个珠子管中。这些将用于校准点、质控样本和基质空白。这些管将与患者样本采用相同的提取流程，但需在步骤2.8和2.9指定的浓度下加入药物参考标准品。
- 将所有珠子管放入均质器中....
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结果
一张包含全部11种耐药结核病药物确认浓度水平的色谱图示意图如图所示 图1不同仪器和色谱柱使用时，各分析物的保留时间可能发生变化，因此应分别确定其确切保留时间。
在其中一个校准样品（添加了耐药结核病药物参考标准品的空白毛发样本）中，某种特定药物（异烟肼，INH）的提取离子色谱图（EIC）如图2所示。通过定量离子和定性离子的跃迁来定性确认药物的存在，因为定量离子峰面积与定性离子峰面积之比在不同样品间保持恒定。同时监测内标物，以确保每次样品进样的信号均一化。
为演示目的，我们分析了来自南非西开普省在直接面视下服药（DOT）条件下接受耐药结核病（DR-TB）药物治疗的96例患者中的15份便利性采集的毛发样本。表6展示了每种分析物检测到的最低和最高浓度范围内的代表性DR-TB药物水平。尽管展示了15例患者的样本数据，但由于每位患者所使用的DR-TB药物组合不同，因此并非每种分析物均有1.......
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讨论
本文报告了我们开发并验证的一种方法的操作方案，该方法利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对用于治疗耐药结核病（DR-TB）的小份头发样本中的11种抗结核药物进行定量分析。此前尚无任何其他针对这11种药物在头发中定量分析的方法被开发、验证并发表。我们的方法仅需约3厘米长的20至30根头发（约2 mg），即可实现药物在亚纳克水平的定量，并且该方法已通过验证22。由于所需头发样本重量极低，参与研究的患者可隐秘地完成采样，并可能在无需担心暴露秃发头皮的情况下接受重复检测。我们此前已发表关于耐药结核病治疗药物在头发中的浓度与治疗结局之间关联的研究数据23。因此，该多组分分析面板方法的开发与验证代表了耐药结核病治疗药物监测领域的一项重大进展。
毛发所需的均质化技术与液体生物基质不同。将毛发纤维粉碎可使提取溶剂高效地接触毛发基质中的分析物。因此，本方法的一个重要特点是利用粉碎后的样品实现药物从毛发中快速、简便地提取。由于粉碎后毛发具有较大的可接触表面积，提取过程中的孵育时间仅为2小时，且由于样.......
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披露
本工作由美国过敏与传染病研究所 RO1 AI123024（共同项目负责人：John Metcalfe 和 Monica Gandhi）资助。
致谢
作者谨此感谢开普敦大学肺病研究所的Keertan Dheda教授、Ali Esmail博士以及Marietjie Pretorius，他们协助完成了本研究中毛发样本的采集工作。作者还衷心感谢参与本研究的各位受试者所做出的贡献。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 注射小瓶 | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 µL 注射小瓶内插管 | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead Ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| 均质管（2 mL 均质套件，2.8 mm 陶瓷珠，2 mL 微量管） | OMNI International | 19628 | |
| 贝达喹啉 | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| 贝达喹啉-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| 氯法齐明 | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| 氯法齐明-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| 一次性石灰玻璃培养管 | VWR | 60825-425 | |
| 乙胺丁醇 | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| 乙胺丁醇-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| 乙硫异烟胺 | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| 乙硫异烟胺-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| 玻璃瓶 | Corning | 1395-1L | |
| 加热振荡器 | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| 色谱纯乙腈 | Honeywell | 015-4 | |
| 色谱纯甲醇 | Honeywell | 230-1L | |
| 色谱纯水 | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| 异烟肼 | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| 异烟肼-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC 色谱柱，Synergi 2.5 µm Polar RP 100 A，100 × 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC 保护柱芯 | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC 保护柱套 | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS 定量分析软件 | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| 左氧氟沙星 | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| 左氧氟沙星-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| 利奈唑胺 | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| 利奈唑胺-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| 微量离心管 | E&K Scientific | 695554 | |
| 莫西沙星 | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| 莫西沙星-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| 普托马尼（PA-824） | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| 丙硫异烟胺 | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| 丙硫异烟胺-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| 吡嗪酰胺 | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| 吡嗪酰胺-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| 注射小瓶用隔垫盖 | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| TurboVap LV 浓缩仪 | Biotage | 103198/11 |
参考文献
- WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
- Kurbatova, E. V., et al. Pre....
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重印与许可
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