方法文章

经过验证的LC-MS/MS面板，用于在小头发样本中量化11种耐药结核病药物

DOI：

10.3791/60861

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2020年5月19日

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1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

本文内容

摘要

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目前分析患者是否遵守复杂耐药结核病（DR-TB）方案的方法可能不准确且资源密集。我们的方法分析头发，一个易于收集和储存的基质，浓度为11个DR-TB药物。使用LC-MS/MS，我们可以确定亚纳米格药物水平，可用于更好地了解药物依从性。

摘要

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耐药结核病 （DR-TB） 是一个日益严重的公共卫生威胁，评估治疗药物水平可能具有重要的临床益处。血浆药物水平是当前的黄金标准评估，但需要肾切除术和冷链，并捕获只是最近依从。我们的方法使用头发，一个易于收集并反映长期依从性的矩阵，测试11种抗结核药物。我们小组以前的工作表明，头发中的抗逆转录病毒药物水平与艾滋病毒结果有关。我们的DR-TB药物方法使用2毫克的头发（3厘米接近根），这是粉碎和提取甲醇。用一种LC-MS/MS方法分析样品，在16分钟内量化11种药物。11种药物的定量（LLOQs）下限范围从0.01纳克/毫克到1纳克/毫克不等。 药物存在通过比较两种质谱过渡的比率得到确认。样品使用药物与脱硝、15N-或13C标记药物等值的面积比进行量化。我们使用的校准曲线范围为 0.001-100 ng/mg。 该方法在直接观察治疗（DOT）上从DR-TB患者采集的头发样本的方便样本中的应用表明，在11种药物中的9种（异酰胺、苯丙胺、ethambutol、线胶、levofloacin、莫西氟辛、氟胺、贝达奎林、头头体）的线性动态范围内，头发中的药物水平。没有病人使用蛋白苯酰胺，并且测得的液酰胺水平接近其LLOQ（通过进一步的工作，而不是检查依西酰胺的代谢物是否适合监测暴露）。总之，我们描述了头发DR-TB药物的多机解毒板的开发，作为耐药结核病治疗期间治疗药物监测的技术。

引言

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在21世纪，耐药结核病（DR-TB）是本已薄弱的国家结核病控制计划中不断演变的灾难，仅在过去5年中，确诊病例就翻了一番，占全球抗微生物药物耐药性死亡总数的近三分之一,。与治疗对药物敏感的结核病相比，成功治疗DR-TB通常要求更长、毒性更大的二线治疗方案。此外，DR-TB患者在依从性方面往往存在重大挑战，导致最初出现耐药性。

与HIV感染不同，病毒载量可用于监测治疗，结核病治疗反应的代理终点在个别4级延迟且不可靠。监测患者依从性是亚治疗抗结核药物浓度和治疗失败的重要预测器，也是一项挑战。自我报告的依从性有召回偏见和取悦供应商的愿望55，6。6丸数和药物事件监测系统（MEMS）可以更客观7，但不测量实际药物消耗88，9，10。9,10生物基质中的药物水平可以提供依从性和药代动力学数据。因此，血浆药物水平通常用于治疗药物监测....

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方案

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所有患者在收集头发样本前都提供书面知情同意。我们获得了开普敦大学和加州大学旧金山分校的机构审查委员会的批准。

1. 头发取样

  1. 获得书面知情同意。
  2. 使用干净的剪刀从尽可能靠近头皮的区域切割大约20-30个头皮发丝。
  3. 在头发的远端放置胶带，以指示方向性。将头发样本折叠成铝箔正方形，并在室温下存放。标记头发的远端，以避免因对近端进行额外处理而可能存在的污染。
  4. 除了患者样本外，还收集"空白头发"：从未服用结核病药物的人那里采集头皮头发样本。收集大量的（每20个患者样本收集大量的空白头发）。

2. 药物提取

  1. 标签珠管。每个患者样本需要一根管子。标签 12 管从"C0"到"C11"，每 12 个校准点各一个。为低质量控制标记管、中质量控制管和高质量控制管。最后，为矩阵空白标记管。
  2. 打开铝箔方块，其中包含头发样本。如果头发样本长超过 3 厘米，则从近端切头发 3 厘米，并使用该近端部分进行分析。
  3. 将2毫克的头发样本称重到珠管中。
  4. 将 2 毫克的白发称重成 16 个额外的珠管。这些将用作校准点、质量控制和矩阵空白。管子将遵循与患者样本相同的提取程序，除了在步骤 2.8 和 2.9 中指示的水平上使用药物参考标准。
  5. 将所有珠管放入均质器中。以 6.9....

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结果

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图1显示了所有11种DR-TB药物的确诊水平的色谱图图图。使用不同的仪器和列时，每个护身奶的保留时间可能会更改，因此应单独确定确切的保留时间。

图2显示了一种特定药物（isoniazid，INH）在一种校准器（空白头发样本与DR-TB药物参考标准尖刺）的提取的Ion色谱仪（EIC）。定量器和限定符过渡用于定性地确认药物的存在，因为定量器面积和限定符区域之间的比率在样品之间保持不变。内部标准也得到监控，以确保每个样品注射都规范化。

为了进行演示，我们分析了来自南非西开普的96名在DOT条件下服用DR-TB药物的96名患者的15个头发样本的方便样本。表6列出了针对每种机解利剂测量的最低和最高水平的DR-TB药物的代表性水平。虽然提供了15个患者样本的数据，但每个的分析物没有报告15个级别，因为每个患者都服用了不同组合的DR-TB药物。没有一个病人服用蛋白酰胺，只有一个病人服用前体.......

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讨论

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我们在这里报告我们开发和验证的方法的协议，用于量化11种抗结核病药物，用于治疗使用LC-MS/MS的小头发样本中的DR-TB。以前没有其他方法来量化头发中的这11种药物，但已经开发、验证和发布。我们的方法可以量化亚纳米克的药物水平，只有20-30发丝长约3厘米（约2毫克），并已经过验证22。头发分析的低重量意味着参与研究的患者可以谨慎参与，并有可能返回重复测试，而不必担心暴露秃头皮。我们先前已公布有关头发DR-TB药物水平与DR治疗结果23日之间的关联数据。因此，这种多机类面板方法的开发和验证标志着DR-TB治疗药物监测领域的一个重大进展。

头发需要与液体生物基质所需的不同均质技术。毛丝的粉碎允许提取溶剂有效地进入头发基质中的分析物。因此，我们方法的一个重要特征是使用粉碎样品快速、简便地提取头发中的药物。提取过程中的孵育时间只有两小时，由于粉碎头发的表面面积大，而且由于样品体积小（2毫克），没有清理步骤。不过，必须注意在提取过程中限制药物降解。该协议使用双循环粉碎，周期之间的冷却周期为 .......

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披露

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这项工作得到了国家过敏和传染病研究所RO1 AI123024（共同机构：约翰·梅特卡夫和莫妮卡·甘地）的支持。

致谢

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作者要感谢开普敦大学肺研究所的基尔坦·迪达教授、阿里·伊斯梅尔博士和玛丽特杰·普雷托利斯教授为这项研究收集头发样本提供便利。作者还感谢本研究参与者的贡献。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2毫升注射瓶安捷伦科技5182-0716
250 uL 注射瓶插入件安捷伦科技5181-8872
珠状破碎器24OMNI国际19001
破珠管（2 mL 珠子套件，2.8mm 陶瓷，2 mL 微管）OMNI国际19628
贝达奎林多伦多研究化学B119550
贝达喹林-d6多伦多研究化学B119552
氯法齐明多伦多研究化学C324300
氯法齐明-d7多伦多研究化学C324302
一次性石灰玻璃培养管VWR60825-425
乙胺丁醇多伦多研究化学E889800
乙胺丁醇-d4多伦多研究化学E889802
乙酰胺多伦多研究化学E890420
乙硫酰胺-d5清合成器CS-O-06597
甲酸西格玛-奥尔德里奇F0507-100毫升
玻璃瓶康宁1395-1L
热摇床贝尔科玻璃公司7746-32110
高效液相色粘液析理安捷伦科技无限1260
高效液相色谱级乙腈霍尼韦尔015-4
高效液相色谱级甲醇霍尼韦尔230-1L
高效液相色谱级水Aqua 解决方案公司W1089-4L
异 烟 肼多伦多研究化学I821450
异烟肼-d4多伦多研究化学I821452
LC柱，Synergi 2.5微米 极地 RP 100 A 100 x 2 毫米现象00D-4371-B0
LC护罩弹药现象AJ0-8788
LC护罩弹夹现象AJ0-9000
LC-MS/MS定量软件科学版多量化 2.1
左氧氟沙星西格玛-奥尔德里奇1362103-200MG
左氧氟沙星-d8多伦多研究化学L360002
利奈唑胺多伦多研究化学L466500
利奈唑胺-d3多伦多研究化学L466502
微型离心管E&K科学695554
莫西氟沙星多伦多研究化学M745000
莫西氟沙星-13C，d3多伦多研究化学M745003
MS/MS科学版三四轮五联5500
OPC 14714多伦多研究化学O667600
Pretomanid（PA-824）多伦多研究化学P122500
前硫胺酰胺多伦多研究化学P839100
前硫胺酰胺-d5多伦多研究化学P839102
吡嗪酰胺多伦多研究化学P840600
吡嗪酰胺-15N，d3多伦多研究化学P840602
注射瓶用的隔膜盖安捷伦科技5185-5862
Turbovap LV 蒸发器生物沉淀103198/11

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  2. WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
  3. Kurbatova, E. V., et al. Pre....

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