含溶血磷脂的温度敏感脂质体的微流控制备

摘要

本方案介绍了利用交错人字形微混合器微流控装置制备热敏脂质体的优化参数。该方法还可实现阿霉素和吲哚菁绿的共包封，并通过光热触发释放阿霉素，从而实现可控/触发式药物释放。

摘要

本方案可实现低温敏感脂质体（LTSLs）的高通量连续制备，此类脂质体能够包载化疗药物（如阿霉素，DOX）。为实现该目的，将乙醇脂质混合物与硫酸铵溶液注入交错人字形微混合器（SHM）微流控装置中。SHM可使两种溶液快速混合，为脂质体的自组装提供均一的溶剂环境。收集所得脂质体后，首先进行退火处理，随后透析以去除残留乙醇。通过尺寸排阻色谱法置换外部溶液，建立硫酸铵pH梯度。随后，DOX可通过远程加载方式高效包载入脂质体中（包封效率> 80%）。所获得的脂质体粒径均一，Z均粒径为100 nm。在轻度热疗（42 °C）条件下，脂质体可实现包载DOX的温度触发式爆发性释放。此外，还可将吲哚菁绿（ICG）共载入脂质体，以实现近红外激光触发的DOX释放。该微流控方法可确保LTSLs的高通量、可重复且可放大的制备过程。

引言

LTSL 制剂是一种具有临床相关性的脂质体制剂，已开发用于递送化疗药物阿霉素（DOX），并可在临床可实现的轻度热疗条件（T ≈ 41 °C）下实现药物的快速爆发性释放¹。LTSL 制剂由1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）、溶血脂质1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（MSPC；M 代表 "mono"）以及聚乙二醇化脂质1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG₂₀₀₀）组成。当达到相变温度（T_m ≈ 41 °C）时，溶血脂质与 DSPE-PEG₂₀₀₀ 共同促进膜孔的形成，从而导致药物的快速释放²。LTSL 的制备主要采用整体自上而下的方法，即脂质膜水合与挤出法。目前仍难以稳定地制备出性质一致且足以满足临床应用需求的大批量产品³。

微流控技术是一种用于制备脂质体的新兴方法，具有可调节纳米颗粒尺寸、良好的重现性和可扩展性³。一旦优化了生产工艺参数，即可通过并行化方式提高产量，所得产物的性质与实验室规模制备的样品完全一致³....

方案

1. 仪器设备设置

1. 按以下步骤组装注射泵和SHM。
   1. 使用泵间网络线缆，将次级注射泵（泵02，用于水溶液）的“连接至计算机”端口与主注射泵（泵01，用于乙醇脂质溶液）的“连接至网络”端口相连（图1，黄色）。
   2. 使用PC至泵网络线缆，将主泵的“连接至计算机”端口与计算机的“RS232串行”端口连接（图1，蓝色）。
   3. 使用螺母和卡套将管路连接至SHM的各个入口和出口。使用另一个螺母、卡套和连接接头组件，将两个入口端管路末端转换为雌性鲁尔接头。入口处使用较长的管路可更方便地连接至注射器（图2）。
2. 设置泵控制软件。
   1. 使用注射泵上的“设置”按钮，将主注射泵和次级注射泵的地址分别设置为“Ad:01”和“Ad:02”。此操作仅需在首次使用时进行。
   2. 在计算机上打开泵控制软件。两个注射泵应被自动检测到，并伴随一声蜂鸣音。若未检测到，请点击泵和搜索泵以更新连接（

结果

通过微流控技术制备LTSLs需要使用DPPC/MSPC/DSPE-PEG₂₀₀₀（80/10/10，摩尔比；LTSL10）的脂质组成。图7A（左）显示了步骤2.9制备的LTSL10的外观，为澄清且无黏性的液体。LTSL10配方是在传统配方LTSL4（DPPC/MSPC/DSPE-PEG₂₀₀₀，86/10/4，摩尔比）基础上开发的，因为LTSL4会形成凝胶状的黏性样品，如样品中滞留大量气泡所示（图7A；右）。

LTSL10 的 DLS 测量结果（图7B，红色）显示，LTSL10 的 Z-平均直径和分散度分别为 95.28 ± 7.3.......

讨论

本方案描述了使用交错人字形微混合器（SHM）制备低温敏感脂质体（LTSLs）的方法。LTSL10配方可在临床可实现的42 °C热疗温度下，于5分钟内实现阿霉素的温度触发式爆发性释放。吲哚菁绿（ICG）也可共载入脂质体，用于光热加热触发DOX释放。该方法基于以下三个步骤：（i）在SHM中通过乙醇与硫酸铵溶液的快速、混沌混合，形成均一的溶剂环境，促使磷脂自组装形成脂质体¹¹；（ii）对脂质体进行退火处理，以维持脂质双分子层的完整性，这对DOX的载药至关重要；（iii）利用硫酸铵pH梯度实现DOX的远程载药¹⁷。由于本方案所用设备均为市售现成产品，且参数已优化，因此即使无微流控经验或相关背景知识的操作人员亦可顺利实施该方法。

该方案中最关键的步骤之一是确保整个装置正确固定，并能顺利注入液体（步骤2.5）。由于脂质体自组装的可重复性依赖于均一的溶剂环境，任何不稳定性（例如注射器松动或引入气泡）都会干扰液体流动的稳定性，导致脂质体粒径和分散性不理想。这也是步骤2.8的原理所在：在达到稳定流动之前，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC）	Lipoid	PC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（DSPE-PEG2000）	Lipoid	PE 18:0/18:0-PEG 2000 （MPEG 2000-DSPE）
1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷胆碱（MSPC）	Avanti Polar Lipids	855775P-500MG	由 Sigma-Aldrich 分销；也称为 Lyso 16:0 PC （注意：不要与也称为MSPC的14:0/18:0 PC混淆）
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Sigma-Aldrich	H3375-100G
适配器，雌性鲁尔锁扣转1/4"-28UNF	IDEX Health &科学	P-624	需要2个单元。用于入口
接头，连接组件，1/4"-28UNF	IDEX Health &科学	P-630	需要 2 个单位。（每个单位包含 2 个螺母和 2 个卡套）
硫酸铵 ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	31119-1KG-M
比约小瓶	VWR	216-0980	7 mL，透明，聚苯乙烯小瓶
离心过滤装置	Sigma-Aldrich	UFC801008	10 kDa 截留分子量，Amicon Ultra-4 离心滤过装置
离心	ThermoFisher Scientific	Heraeus Megafuge 8R	使用 HIGHConic III 固定角转子
比色皿	Fisher Scientific	11602609	一次性聚苯乙烯比色皿，低容量，用于动态光散射测量
透析试剂盒 - Pur-A-Lyzer Maxi	Sigma-Aldrich	PURX12015-1KT	12-14 kDa 分子量截留值
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	34943-1L-M
DLS 仪器	马尔文帕纳科	Zetasizer Nano ZS90
盐酸阿霉素（DOX）	Apollo Scientific	BID0120
DSC 仪器	TA Instruments	TA Q200 DSC
DSC Tzero 密封盖	TA Instruments	901684.901	用于DSC测量
DSC Tzero 坩埚	TA Instruments	901683.901	用于DSC测量
DSC Tzero 样品压片工具包	TA Instruments	901600.901	用于DSC测量
乙醇	VWR	20821.330	绝对的 ≥99.8%
FC-808 光纤耦合激光系统	CNI Optoelectronics Tech	FC-808-8W-181315	包含 FOC-01-B 光纤准直器。
卡套，1/4"-28UNF 至 1/16" 光密度	IDEX Health &科学	P-200	出口处
光纤温度探针	Osensa	PRB-G40
玻璃交错人字形微混合器（SHM）	达尔文微流控	人字形混合器 - 玻璃芯片
加热带	Omega	DHT052020LD	可替换为其他注射泵加热器，例如 "高通量连续制备" 或 "SRT系列" 用于较慢的加热。240V 型号需手动接线至三针插头
吲哚菁绿	Adooq	A10473-100	由英国Bioquote Limited公司经销
鲁尔锁式注射器，5 mL	VWR	613-2043	Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 三件式注射器，外径 12.45 mm
微孔板读板仪	BMG Labtech	FLUOstar Omega	安装有485 nm（激发）和590 nm（发射）滤光片
96孔微孔板，黑色，平底	ThermoFisher Scientific	611F96BK	用于微孔板读数仪中的荧光测定
96孔微孔板，透明，平底	Grenier	655101	用于吸光度测定的微孔板读数仪
螺母，1/4"-28UNF 转 1/16" 光密度	IDEX Health &科学	P-245	出口处
Aladdin 泵网络电缆，7 英尺	World Precision Instruments	NE-PC7	可选：注射泵可手动操作
泵控制软件 - SyringePumpPro 软件许可（2 个）	World Precision Instruments	SYRINGE-PUMP-PRO-02	可选：注射泵可手动操作
Aladdin 泵到泵网络电缆，7 英尺	World Precision Instruments	NE-NET7	可选：注射泵可手动操作
尺寸排阻色谱柱（SEC）	GE生命科学	17085101	PD-10 脱盐柱中的 Sephadex G-25 树脂
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	31434-1KG-M
氢氧化钠（NaOH）	Sigma-Aldrich	S5881-500G
注射泵 & Cable（DUAL-PUMP-NE-1000）	World Precision Instruments	ALADDIN2-220/AL1000-220
恒温器温度控制器	Inkbird	ITC-308	可替换为其他注射泵加热套件/恒温器
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
管路，ETFE（1/16英寸）" OD	IDEX Health &科学	1516
USB 转 RS-232 转换器	World Precision Instruments	CBL-USB-232	可选：适用于无 RS-232 端口的计算机
水浴	Grant Instruments Ltd.	JB Nova 12