激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

摘要

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。

摘要

胶质瘤是一种具有侵袭性和异质性的原发性脑肿瘤。假栅栏样结构、微血管增生、间充质转化和坏死等特定的组织学模式构成了高级别胶质瘤组织学异质性的特征。本实验室已证实，富含间充质样细胞的高密度区域（称为肿瘤间质流，oncostreams）的存在与肿瘤恶性程度相关。我们开发了一种独特的方法，用于解析胶质瘤生长和侵袭的潜在机制。本文中，我们描述了一种综合性实验方案，该方案结合激光显微切割（LMD）与RNA测序技术，用于分析肿瘤内异质性多细胞结构（即间充质区域或肿瘤侵袭区域）中mRNA的差异表达。该方法能够良好地保持组织形态学结构和RNA完整性。我们对灌注、冷冻、包埋、切片和染色等步骤进行了优化，以维持组织形态并获得高质量的激光显微切割样本。结果表明，使用30%蔗糖对荷胶质瘤小鼠进行灌注，可获得良好的组织形态和RNA质量。此外，采用4%焦宁紫（Cresyl violet）和0.5%伊红（eosin）对肿瘤切片染色，可在保持RNA完整性的前提下实现良好的细胞核和细胞质染色效果。所描述的方法具有高灵敏度和高度可重复性，可用于研究多种肿瘤模型中的肿瘤形态学特征。综上所述，我们介绍了一套完整的LMD操作流程，该流程可在保持组织形态和RNA质量的基础上，用于后续测序分析，以研究实体瘤内部异质性多细胞结构的分子特征。

引言

胶质瘤是中枢神经系统最具侵袭性的原发性肿瘤，具有高度侵袭性和异质性¹。对肿瘤细胞和分子组分的分析将揭示新的治疗靶点。

在目前可用的多种方法中，冷冻脑肿瘤组织的激光显微切割（LMD）是一种经济可靠的技术，可实现从肿瘤组织中分离特定解剖区域或特定细胞群体，以研究其分子特征^2,3。LMD 可用于分析选定的单个细胞或多细胞结构的 mRNA 基因表达谱^4,5。通过 LMD 可深入探究肿瘤进展过程中发生的分子事件的机制。为获得最佳的组织形态学光学分辨率和 RNA 质量，需优化肿瘤组织的处理方法⁶。尽管多聚甲醛固定最适用于形态学分析，但在此条件下 RNA 质量会受到影响并发生降解，导致 RNA-seq 分析的 RNA 质量较差。使用冷冻组织切片可避免冰晶形成，而冰晶可能破坏细胞膜并在细胞内形成孔洞，因此仍是进行 RNA-Seq 分析的最佳选择⁷。

本文介绍了一种优化的切片固定与染色方法，用于处理小鼠脑肿瘤冷冻组织以进行激光显微切割（LMD）。为防止组织中形成冰晶，我们使用30%蔗糖溶液对小鼠进行灌注。该溶液可破坏极性水分子之间的相互作用，从而抑制冰晶的形成，保持组织形态完整性。组织染色对于区分并获取肿瘤内特定细胞群体或解剖结构上不同的区域至关重要。为维持RNA完整性，必须使用无害染料对组织进行固定和染色。已有研究表明，使用苏木精/伊红（H&E）染色会破坏RNA完整性⁸。我们采用乙醇、4%焦宁紫（Cresyl violet）和0.5%伊红Y（eosin Y）溶液对目标组织进行固定和染色。焦宁紫是一种嗜酸性染料，可将细胞核染成深蓝色；伊红Y为嗜碱性染料，可染色细胞的碱性组分，从而区分细胞质与其他细胞结构⁸。这两种染料均可溶于乙醇，且不会降低RNA质量。为避免组织损伤并保持细胞结构的高光学分辨率，我们在进行LMD前对组织切片进行了封片处理⁹。

方案

本研究所涉及的所有使用实验动物的方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意：可使用来自基因工程小鼠模型（GEMM）或稳定细胞系的胶质瘤神经球进行小鼠颅内肿瘤移植¹⁰，并用于激光捕获显微切割（LMD）和RNA测序分析。这些细胞组成型表达萤光素酶和GFP蛋白，后续将用于肿瘤生长分析和定位。

1. 利用基因工程胶质瘤模型衍生的神经球建立小鼠颅内胶质瘤模型

1. 采用先前所述的方案，从基因工程小鼠（GEMM）模型中建立神经球细胞的原代培养^10,11.
2. 按照以下方法制备神经球培养基：在500 mL的Dulbecco改良Eagle培养基F-12（DMEM/F12）中加入10 mL 50倍浓度的B-27、5 mL 100倍浓度的N-2神经元培养添加剂、5 mL 100倍浓度的抗生素-抗真菌剂以及1 mL Normocin。接种神经球前，在培养基中添加20 ng/mL人重组EGF和FGF。
3. 在组织培养孵箱中于37℃培养胶质瘤神经球 °C 和 5% CO₂ 在颅内肿瘤移植前 2-3 天。
4. 手术当天，收集胶质瘤神经球，以550 × g离心 x g 室温下静置5分钟。小心移除上清液，勿扰动细胞沉淀。
5. 为解离神经球，将细胞沉淀重悬于1 mL细胞解离溶液中，并在37 °C孵育 °C 和 5% CO₂ 孵育2-4分钟后，使用1 mL移液枪将神经球上下吹打，以确保形成单细胞悬液。
6. 通过加入10 mL未添加补充物的DMEM/F12培养基稀释神经球悬浮液，以灭活细胞解离溶液。在550 × g条件下离心神经球 x g 室温下静置5分钟，小心移除上清液。
7. 将细胞沉淀重悬于 100 µL DMEM/F12 培养基（不含任何添加剂）。将细胞悬液按 1:50 比例稀释，然后加入 50 µ加入 L 型台盼蓝以计数活细胞。使用以下公式计算细胞浓度：
   细胞/mL = [((∑（每平方计数的细胞数 / 计数的方格数）× 50 × 10,000 个细胞/毫升
8. 在确定细胞数量后，为达到每微升30,000个细胞的目标浓度，µL 在 100 µL体积，离心神经球并将其重悬于适当体积的不含任何添加剂的DMEM/F12中。
9. 将神经球置于预标记的0.6 mL离心管中，并置于冰上。
10. 在植入前配制麻醉剂、镇痛剂和麻醉逆转剂的工作溶液：对于氯胺酮/右美托咪定麻醉，将0.6 mL的100 mg/mL盐酸氯胺酮和0.8 mL的0.5 mg/mL盐酸右美托咪定加入含8.6 mL无菌0.9% NaCl的容器中。对于布托啡诺镇痛，将1 mL的0.3 mg/mL布托啡诺加入含9 mL 0.9% NaCl的容器中。对于阿替美唑麻醉逆转，将1 mL的5 mg/mL阿替美唑加入含9 mL 0.9% NaCl的容器中。
11. 使用6至8周龄的C57BL/6J雌性小鼠进行颅内肿瘤移植。
12. 在获准进行啮齿类动物存活手术的房间内，准备颅内肿瘤移植所需的无菌器械。在配备已灭菌10 µ配备可拆卸33G针头的L Hamilton注射器。手术之间使用微珠灭菌器对工具进行灭菌。
13. 用步骤1.11中配制的麻醉剂溶液（氯胺酮：75.0 mg/kg 和右美托咪定：0.5 mg/kg）对小鼠进行单次腹腔（i.p.）注射以实施麻醉。约250 µ一只体重为20 g的小鼠将接受L体积的麻醉溶液。在继续操作前，需确保小鼠对足底反射无反应。
14. 当小鼠处于深度麻醉状态后，在其眼睛上涂抹无菌凡士林眼用润滑剂以防止干燥。剃除小鼠颅骨部位的毛发，并对剃毛区域使用10%聚维酮碘外用溶液进行消毒。
15. 将小鼠颅骨固定于立体定位仪中。首先，用镊子小心打开口腔，轻轻拉出舌头并移至口腔一侧，以防止窒息。用镊子保持口腔张开，将上门齿嵌入立体定位仪齿条的钥匙孔中。
16. 用耳朵固定小鼠头部，将耳杆抵住眶后骨并固定。确保小鼠颅骨与手术台面水平。固定耳杆时需小心，避免对颅骨施加压力。接着，小心固定鼻杆。
17. 使用15号手术刀片沿小鼠头部做切口，暴露颅骨。使用科利布里牵开器牵开切口处的皮肤。用无菌涂药器去除所有颅骨周围组织。
18. 确定前囟位置，并将 Hamilton 注射器的针头直接置于其上方。利用定位架，将针头置于前囟前 1 mm、外侧 1.5 mm 处。使用 26G 针头在颅骨上划痕以标记该位置。
19. 使用配备0.45 mm钻头的无线电钻在目标位置钻出骨孔。持续钻孔直至到达下方的硬脑膜。用26G针头小心移除骨孔内残留的骨组织。
20. 使用移液器充分匀浆细胞，并吸取 7 µ将神经球悬液注入注射器中。为确保注射器正常工作，先排出1 µ将悬浮液的L滴加到浸有70%酒精的垫片上。
21. 将针头降至硬脑膜表面，再将注射器向下推进3.5 mm，然后回撤0.5 mm，以在脑内形成0.5 mm的空间，用于注射神经球时沉积。
22. 将针头留置原位 2 分钟以达到压力平衡。缓慢而平稳地注入 1 µ在1分钟内缓慢注入细胞悬液。让细胞在脑内静置6分钟。在2分钟内缓慢而平稳地将注射器从脑组织中撤出。
23. 使用无菌生理盐水溶液冲洗颅骨表面三次。将注射器中多余的细胞滴加至70%酒精垫上，并用另一块70%酒精垫擦拭针头使其清洁。用无菌PBS冲洗注射器，以防止针头堵塞。
24. 移除拉钩，小心地将小鼠从立体定位框架中取出。使用3-0尼龙缝线、镊子和持针器缝合切口。
25. 注射阿替美唑（1.0 mg/kg），约100 µL 用于 20 g 小鼠。皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg），约 70 µ对于20 g的小鼠，L。将术后小鼠放入清洁的恢复笼中，并监测直至其清醒并活跃。

2. 动物灌注与脑组织保存

1. 为监测肿瘤进展，使用活体成像系统检测活体生物发光信号，直至动物出现肿瘤负荷迹象。当信号达到每秒10⁶至10⁷光子时，处死小鼠。
2. 对出现肿瘤负荷迹象的小鼠，通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮（75.0 mg/kg）和右美托咪定（0.5 mg/kg）溶液进行麻醉，向体重为20 g的小鼠注射约250 µL。随后确认小鼠对足底反射无反应。
3. 使用镊子夹住腹腔上方皮肤，用大型解剖剪刀穿透腹壁，刺破膈肌，剪开肋骨，形成“Y”形切口。
4. 将钝头20G套管插入小鼠心脏的左心室，剪开右心房以促进血液流出。
5. 使含氧的Tyrode's溶液（0.8% NaCl、0.0264% CaCl₂、0.005% NaH₂PO₄、0.1%葡萄糖、0.1% NaHCO₃、0.02% KCl）流经小鼠循环系统，直至肝脏和肺部因血液清除而完全变白（约5分钟）。
6. 继续用Tyrode's溶液配制的30%蔗糖溶液灌注动物15分钟。为评估灌注效果，确认颈部、尾部和腿部在30%蔗糖循环后变得僵硬。
7. 使用小型解剖剪刀沿中线剪开头皮，从枕骨开始向前至吻部，以暴露颅骨。
8. 使用咬骨钳从枕骨处开始击穿颅骨，并向前推进，完全暴露脑组织表面。然后将头部侧放，解剖脑干底部的神经，使脑组织从颅骨中分离。
9. 使用无RNase水配制30%蔗糖溶液，并通过40 µm尼龙滤膜过滤，以减少RNA降解。
10. 为最大限度促进蔗糖溶液渗透，将分离的脑组织置于30%蔗糖溶液中，4 °C下过夜保存。在进一步处理前，确保脑组织沉降至含蔗糖溶液管的底部。

3. 携带胶质瘤的脑组织冷冻保存

1. 在冷冻保存脑组织之前，准备一个装有低温异戊烷（2-甲基丁烷）的容器，并将其放入盛有液氮的容器中。让溶剂充分冷却。
2. 将脑组织从30%蔗糖溶液中取出，并用滤纸吸干表面液体。
3. 用永久性记号笔标记冷冻模具。小心地将约5 mL OCT包埋剂（最佳切割温度化合物）加至冷冻模具中央，避免产生气泡。
4. 将脑组织按所需方向放入含有OCT的冷冻模具中。继续添加OCT直至完全浸没脑组织。用洁净的镊子迅速将装有OCT和脑组织的冷冻模具放入低温异戊烷/2-甲基丁烷中。
5. 待OCT完全固化（约30–40秒）后，立即取出冷冻模具及脑组织，置于干冰中。切勿将含脑组织的模具在2-甲基丁烷中停留超过2分钟，以免导致固化的OCT出现裂纹。用铝箔包裹冷冻模具及脑组织，并于-80 °C保存。

4. 切片冷冻脑肿瘤组织

1. 用样本信息标记2 µm聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）载玻片。切片后，组织切片将直接放置在这些载玻片上。
2. 将冷冻切片机舱室温度设置在-20至-24 °C之间。切片前，将样本块放入冷冻切片机舱室内，使其在舱室内温度下平衡30-60分钟。
3. 用100%乙醇清洁冷冻切片机舱室和刀架，并用RNase清除溶液喷洒将要使用的刷子。在冷冻切片机舱室内操作，取出模具，用OCT将含脑组织的OCT包埋块固定在冷冻切片机样品盘上。将包埋块放入样品头中，并与刀片对齐。
4. 将一次性刀片安装到切片刀架中。
5. 以10 µm厚度对脑组织进行切片。确保组织无条痕或划痕。使用画笔小心地将组织在切割表面展平并展开卷曲部分。
6. 小心地将含有脑组织切片的样本转移至无RNase的PEN玻璃载玻片上。用手指将带正电荷的玻璃载玻片朝向组织方向翻转，并平稳地将载玻片压向组织切片。
   注意：手部温度有助于组织附着于载玻片。
7. 将脑组织切片转移至载玻片后，将载玻片置于冷冻切片机舱室内的盒子中，随后储存在-80 °C条件下。切勿将载玻片置于室温下。
   注意：组织折叠和撕裂较为常见。为确保后续分析的准确性，应尽量减少此类人为假象。

5. 冷冻保存脑组织切片的固定与染色

1. 为保持 RNA 完整性，使用 RNase 清洁液彻底清洁所有将使用的器械。在通风橱内进行固定和染色操作。
2. 在洁净的无 RNase 50 mL 离心管中配制所述固定液。所有溶液均需在染色当天使用无 RNase 水配制。
3. 在进行激光显微切割的当天，配制 100%、95%、70% 和 50% 乙醇溶液。将溶液置于密封管中，室温保存。
4. 在 75% 乙醇溶液中配制 4% 焦宁紫（Cresyl violet）和 0.5% 伊红 Y（eosin Y）。剧烈涡旋振荡溶液 1 分钟，并通过 0.45 µm 尼龙滤膜过滤，以去除未溶解粉末的残留物。
5. 将组织切片放入含 95% 乙醇的容器中 30 秒。将切片转移至含 75% 乙醇的离心管中，停留 30 秒。
6. 将切片转移至 50% 乙醇中，停留 25 秒。此时 OCT 包埋剂将被溶解。将切片转移至 4% 焦宁紫溶液中染色 20 秒，随后转移至 0.5% 伊红 Y 溶液中染色 5 秒。
7. 从染色液中取出切片，用滤纸轻轻吸干。然后将切片放入 50% 乙醇中 25 秒。转移至 75% 乙醇中 25 秒。再转移至 95% 乙醇中 30 秒。最后转移至 100% 乙醇中 60 秒。
8. 用二甲苯冲洗切片。将切片放入盛有二甲苯的容器中，静置 3 分钟。
9. 在无 RNase 水中配制封片介质（如 Pinpoint gum）。为封固小鼠脑组织切片，按 1:10 的比例将封片介质稀释于无 RNase 水中。
10. 将切片在无 RNase 的表面上室温干燥 10 秒。在二甲苯完全挥发前，立即进行切片封片操作。
11. 使用无菌且无 RNase 的细毛笔，将封片液轻轻均匀地涂抹在切片的组织表面。等待 10–20 秒后，立即将组织切片转移至显微切割平台。
    注意：封片介质与无 RNase 水的配比根据具体组织类型而有所不同。该配比可在不影响 RNA 完整性的前提下，有效保持胶质瘤组织的形态，适用于激光显微切割。

6. 激光捕获显微切割

注意：需要使用激光捕获显微切割显微镜对肿瘤组织内特定区域进行激光显微切割。为缩短组织激光显微切割所需时间，在固定和染色前应提前准备激光捕获显微切割显微镜。

1. 启动系统时，首先打开电源插座，然后开启激光器。接着打开显微镜控制器和计算机，启动激光显微切割（LMD）软件。
2. 在显微镜控制下，选择10倍放大倍数。在激光控制下，设置组织切割的激光参数：为获得最佳切割效果，将激光频率设为120 Hz，并始终将激光电流设为100%。
3. 为实现精确的激光显微切割，将速度设为10，孔径设置为2.0–10.0 µm，激光功率设为53。若激光功率过高，可能导致玻璃表面蚀刻。
4. 装载用于收集组织的收集器，以便在切割后捕获组织。点击第二个“卸载”按钮，取出空收集器，将含有30 µL裂解液的无DNase/RNase的0.5 mL平头PCR管装入收集器中，再将收集器放回仪器内，然后在软件中点击继续以进入下一步。
5. 将已处理（固定并染色）的样本载入显微镜。首先在LMD软件中点击卸载，然后将样本安装在载物片支架上，并将支架放置于载物台上。随后在软件中点击继续以继续操作。
6. 在切割形状窗口中，选择绘制并切割。使用显微镜控制功能找到目标区域，绘制感兴趣区域（ROI），并选择目标收集管。可在同一张切片上同时绘制多个ROI，以进行不同区域的显微切割。
7. 点击开始切割以执行组织显微切割。完成目标区域切割后，从支架中取出收集管，并立即置于干冰上。随后将收集到的RNA组织样本转移至-80 °C进行长期保存。

7. 胶质瘤组织显微切割后的RNA提取

1. 为从激光显微切割样本中提取 RNA，请使用专为小样本和低 RNA 产量优化的 RNA 提取试剂盒（参见材料表）。遵循制造商的说明进行操作。所有提取步骤均在室温（25 °C）下进行。为保持 RNA 质量，操作应迅速，并按制造商要求配制所有溶液。
2. 用含 1% β-巯基乙醇的裂解缓冲液将样本体积调至 350 µL。涡旋振荡样本 40 秒，以降低样本黏度并提高 RNA 在离心柱中的洗脱效率。
3. 将全部样本转移至置于 2 mL 收集管中的 gDNA 去除离心柱。在 8,000 x g 条件下离心 30 秒。保留穿流液，并确保离心后柱上无残留液体。
4. 向穿流液中加入 350 µL 70% 乙醇，用移液器反复吹打充分混匀。将样本转移至置于 2 mL 收集管中的 RNA 洗脱离心柱。轻轻盖上盖子，在 8,000 x g 条件下离心 15 秒。弃去穿流液，保留离心柱。
5. 向 RNA 洗脱离心柱中加入 700 µL RNA 洗涤缓冲液 1（含 20% 乙醇、900 mM GITC、10 mM Tris-HCl，pH 7.5）。轻轻盖上盖子，在 8,000 x g 条件下离心 15 秒，以洗涤离心柱膜。弃去穿流液。
6. 离心后，小心将 RNA 洗脱离心柱从收集管中取出，避免柱体接触穿流液。
7. 向离心柱中加入 500 µL 第二种 RNA 洗涤缓冲液（含 80% 乙醇、100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl，pH 7.5）。盖上盖子，在 8,000 x g 条件下离心 20 秒，以洗涤柱膜。弃去穿流液。
8. 为清洗 RNA 洗脱柱，加入 500 µL 80% 乙醇，盖上盖子，在 8,000 x g 条件下离心 2 分钟。弃去含有洗脱液的收集管。
9. 更换新的收集管，打开离心柱盖子，在 8,000 x g 条件下离心 5 分钟以干燥柱膜。弃去收集管。
10. 将 RNA 洗脱离心柱放入新的 1.5 mL 收集管中。向离心柱膜中心直接加入 12 µL 预热至 37 °C 的无 RNase 水。静置 4 分钟后，全速离心 1 分钟以洗脱 RNA。

8. RNA 质量控制、文库构建与 RNA-Seq 分析

1. RNA 提取与纯化后，使用适用于皮摩尔浓度 RNA 分离的专用试剂盒，按照制造商说明进行 RNA 扩增并构建 cDNA 文库（参见材料表）。遵循制造商的说明操作，并清洁工作区，以避免其他 PCR 产物污染及样品被核酸酶降解。
2. 若 RNA 的 RIN 值大于 4，表明 RNA 质量良好或仅部分降解，可进行片段化步骤。所有试剂均需在冰上准备。
3. 按指示配制主混合液（表 1）。在无核酸酶的薄壁 0.2 mL PCR 管中配制反应体系。将 PCR 管置于带热盖的热循环仪中，在 94 °C 下孵育。片段化孵育时间取决于 RNA 质量：RIN ≥ 7 时为 4 分钟，RIN 5–6 时为 3 分钟，RIN 4–5 时为 2 分钟。
4. 孵育结束后，将 PCR 管置于先前冷却至 -20 °C 的 PCR 冷却架上，静置 2 分钟。
5. 针对每个 RNA 样品管，配制第一链合成反应主混合液（表 2）。将 PCR 管置于带热盖的热循环仪中，按表 3所述条件进行孵育。cDNA 产物可在 -20 °C 冷冻保存最多两周，再进入下一步。
6. 按表 4所示配制 PCR 主混合液。将 PCR 管放入带热盖的热循环仪中，按表 5所示设置运行 PCR 反应。
7. 使将用于 DNA 纯化的磁珠恢复至室温。待其升温后，向每个样品中加入 40 µL 磁珠。涡旋混匀后短暂离心，使液体沉降至管底。室温孵育 8 分钟，使 DNA 与磁珠充分结合。
8. 将 PCR 管置于磁力分离装置上，静置约 5 分钟，或直至溶液完全澄清。保持 PCR 管在分离装置上，用移液器小心吸除上清液，避免扰动磁珠。
9. 保持 PCR 管在分离装置上，向磁珠中加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇进行洗涤，避免扰动磁珠。等待 30 秒后吸除 80% 乙醇。重复此步骤一次。
10. 短暂离心后，将 PCR 管重新放回分离装置。彻底吸除残留的 80% 乙醇，避免扰动磁珠。
11. 打开管盖，室温下空气干燥 5 分钟。切勿干燥过久，以免磁珠过度干燥。
12. 保持 PCR 管在分离装置上，加入 52 µL 无核酸酶水以覆盖磁珠。从装置上取下 PCR 管，反复吹打至磁珠完全重悬。室温孵育 5 分钟。
13. 将 PCR 管重新放回分离装置，静置至溶液澄清（约 1 分钟）。将 50 µL 上清液转移至 8 孔条板的各孔中。向每个样品中加入 40 µL 新磁珠，充分涡旋混匀。室温孵育 8 分钟，使磁珠与 DNA 结合。
14. 在该孵育期间，开始解冻用于去除样品中任何残留 rRNA 的组分。解冻后置于冰上。同时，将热循环仪预热至 72 °C。
15. 将样品置于磁力分离装置上，直至溶液澄清（约 5 分钟）。向预冷的 PCR 管中每管分装 1.5 µL 探针。将 PCR 管放入预热的热循环仪中，按 72 °C 孵育 2 分钟后降至 4 °C 的设置进行反应。
16. 保持样品管在磁力分离装置上，用移液器小心吸除上清液，避免扰动磁珠。然后向磁珠中加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇洗涤，避免扰动磁珠。等待 30 秒后吸除 80% 乙醇。重复此步骤一次。
17. 短暂离心后，将 PCR 管重新放回分离装置。彻底吸除残留的 80% 乙醇，避免扰动磁珠。打开管盖，室温下空气干燥 2 分钟。切勿干燥过久，以免磁珠过度干燥。
18. 按顺序混合以下组分，为所有样品配制主混合液（表 6）。
19. 涡旋混匀主混合液，向每个样品的干燥磁珠中加入 22 µL 混合液，充分混匀以重悬磁珠。室温孵育 5 分钟。
20. 短暂离心后，将 PCR 管置于磁力分离装置上 1 分钟，或直至溶液澄清。将 20 µL 上清液（避免扰动磁珠）转移至新的 PCR 管中。将 PCR 管放入预热的热循环仪中，按表 7所示设置进行反应。
21. 为每个样品配制足量的 PCR 主混合液。按表 8所示将以下组分加入主混合液中。向 8.20 步骤中的每个样品管中加入 80 µL PCR 主混合液，并将 PCR 管放入热循环仪中，按以下设置运行（表 9）。
22. 使将用于 DNA 纯化的磁珠恢复至室温。待其升温后，向每个样品中加入 100 µL 磁珠。室温孵育 8 分钟，使 DNA 与磁珠结合。
23. 将 PCR 管置于磁力分离装置上，静置约 5 分钟，或直至溶液完全澄清。
24. 保持 PCR 管在分离装置上，用移液器小心吸除上清液，避免扰动磁珠。
25. 保持 PCR 管在分离装置上，向磁珠中加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇洗涤，避免扰动磁珠。等待 30 秒后吸除 80% 乙醇。重复此步骤一次。
26. 短暂离心后，将 PCR 管重新放回分离装置。彻底吸除残留的 80% 乙醇，避免扰动磁珠。
27. 打开管盖，室温下空气干燥 5 分钟。切勿干燥过久，以免磁珠过度干燥。向干燥的沉淀中加入 20 µL Tris 缓冲液。从分离装置上取下 PCR 管，用移液器充分混匀以重悬磁珠。室温孵育 5 分钟。
28. 将 PCR 管置于分离装置上 2 分钟，或直至溶液澄清。收集上清液并转移至新管中。将收集的溶液储存于 -20 °C。
29. 对最终文库进行质量与数量检测。根据制造商推荐的方案，将样品混合、簇生成并以双端 50 nt 读长进行测序。

结果

本实验室利用睡美人转座酶系统构建了基因工程小鼠模型（GEMMs）（图1A）。该系统可将特定的基因改变整合到新生小鼠神经前体细胞的基因组中。这些发生基因改变的前体细胞可自发形成内源性胶质瘤。用于诱导肿瘤的质粒序列包括：（1）pT2C-LucPGK-SB100X，用于睡美人转座子及荧光素酶的表达；（2）pT2-NRASSV12，用于NRAS的表达；（3）pT2-shp53-GFP4，用于p53基因的敲低及GFP蛋白的表达；（4）pT2-shATRx-GFP4，用于ATRX基因的敲低。质粒按先前所述方法注射至出生1天的新生小鼠侧脑室¹¹。通过活体生物发光成像系统监测质粒摄取及肿瘤形成情况。当荷瘤小鼠出现肿瘤负荷相关症状时，实施安乐死。所获肿瘤组织或用于建立神经球培养，或直接冷冻保存以用于激光显微切割（LMD）处理（图1A）。

讨论

阐明胶质瘤异质性和侵袭背后的分子机制对于发现新的治疗靶点至关重要¹³。在本论文中，我们描述了一种详细且经过优化的方法，用于通过激光显微切割（LMD）结合转录组分析，研究胶质瘤异质性和侵袭的分子特征。

激光捕获显微切割（LMD）可用于识别肿瘤内不同区域或单个细胞，从而获得特定样本，以进一步分析维持肿瘤空间背景的分子模式¹⁴。与其他用于分析实体瘤空间转录组的方法相比，该技术具有可靠性高、成本低的优点¹⁵。我们利用LMD分析了基因工程小鼠肿瘤模型或颅内可植入模型中的胶质瘤异质性及侵袭性。这些模型能够重现人类胶质瘤的关键特征，从而可用于研究胶质瘤的异质性与侵袭过程^10,12。

保持高质量的肿瘤组织形态和RNA完整性是激光显微切割（LMD）技术的限制因素之一。为了改善组织形态，我...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase 细胞解离溶液	Biolegend	423201
无动物源性重组人 EGF	Peprotech	AF-100-15
抗生素-抗真菌剂（100X）	Gibco	15240062
B-27 添加剂（50X），无血清	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR 管	Sigma Aldrich	CLS6530
乙酸焦油紫	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - 改良 Eagle 培养基：F-12 营养混合物	Gibco	11330057
伊红 Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
激光显微切割（LMD）系统	Leica	LMD7000
N-2 添加剂（100X）	Gibco	17502048
Normocin - 抗微生物试剂	Invivogen	ant-nr-1
一次性可剥离包埋模具	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN 膜玻璃载片（2 µm）	Lieca	1150518
Pinpoint 溶液	Zymo Research	D3001-1
重组人碱性 FGF	Peprotech	100-18B-1MG
研究用冷冻切片机	Leica	CM3050s
RNA酶清除剂 RNaseZap	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro 试剂盒	Qiagen	74034
SMARTer 链特异性总 RNA 测序试剂盒 v2 - 微量输入哺乳动物	Takara Bio	634411
组织包埋剂 Tissue-Plus O.C.T. 化合物	Fisher Scientific	23-730-571