激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。
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本文内容
摘要
摘要
胶质瘤是一种具有侵袭性和异质性的原发性脑肿瘤。假栅栏样结构、微血管增生、间充质转化和坏死等特定的组织学模式构成了高级别胶质瘤组织学异质性的特征。本实验室已证实，富含间充质样细胞的高密度区域（称为肿瘤间质流，oncostreams）的存在与肿瘤恶性程度相关。我们开发了一种独特的方法，用于解析胶质瘤生长和侵袭的潜在机制。本文中，我们描述了一种综合性实验方案，该方案结合激光显微切割（LMD）与RNA测序技术，用于分析肿瘤内异质性多细胞结构（即间充质区域或肿瘤侵袭区域）中mRNA的差异表达。该方法能够良好地保持组织形态学结构和RNA完整性。我们对灌注、冷冻、包埋、切片和染色等步骤进行了优化，以维持组织形态并获得高质量的激光显微切割样本。结果表明，使用30%蔗糖对荷胶质瘤小鼠进行灌注，可获得良好的组织形态和RNA质量。此外，采用4%焦宁紫（Cresyl violet）和0.5%伊红（eosin）对肿瘤切片染色，可在保持RNA完整性的前提下实现良好的细胞核和细胞质染色效果。所描述的方法具有高灵敏度和高度可重复性，可用于研究多种肿瘤模型中的肿瘤形态学特征。综上所述，我们介绍了一套完整的LMD操作流程，该流程可在保持组织形态和RNA质量的基础上，用于后续测序分析，以研究实体瘤内部异质性多细胞结构的分子特征。
引言
胶质瘤是中枢神经系统最具侵袭性的原发性肿瘤，具有高度侵袭性和异质性1。对肿瘤细胞和分子组分的分析将揭示新的治疗靶点。
在目前可用的多种方法中，冷冻脑肿瘤组织的激光显微切割（LMD）是一种经济可靠的技术，可实现从肿瘤组织中分离特定解剖区域或特定细胞群体，以研究其分子特征2,3。LMD 可用于分析选定的单个细胞或多细胞结构的 mRNA 基因表达谱4,5。通过 LMD 可深入探究肿瘤进展过程中发生的分子事件的机制。为获得最佳的组织形态学光学分辨率和 RNA 质量，需优化肿瘤组织的处理方法6。尽管多聚甲醛固定最适用于形态学分析，但在此条件下 RNA 质量会受到影响并发生降解，导致 RNA-seq 分析的 RNA 质量较差。使用冷冻组织切片可避免冰晶形成，而冰晶可能破坏细胞膜并在细胞内形成孔洞，因此仍是进行 RNA-Seq 分析的最佳选择7。
本文介绍了一种优化的切片固定与染色方法，用于处理小鼠脑肿瘤冷冻组织以进行激光显微切割（LMD）。为防止组织中形成冰晶....
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方案
本研究所涉及的所有使用实验动物的方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：可使用来自基因工程小鼠模型（GEMM）或稳定细胞系的胶质瘤神经球进行小鼠颅内肿瘤移植10，并用于激光捕获显微切割（LMD）和RNA测序分析。这些细胞组成型表达萤光素酶和GFP蛋白，后续将用于肿瘤生长分析和定位。
1. 利用基因工程胶质瘤模型衍生的神经球建立小鼠颅内胶质瘤模型
- 采用先前所述的方案，从基因工程小鼠（GEMM）模型中建立神经球细胞的原代培养10,11.
- 按照以下方法制备神经球培养基：在500 mL的Dulbecco改良Eagle培养基F-12（DMEM/F12）中加入10 mL 50倍浓度的B-27、5 mL 100倍浓度的N-2神经元培养添加剂、5 mL 100倍浓度的抗生素-抗真菌剂以及1 mL Normocin。接种神经球前，在培养基中添加20 ng/mL人重组EGF和FGF。
- 在组织培养孵箱中于37℃培养胶质瘤神经球 °C 和 5% CO2 在颅内肿瘤移植前 2-3 天。
- 手术当天，收集胶质瘤神经球，以550 × g离心....
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结果
本实验室利用睡眠美人转座酶系统（图1A）构建了基因工程小鼠模型（GEMMs）。该系统将特定的遗传修饰整合至新生小鼠神经前体细胞的基因组中。这些经过修饰的前体细胞可自发形成内源性胶质瘤。用于诱导肿瘤形成的质粒序列包括：（1）pT2C-LucPGK-SB100X，用于表达睡眠美人转座子及荧光素酶；（2）pT2-NRASSV12，用于表达NRAS；（3）pT2-shp53-GFP4，用于敲低p53并表达GFP蛋白；（4）pT2-shATRx-GFP4，用于敲低ATRX。质粒注射至出生后1天的小鼠侧脑室，操作步骤如前所述11。通过活体生物发光成像系统监测质粒摄取及肿瘤形成情况。当荷瘤小鼠出现肿瘤负荷体征时，实施安乐死。所获肿瘤组织用于建立神经球培养体系，或直接冷冻保存以用于显微切割（LMD）处理（图1A）。
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讨论
阐明胶质瘤异质性和侵袭背后的分子机制对于发现新的治疗靶点至关重要13。在本论文中，我们描述了一种详细且经过优化的方法，用于通过激光显微切割（LMD）结合转录组分析，研究胶质瘤异质性和侵袭的分子特征。
激光捕获显微切割（LMD）可用于识别肿瘤内不同区域或单个细胞，从而获得特定样本，以进一步分析维持肿瘤空间背景的分子模式14。与其他用于分析实体瘤空间转录组的方法相比，该技术具有可靠性高、成本低的优点15。我们利用LMD分析了基因工程小鼠肿瘤模型或颅内可植入模型中的胶质瘤异质性及侵袭性。这些模型能够重现人类胶质瘤的关键特征，从而可用于研究胶质瘤的异质性与侵袭过程10,12。
保持高质量的肿瘤组织形态和RNA完整性是激光显微切割（LMD）技术的限制因素之一。为了改善组织形态，我.......
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披露
本文所有作者均声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH/NINDS）资助：R37-NS094804、R01-NS105556、R21-NS107894（授予M.G.C.）；（NIH/NINDS）R01-NS076991、R01-NS096756、R01-NS082311（授予P.R.L.）；（NIH/NIBI）R01-EB022563；（NIH/NCI）U01CA224160；密歇根大学神经外科系、Rogel癌症中心、ChadTough基金会和Leah's Happy Hearts基金会（资助M.G.C.和P.R.L.）；RNA生物医学资助F046166（授予M.G.C.）；美国国立卫生研究院UL1 TR002240（密歇根临床与健康研究研究所，MICHR），博士后转化学者项目（PTSP）资助，项目F049768（授予A.C.）；密歇根大学Forbes癌症研究所，防盲研究公司（Research to Prevent Blindness, Inc.，RPB）授予的医师科学家奖，美国国立卫生研究院NEI资助R01 EY022633（授予A.K.），以及RPB向眼科与视觉科学系提供的无限制资助。本研究使用了视力研究核心设施（P30 EY007003）和癌症中心研究核心设施（P30 CA046592）。A.K.获得了A. Alfred Taubman医学研究所颁发的William Davidson新兴学者奖支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accutase 细胞解离溶液 | Biolegend | 423201 | |
| 无动物源性重组人 EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） | Gibco | 15240062 | |
| B-27 添加剂（50X），无血清 | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR 管 | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| 乙酸焦油紫 | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - 改良 Eagle 培养基：F-12 营养混合物 | Gibco | 11330057 | |
| 伊红 Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| 激光显微切割（LMD）系统 | Leica | LMD7000 | |
| N-2 添加剂（100X） | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - 抗微生物试剂 | Invivogen | ant-nr-1 | |
| 一次性可剥离包埋模具 | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN 膜玻璃载片（2 µm） | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint 溶液 | Zymo Research | D3001-1 | |
| 重组人碱性 FGF | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| 研究用冷冻切片机 | Leica | CM3050s | |
| RNA酶清除剂 RNaseZap | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro 试剂盒 | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer 链特异性总 RNA 测序试剂盒 v2 - 微量输入哺乳动物 | Takara Bio | 634411 | |
| 组织包埋剂 Tissue-Plus O.C.T. 化合物 | Fisher Scientific | 23-730-571 |
参考文献
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdisse....
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