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方法文章

人神经前体细胞来源神经元的神经突生长检测与神经毒性评估

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DOI：

10.3791/60955

⸱

2020年8月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, 2Center for Therapeutic Innovation and Department of Psychiatry & Behavioral Sciences, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Persian BayanGene Research and Training Center

本文内容

摘要

本文所述方案介绍了一种用于小分子化合物神经突生长实验及神经毒性评估的方法。

摘要

神经突生长实验和神经毒性评估是本方法可开展的两项主要研究。该方案可对神经元形态进行可靠分析，并定量检测小分子化合物处理后神经突长度以及突触蛋白定位和丰度的变化。除了可用于神经突生长研究外，本方法还可用于神经毒性评估，以根据商业化学物质潜在的发育神经毒性效应对其进行评估、区分和排序。

尽管细胞系目前在神经科学领域的化合物筛选实验中被广泛使用，但它们在遗传和表型上常常与其来源组织存在差异。相比之下，原代细胞能够维持体内所观察到的重要标志物和功能。因此，由于这些细胞具有潜在的转化价值和生理相关性， neurite outgrowth assay（神经突生长实验）和神经毒性评估可显著受益于使用人神经前体细胞（hNPCs）作为主要的人源细胞模型。

本方法可利用源自人神经前体细胞的神经元（一种能紧密代表人类生物学特性的细胞模型），检测化合物诱导神经突生长及产生神经毒性的能力。"

引言

神经突生长是神经网络形成和神经再生的基本过程1,2。在神经损伤后，神经突外延生长在神经系统再生中起关键作用。神经突外延生长也是细胞外信号传导的重要组成部分，可诱导神经再生活动，从而改善神经退行性疾病和神经损伤的治疗效果3,4,5,6。

通过保持分化为多种神经谱系的潜能，人类神经前体细胞（hNPCs）可为中枢神经系统（CNS）功能与发育研究提供一种模型系统7,8,9。作为原代人类细胞模型，hNPCs具有较高的转化潜力和生理相关性，在与神经突生长相关的药物发现筛选中具有显著优势。然而，将原代细胞模型用于高通量检测时，其维持和扩增可能耗时且劳动密集10,11,12,13。

除了在神经突生长研究中应用本方法外，利用hNPC分化而来的神经元进行神经毒性评估是另一项重要应用。目前有成千上万种商用化学化合物尚未经过检测，或其神经毒性潜力尚不明确。因此，迫切需要更可靠且高效的筛选实验，以评估、区分并排序这些化合物在引发发育性神经毒性方面的潜在风险14。随着神经系统疾病患病率和发病率的上升，以及环境中大量未测试化合物的存在，亟需开发更为可信和高效的实验方法，以识别可能具有神经毒性的环境有害化合物15。

本方法可利用人神经前体细胞来源的神经元（一种能紧密模拟人类生物学特征的细胞模型），筛选化合物诱导神经突生长及产生神经毒性的能力。

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方案

伦理声明：胎儿标本来自西雅图华盛顿大学的出生缺陷研究实验室，该标本获取途径通过美国国立卫生研究院（NIH）资助的组织分配项目获得。出生缺陷研究实验室已从胎儿父母处获得适当的书面知情同意，且组织获取过程由华盛顿大学机构审查委员会进行监督。所有工作均获得迈阿密大学人类受试者研究办公室的批准8。

1. 人类神经前体细胞（hNPCs）的分离与培养

  1. 将脑组织置于100 mm培养皿中，使用镊子小心去除脑膜。
  2. 将脑组织转移至50 mL锥形管中，加入20 mL磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻倒置管子，清洗两次。
  3. 将脑组织放入新的50 mL锥形管中，浸入细胞解离溶液（见材料表）和DNase I（10 U/mL），在37 °C条件下孵育10分钟。
  4. 向含有脑组织的管中加入5 mL神经元细胞培养基（见材料表），通过1000 µL移液枪头反复吹打20至30次，机械性解离神经球，制成单细胞悬液。
  5. 将细胞悬液通过70 µm细胞筛网过滤，以去除细胞团块。
  6. 将单细胞悬液接种至通气T-25培养瓶中，加入5–10 mL神经元细胞培养基，并补充表1中详述的组分。
    1. 通过0.2 µm滤器过滤肝素溶液以实现灭菌。不含维生素A的B-27添加剂是一种无血清添加剂，用于神经前体细胞和干细胞的培养，且不会诱导其分化。
      注：人神经前体细胞（hNPCs）来源于人工流产胎儿的胎儿脑组织。培养7–10天后，神经干细胞（NSCs）形成悬浮生长的神经球克隆，而其他细胞类型则以单细胞形式悬浮存在或贴附于培养瓶底部。分离得到的hNPCs可在悬浮培养条件下以神经球形式传代培养数月8,16,17。
用量组分
100 µLEGF (20 ng/mL)
100 µLFGF (10 ng/mL)
2 mLB-27, 不含维生素A (50X)
1 mLL-丙氨酰-L-谷氨酰胺 (100X)（参见材料表）
4 µL肝素 (2 μg/mL)
96.8 mL神经元细胞培养基（参见材料表）

表1. 制备100 mL培养基所需的组分

2. hNPCs 的传代

  1. 收集含有悬浮类球体（包括大小神经球）的培养基，并转移至50 mL锥形管中。
    注意：由于未知原因，神经球的传代时间存在差异，通常为7天至30天不等。但一般而言，当神经球直径超过700–900 µm时即需进行传代。此时神经球中心开始变暗，被认为是细胞死亡率较高的标志18。
  2. 以300–400 × g离心3分钟，使神经球沉淀。
  3. 小心吸除上清液，然后将神经球浸入500 µL解冻后的细胞解离试剂中（参见材料表）。
    1. 将细胞解离试剂分装至1.5 mL微量离心管中，每管加入500 µL，储存于-20 °C。为避免酶活性丧失，应在室温下放置或在37 °C水浴/金属浴中加热5分钟以解冻细胞解离试剂。
  4. 根据神经球的密度和大小，将浸没的神经球在37 °C孵育5–15分钟。
  5. 向含有神经球的50 mL锥形管中加入5–10 mL预热的培养基，然后以300–400 × g离心5分钟，使神经球沉淀。
  6. 吸除上清液后，用1000 µL移液器在2 mL培养基中轻柔吹打数次，直至所有神经球完全分散为单细胞悬液。
    注意：解离过程肉眼可见。解离前，神经球呈球形；加入解离试剂并反复吹打后，将转变为单细胞状态。
    1. 对细胞进行计数，并将单细胞以每10 mL培养基接种200万至300万个细胞的密度接种至T-25培养瓶中。
  7. 每隔3天换液一次，更换一半体积的培养基。
    1. 将培养瓶倾斜，使其底部一角着地，保持此姿势约1–2分钟，使神经球自然沉降。随后将移液管插入已沉降神经球上方的培养基中，轻柔吸除一半培养基。解离后的细胞在培养2至3天后可重新聚集成球状19。

3. 冻存人神经前体细胞（hNPCs）

  1. 通过将 DMSO 加入培养基中，配制终浓度为 10%（v/v）的细胞冻存液；或针对敏感细胞类型使用市售的冻存培养基（参见材料表）。
  2. 将培养液转移至 50 mL 锥形管中，静置使类球体自然沉降，挑出大类球体，并用 200 或 1000 µL 移液器吸头将其转移至新的 50 mL 锥形管中用于传代。
    注：直径大于 900 µm 的神经球被视为大神经球，直径小于 500 µm 的被视为小神经球。
  3. 将剩余的神经球在 300–400 × g 条件下离心 3 分钟，小心弃去上清液。
  4. 将最多 100 个神经球重悬于 1 mL 冻存试剂中，并转移至冻存管。
  5. 于 -80 °C 冻存容器中（参见材料表）过夜，次日转移至液氮中进行长期保存。
    注：建议冻存小至中等大小的神经球（直径小于 900 µm），避免冻存大尺寸神经球（直径大于 900 µm）或单细胞。为减少解冻过程中细胞损伤，可将解冻后的神经球接种至较小的 T25 培养瓶中，以维持较高的细胞密度。

4. 人类神经前体细胞的分化与处理

注意：为了诱导分化，将神经球解离为单个细胞，计数后接种于包被的培养板中，培养5天。随后，将分化后的细胞用待测化合物处理24小时，再进行免疫染色和荧光定量分析。

  1. 包被
    1. 每孔加入 200 µL 多聚赖氨酸（poly-L-lysine, PLL）至 4 孔玻璃腔室载玻片中（8 孔腔室载玻片每孔加入 140 µL）。
    2. 室温（RT）孵育 1 小时。
    3. 用 PBS 洗涤 3 次。
    4. 室温下晾干（约 30 分钟）。
    5. 每孔加入 150 µL 层粘连蛋白（laminin，50 µg/mL）至 4 孔玻璃腔室载玻片中（8 孔腔室载玻片每孔加入 120 µL）。
    6. 37 °C 孵育 2 小时。
    7. 用 PBS 洗涤 3 次。
      注意：包被后的腔室载玻片可在 4 °C 保存 1 个月。
  2. 细胞接种
    1. 将 80,000 个单细胞神经球（处于单细胞悬液状态的神经球）接种至 4 孔腔室载玻片的每孔中（8 孔腔室载玻片每孔接种 70,000 个细胞）。
    2. 每孔加入 500 µL 分化培养基至 4 孔腔室载玻片中（8 孔腔室载玻片每孔加入 250 µL 培养基）。
      1. 配制分化培养基时，首先将 表 2 中所列成分加入无菌一次性容器中，配制成神经诱导培养基（NIM）。
      2. 将 表 3 中所列成分加入上一步配制的 48.5 mL 神经诱导培养基（NIM）中，配制成分化培养基。
    3. 37 °C 孵育 5 天。
    4. 5 天后，通过将每孔中一半的培养基更换为含有目标浓度待测化合物的新鲜培养基，对细胞处理 24 小时，同时设置适当的对照组。
用量组分
49 mLDMEM/F-12
0.5 mLN2 补充剂 (100X)
0.5 mLMEM 非必需氨基酸 (100X)
2 µL肝素 (2 µg/mL) (储存液浓度为 50 mg/mL)

表2。 制备50 mL NIM所需组分

用量组分
1 mLB-27 (50X)
500 µL抗生素-抗真菌剂 (100X)
5 µL 视黄酸 (0.1 µM)
50 µLGDNF (10 µg/mL)
50 µLBDNF (10 µg/mL)
5 µL抗坏血酸 (0.2 µg/mL) (储存液浓度为 2 mg/mL) 注意：建议新鲜配制。
48.5 mLNIM

表3. 制备50 mL分化培养基所需的组分

5. 免疫细胞化学（ICC）

注意：使用4%甲醛固定细胞。随后进行通透和封闭处理，以提高抗体渗透性并防止非特异性结合。然后将细胞与一抗在4℃孵育过夜。接着，细胞与荧光标记的二抗孵育。最后，使用DAPI对细胞核进行染色后，封片保存。

  1. 固定
    1. 轻轻吸去每个孔中的培养基。
    2. 向4孔板的每个孔中加入500 µL的4%多聚甲醛（8孔板每孔加入250 µL）。
    3. 室温孵育15分钟。
    4. 用500 µL PBS轻轻洗涤2次。
      注意：固定后，每个孔中保留1 mL PBS，载玻片可在4 °C保存长达3个月。
  2. 细胞通透与封闭
    1. 将表4中列出的组分加入无菌一次性容器中，配制抗体（Ab）缓冲液。
    2. 将表5中列出的成分与上一步配制的Ab缓冲液混合，制备细胞通透与封闭液。
    3. 每孔（4孔板）加入500 µL，室温孵育1小时。
      注意：Ab缓冲液可在4 °C保存。
用量组分
1.75 gNaCl (150 mM)
1.2 gTrisBase (50 mM)
2 gBSA 1%
3.6 gL-lysine (100 mM)
8 gSodium Azide (4%)
200 mL蒸馏水。注意：先将所需组分溶于150 mL水中，再定容至200 mL。

表4. 配制200 mL抗体缓冲液所需的组分

用量组分
600 µL20% 山羊血清
6 µL0.2% Triton-X100
2394 µL抗体缓冲液。注意：首先将所需组分溶解于 2 mL 抗体缓冲液中，然后调节 pH 至 7.4；再添加抗体缓冲液定容至 3 mL，并过滤除菌。

表5. 制备3 mL细胞通透化与封闭溶液所需的组分

  1. 染色
    1. 用 500 µL PBS 洗涤 2 次。
    2. 加入稀释后的一抗 anti-β-tubulin III（1:200），在 4 °C 下孵育过夜（每孔 4 孔板加入 200 µL）。用 PBS 稀释一抗。
    3. 用 PBS 洗涤 2 次。
    4. 加入用 PBS 稀释的荧光标记二抗 Alexa Fluor 488（1:500），在室温避光条件下孵育 2 小时（每孔 4 孔板加入 250 µL）。
    5. 用 PBS 洗涤 2 次。
    6. 加入用 PBS 稀释的 DAPI（终浓度 300 nM），在室温避光条件下孵育 5 分钟（每孔 4 孔板加入 300 µL）。
    7. 用 PBS 洗涤 3 次。
    8. 按照以下步骤封片：
      1. 通过折断可拆卸标签，取下垫圈和底座，将腔室载玻片拆开。
      2. 在每孔 4 孔腔室载玻片中加入一滴封片液（见材料表），然后用盖玻片覆盖整个载玻片。
      3. 使用镊子，以一定角度将盖玻片的一边接触液滴的外缘，并轻轻贴附到载玻片上。
      4. 缓慢将盖玻片放下，使其平稳覆盖在封片液上。避免产生气泡。可用移液器吸头轻压盖玻片，使气泡移向边缘。
        注：有时气泡难以完全避免。若出现气泡，只要数量较少，可在成像时避开气泡区域。
      5. 根据制造商说明确定固化时间。避免使用非固化型封片液，因其在成像过程中不易操作。若使用非固化型封片液，则必须在边缘使用适当的盖玻片封固剂，以防止成像时盖玻片滑动。
      6. 为密封盖玻片，可用指甲油在盖玻片边缘涂一圈细线，静置约 2 分钟使其干燥。

6. 图像采集、神经突生长及荧光强度定量

注意：染色后，使用配备 20 倍物镜、图像尺寸为 1024 × 1024 像素的共聚焦显微镜采集处理后的细胞图像。每种条件下，每个生物学重复至少采集两个视野的图像。然后使用 Fiji 图像分析软件（ImageJ 1.51u）对神经突长度进行定量分析。简言之，测量每个神经元最长神经突的长度，对每种处理组的数值取平均值后，采用独立样本 t 检验比较实验组与对照组之间的均值差异。

注意：目前有多种商业（Imaris、Volocity、Amira）和开源（ImageJ、CellProfiler、Vaa3D、BioImageXD、Icy、KNIME）图像处理软件可供使用。在这些程序中，ImageJ 已成为生物图像分析的首选工具20,21。位于 https://imagej.net/Introduction 的 ImageJ 门户网站是一个重要的信息资源，提供了关于 ImageJ 基本功能及内置功能的详尽说明，包括图像处理、共定位分析、去卷积、图像配准、分割、追踪和可视化等。

  1. 使用 Fiji 图像分析软件测量神经元突起生长
    1. 如图所示 图1，通过将图像拖放到 Fiji 软件中，或通过选择打开图像 文件 | 打开.
    2. 选择 分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器，然后右键单击 5th 工具栏中的图标 直的 并切换到 徒手线可选择双击同一图标，将线条宽度更改为10，然后从靠近细胞体处开始，沿最长的神经突延伸至其末端进行描迹。
    3. 按压 Ctrl + T & 然后 F 将测量结果添加到 ROI 管理器，并高亮已测量的神经元。选中所有数值 感兴趣区域，点击 测量，选择所有计算出的长度，并复制/粘贴到电子表格中。
  2. 使用 Fiji 图像分析软件测量标记细胞的荧光强度
    1. 如图所示 图2打开图像后，单击 4th 工具栏中的图标 徒手选择. 绘制细胞的形状。
    2. 选择 分析 | 设置测量 并选择以下数值： 区域, 积分密度, 平均灰度值 | 分析 | 测量 （一个包含多个数值的弹出框打开）。
    3. 在细胞旁边选择一个区域作为背景（大小不重要），然后选择 分析 | 测量选择所有测量数据，并复制/粘贴到电子表格中。
      注意：积分密度（IntDen）用于测定荧光强度。本研究通过测量目标分子的荧光强度，初步分析其在细胞中的分布情况，并进一步量化不同处理条件下目标分子的丰度。由此可评估各处理措施的效果，并与对照组进行比较。

7. 神经毒性评估

注意：测试化合物的细胞毒性在384孔板中（参见材料表）使用化学发光细胞活力检测法（参见材料表）进行评估。人神经前体细胞（hNPCs）的制备方法与“hNPCs的分化与处理”部分所述方法相同，仅略有修改。随后，利用微孔板读数仪检测化学发光细胞活力检测试剂产生的化学发光信号。该化学发光信号强度与细胞内ATP浓度成正比，而ATP浓度又与每孔中活细胞的数量成正比。

  1. 包被
    1. 在384孔板的每孔中加入30 µL聚-L-赖氨酸（PLL）。
    2. 在室温下孵育1小时。
    3. 用PBS洗涤2次。
    4. 在室温下晾干（约30分钟）。
    5. 在384孔板的每孔中加入30 µL层粘连蛋白（laminin，50 µg/mL）。
    6. 在37 °C孵育2小时。
    7. 用PBS洗涤2次。
      注意：包被后的384孔板可在4 °C保存1个月。
  2. 细胞接种
    1. 将20,000个单细胞神经球用25 µL分化培养基接种至384孔板的每孔中。
    2. 在37 °C孵育5天。
    3. 5天后，加入终浓度为6倍的待测化合物溶液5 µL，处理细胞24小时（使每孔终体积为30 µL）。
  3. 细胞活力检测
    1. 在384孔板的每孔中加入30 µL发光型细胞活力检测试剂。
      注意：加入的发光型细胞活力检测试剂体积应与每孔中现有液体体积相等。使用前将发光型细胞活力检测试剂解冻并平衡至室温。
    2. 在板式振荡器上振荡2分钟（以充分混匀并诱导细胞裂解）。
    3. 将混合物在300–400 × g 离心30秒，使液体沉降至孔底。
    4. 将384孔板置于避光处，在室温下孵育10分钟（以稳定发光信号）。
    5. 使用微孔板读数仪记录发光值。
      注意：细胞活力检测应设置适当对照，包括以终浓度10 µM的Velcade作为阳性对照，以及含DMSO的HBSS（终浓度0.1%或0.2%）作为阴性对照。

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结果

本文所述方案已成功应用于近期发表的两篇论文22,23。图3展示了利用hNPCs来源的神经元检测HDAC抑制剂作为表观遗传化合物对神经突延伸的影响，以此作为神经突生长及小分子化合物后续神经生成能力的标志。

此外，在图4中，通过在384孔板中同时诱导hNPCs分化，评估了受试化合物（HDAC抑制剂）的神经毒性，展示了所提出的细胞模型（hNPCs）在神经毒性评估中的潜力，以及能够扩展用于对更多化合物进行神经毒性测试的能力。

在 Sartor 等人的另一篇论文中（图5），成功展示了通过测量由 hNPCs 分化而来的神经元细胞的荧光强度，以定量分析组蛋白修饰标记 H4K5ac 的丰度，该实验是在使用表观遗传修饰化合物处理后进行的

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讨论

本方案是少数已发表的描述经测试化合物处理后神经突长度检测方法的论文之一。此外，我们还介绍了如何利用人源神经前体细胞（hNPCs）进行神经突外延生长实验及神经毒性评估。通过在hNPCs分化而来的神经元上应用该神经突外延生长实验和神经毒性评估方法，证实了一类表观遗传小分子化合物——组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂——在诱导神经突外延生长方面的神经发生潜力22。此外，Sartor 等人在另一篇论文中也采用了本方案，用于定量分析多种表观遗传修饰化合物处理后组蛋白蛋白H4K5ac荧光强度的变化23。

认知功能依赖于神经元回路内部正确的连接和功能连接。作为表型筛选的一种方法，对神经元形态各个方面的细节进行准确且一致的量化，对于揭示从神经发育障碍到精神疾病等各类脑部疾病相关通路的可靠机制至关重要。表型筛选被认为是一种探索小分子化合物作为潜在药物候选物以调控细胞表型的有效方法。在此方法中，不再仅针对单一靶点，而是对细胞的所有组分和通路进行全面考察24。<...

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披露

所有作者均声明不存在潜在利益冲突。

致谢

本研究由授予 MAF 的 NIMAD 研究基金（940714）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4 孔玻璃培养皿SigmaPEZGS0816
Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001
Alexa Fluor 594InvitrogenR37117
抗生素-抗真菌剂Gibco15240062
抗-β-微管蛋白 III 抗体ThermoMA1-118X
B27Thermo17504001
B27 - 不含维生素 AThermo12587010
BDNFPeproTech450-02
BSASigmaA8531
CellTiter-GloPromegaG7572
CoolCellCorning432000细胞冻存容器，确保在 -80°C 冰箱中以标准化的 -1°C/分钟速率进行细胞冻存
CryoStor CS10StemCell Technologies7930含 10% DMSO 的细胞冻存液
DAPIThermoD1306
DMEM/F12Gibco11320033
DMSOSigma34869-100ML
EGFGibcoPHG0311
FGFGibcoPHG6015
甲醛ThermoFB002
GDNFPeproTech450-10
GlutamaxGibco35050061L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充剂
山羊血清Thermo50062Z
肝素Calbiochem375095
层粘连蛋白SigmaL2020-1MG
L-抗坏血酸SigmaA92902-25G
L-赖氨酸SigmaL5501
MEM 非必需氨基酸Gibco11140050
mFreSRStemCell Technologies5854无血清细胞冻存液，专为人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的冻存设计
N2Gibco17502048
NaClSigma71376
Neurobasal 培养基Gibco21103049
Nunc 384 孔聚苯乙烯白色微孔板Thermo164610
PBSThermo10010-049
多聚-L-赖氨酸SigmaP5899-5MG
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂ThermoP10144
视黄酸SigmaR2625
叠氮化钠SigmaS2002
StemPro AccutaseGibcoA1110501含有蛋白酶和胶原酶的细胞解离试剂
突触素ThermoMA5-14532
Tris 碱Sigma10708976001
Triton X-100SigmaX100-100ML

参考文献

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