通过制备型等电聚焦（IEF）方法分离天然来源的生物活性小分子、多肽及微生物蛋白

摘要

本研究的目的是利用液相等电聚焦（IEF）方法，从复杂的植物提取物中分离和纯化具有生物活性的小分子化合物、多肽，以及从病原微生物中分离蛋白质。随后对分离得到的分子进行鉴定，并验证其生物活性。

摘要

源自植物和微生物的天然产物是生物活性分子的丰富来源。在使用之前，必须从复杂提取物中纯化出活性分子，以便进行后续应用。目前有多种色谱方法可用于此目的，但并非所有实验室都能负担得起高性能的方法，且从复杂的生物样品中分离目标分子可能十分困难。本文展示了制备型液相等电聚焦（IEF）技术可根据分子的等电点（pI）实现对复杂植物提取物中包括小分子和多肽在内的各类分子的分离。我们已将该方法应用于复杂生物样品的分级分离与表征。作为概念验证，我们对Gymnema sylvestre植物提取物进行了分级分离，成功分离出一类三萜皂苷小分子以及一种多肽。此外，我们还以白色念珠菌（Candida albicans）真菌为模型系统，验证了该方法在微生物蛋白质有效分离中的应用。

引言

从复杂的生物样品中纯化生物分子是生物学实验中必不可少且常常具有挑战性的步骤¹。等电聚焦（IEF）适用于对复杂生物分子进行高分辨率分离，其中载体两性电解质根据其电荷在电场中迁移并建立pH梯度³。首个用于IEF的商业化载体两性电解质由Olof Vesterberg于1964年开发并获得专利^4,5。载体两性电解质是一类长度和支链结构各异的脂肪族寡氨基寡羧酸分子⁶。随后，Vesterberg及其他研究者进一步改进了载体两性电解质，以拓展其在生物分子分离中的应用^6,7。

分离生物分子的方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维凝胶电泳（2-DE）、等电聚焦、毛细管电泳、移界电泳以及其他色谱技术（例如薄层色谱TLC、快速蛋白液相色谱FPLC、高效液相色谱HPLC）²。在一种名为“Rotofor”的仪器中进行的液相等电聚焦技术由米兰·比尔（Milan Bier）发明⁸。他开创了该仪器的概念与设计，并对电泳迁移理论做出了广泛贡献。他的研究团队还建立了电泳分离过程的数学模型，用于计算机模拟⁹。

液相等电聚焦装置是一种水平旋转的圆柱形细胞结构，由一个尼龙核心组成，该核心被分为20个具多孔的隔室，并包含一根循环水冷却的陶瓷棒。多孔腔室允许分子在电极之间的水相中迁移，并可在真空条件下以组分形式收集纯化后的样品。该纯化系统可在<4小时内实现目标分子最高达1000倍的纯化效果。该仪器的一个重要优势在于，既可作为从复杂混合物中进行纯化的第一步，也可作为获得高纯度样品的最后一步¹⁰。如果目标分子为蛋白质，则另一优势在于其天然构象在分离过程中将得以保持。

液相等电聚焦技术已广泛应用于蛋白质、酶和抗体的纯化^{6,10,11,12,13,14}。本文描述了该方法在分离和纯化药用植物Gymnema sylvestre中小分子和肽类成分的应用。本方案将帮助研究人员以较低成本从植物提取物中富集和纯化具有生物活性的小分子，用于后续实验。此外，我们还以白色念珠菌（Candida albicans）真菌的复杂蛋白质提取物为例，展示了该基于等电聚焦的系统在蛋白质富集中的应用¹⁵。

方案

1. 标准液相等电聚焦装置的安装与预运行

1. 按照说明书要求，将液相等电聚焦电极（阳极-红色按钮和阴极-黑色按钮）与其相应的交换膜组装（参见 材料表）。将阴离子交换膜用 0.1 M NaOH 平衡，阳离子交换膜用 0.1 M H₃PO₄ 至少在使用新膜时需孵育16小时。
   1. 将膜储存于电解质（0.1 M NaOH 或 0.1 M HCl）中₃PO₄)两次运行之间保持湿润，切勿使其干燥。
2. 通过将离子交换垫圈上的三个椭圆形孔对齐，组装电极的内层和外层部分。向电极中加入相应的电解液（约25–30 mL），以防止其膜干燥。
   1. 不要添加过量（超过1/3）^rd 电极室内电解质的体积可能积聚压力，导致电极泄漏。
3. 用仪器组装部件中附带的密封胶带盖住样本收集口（参见 材料表）。可通过两个垂直的金属对准销识别样本采集口的一侧。或者，使用标准封口胶带封闭端口。
4. 将聚焦室组件的各个部件（阳极电极、尼龙膜芯、聚焦室和阴极电极）依次组装到陶瓷冷却指上。
5. 使用50 mL注射器将预冷的蒸馏水注入聚焦室（标准IEF电泳槽的总体积为60 mL）。
6. 将液相等电聚焦仪器连接至4 ºC循环冷却水，以15 W和3,000 V预运行3-5分钟，或直至电压稳定。
   注意：通常在一分钟内，电压将达到设定的最大值。使用蒸馏水预运行有助于去除聚焦室和尼龙膜芯中的残留离子。
7. 关闭电源，使用馏分收集器将细胞中的水移除。用密封胶带重新密封收集口。
   注意：此时仪器已准备就绪，可用于步骤 2.4。

2. 从Gymnema sylvestre 提取物中分离和纯化小分子及多肽

1. 称取0.6 g植物提取物，加入60 mL蒸馏水，在滚轴混合器中混合5分钟使其溶解。
   注意：任何可溶且无盐的生物样品均可使用本等电聚焦（IEF）仪器进行分离和纯化。缓冲盐浓度不超过10 mM的样品也可使用，但分辨率略有降低。我们关注的是从G. sylvestre植物中提取的三萜类皂苷家族化合物—— gymnemic acids，因其具有独特的抗真菌特性¹⁶。
2. 将溶解后的植物提取物在10,000 × g条件下离心5分钟，以去除不溶性颗粒。
3. 将上清液（约60 mL）转移至80 mL离心管中，并加入0.6 mL两性电解质（pH 3-10），使其终浓度为1%（v/v）。
4. 按照步骤1.1–1.7准备液相等电聚焦装置。此时，样品室已准备好加载样品。
5. 使用50 mL注射器连接仪器配套的1-1/2英寸19 G钝头针，通过样品收集口将已加入两性电解质的样品（总体积60 mL）注入样品室。
6. 将聚焦单元从支架上取下，轻敲电极室以排除样品室中的气泡。气泡的存在会导致电压和电流波动，影响运行过程。
7. 将装置连接至4 °C水冷系统，并以恒定功率15 W开始分级收集。
8. 运行设备3小时，或直至电压达到稳定值。
   注意：随着样品开始聚焦，电压将逐渐上升，直至达到一个恒定值。
9. 运行结束后，准备在收获盒（包含20个塑料管，规格为12 mm × 75 mm，容量5–6 mL）中收集组分，通过按下IEF装置上的收获按钮ON启动收集，该收获盒已连接真空泵。
10. 将20个收集针与聚焦单元上用封口膜密封的20个收集孔对齐。
11. 将收集针刺穿封口膜，同时开启真空泵ON（见图2B、2C & 2D）。
    注意：每次可从每个腔室收集约3 mL的组分至收集管中。收集的组分可用于后续下游应用（如SDS-PAGE用于多肽定量，薄层色谱TLC和生物活性检测用于小分子分析）。

3. 蛋白质的分离与纯化  C. albicans

1. 在酵母-蛋白胨-葡萄糖（YPD）液体培养基中接种一株单菌落的 C. albicans，于 30 °C 摇床（200 rpm）中过夜培养¹⁶。
2. 通过离心（10,000 × g，5 分钟）收集酵母细胞。
3. 将 C. albicans 酵母细胞悬浮于含 1%（v/v）β-巯基乙醇（β-ME）的碳酸铵缓冲液（1.89 g/L，体积为培养液体积的 1/10）中，于 5 °C 在旋转管中旋转孵育 1 小时¹⁵。
4. 通过离心（10,000 × g，5 分钟）去除酵母细胞，并将蛋白提取物经 0.45 µm 滤膜过滤。
   注：可制备并使用来自 C. albicans 胞质、膜或细胞壁的蛋白样品进行等电聚焦（IEF）分级。类似地，在通过适当方法（例如，透析或脱盐柱）去除盐分后，也可使用来自细菌或其他生物样品（动物组织提取物）的蛋白。
5. 将蛋白提取物置于截留分子量为 3,500 的透析袋中，在 4 °C 条件下对水透析 15 小时。使用 γ-球蛋白作为标准品，通过 Bradford 染料结合法测定蛋白浓度¹⁷。
6. 在 60 mL 水中加入总蛋白 500 mg 及 1%（v/v）两性电解质（pH 5–8），用于分级分离。
   注：由于宽范围两性电解质（pH 3–10）不能有效富集某些非葡聚糖结合型 C. albicans 细胞壁蛋白，应使用窄范围（pH 5–8）两性电解质。若样品蛋白浓度高于 2 mg/mL，两性电解质浓度可提高至 2%；这有助于减少聚焦过程中的蛋白聚集。样品、两性电解质和水应始终保持预冷，并置于冰上。
7. 重复步骤 1.1–1.7 以准备 IEF 装置，并使用步骤 3.6 中获得的蛋白溶液加载至 IEF 细胞中。
8. 在恒定功率 15 W 条件下聚焦 4 小时后，按前述方法（步骤 2.9–2.11）收集蛋白组分（1–20），并对蛋白样品进行还原和煮沸处理后，在 12.5% SDS-PAGE 上进行分析¹⁸。
9. 将 SDS-PAGE 凝胶在摇床上用考马斯亮蓝染液（0.01%）室温染色 2–3 小时。脱色后，使用凝胶成像系统记录凝胶图像。
   注：考马斯亮蓝染液（0.01%）可通过将 0.01 g 考马斯亮蓝粉末溶于含 40% 甲醇和 10% 乙酸的脱色液中配制而成。

4. 植物提取物 Gymnema sylvestre 中纯化小分子的生物活性

1. 按照步骤 3.1 的方法培养白色念珠菌（C. albicans）酵母细胞。
2. 制备细胞悬液时，将过夜培养的白色念珠菌（C. albicans）酵母细胞培养物按 1/1000 比例稀释至新鲜的 RPMI 细胞培养基中，培养基中添加 50 mM 葡萄糖。
   注意：在菌丝诱导条件下（RPMI 培养基于 37 °C），白色念珠菌（C. albicans）会由酵母相转变为菌丝相。已有研究表明，皂苷酸类小分子可在菌丝诱导条件下抑制酵母细胞向菌丝的转化¹⁶。本实验旨在确定经液相等电聚焦分离的森林匙羹藤（G. sylvestre）提取物中是否含有此类生物活性分子。
3. 从制备好的细胞悬液中，向 96 孔板的每个孔中加入 90 μL。
4. 从每个组分（通过液相等电聚焦从森林匙羹藤（G. sylvestre）提取物中收集的第 1–20 组分，图 4）中取 10 μL，加入含有 90 μL 上述细胞悬液的孔中（步骤 4.2）。每个样本设三个重复孔。
5. 另取若干孔，每孔加入 90 μL 白色念珠菌（C. albicans）酵母细胞悬液，并加入含 1% 两性电解质的 10 μL 水溶液，作为空白对照。
   注意：两性电解质具有潜在生物活性，因此在进行任何生物活性检测时，必须设置两性电解质对照¹⁹。
6. 将 96 孔板在 37 °C 下孵育 12 小时，于显微镜下观察白色念珠菌（C. albicans）由酵母相向菌丝相转化的抑制情况¹⁶，并计算酵母相向菌丝相转化的抑制率。

结果

从匙羹藤（Gymnema sylvestre）植物提取物中分离和纯化小分子及多肽
采用制备型液相等电聚焦方法，我们对药用植物提取物以及人类致病性真菌白色念珠菌（C. albicans）的细胞表面蛋白进行了分级分离。这些分级分离方案的示意图见图1。

从液相等电聚焦分离得到的 G. sylvestre 提取物的20个组分中，深色分子（三萜皂苷）迁移并富集于阳极端（pH 2–3），而浅黄色透明组分则出现在阴极端（pH 8–9）（图2）。取各组分（1–20）的等分试样（20 μL），经还原和煮沸处理后，在15% SDS-PAGE上进行分离。考马斯亮蓝染色凝胶显示，在组分16–19中富集了一条约5 kDa的弥散多肽条带（图3）。已有报道指出，G. sylvestre 植物含有一种由35个氨基酸组成的古尔...

讨论

来自天然产物来源（例如植物）的小分子包含结构上高度多样的复杂次生代谢物，这些代谢物被认为参与植物的防御机制。此外，多肽也存在于植物组织中²²。这些天然产物小分子是药物发现与开发中重要的候选测试分子来源。然而，由于其分离与纯化过程困难且繁琐，限制了它们在治疗领域的应用。本报告中采用的液相等电聚焦（IEF）方法突出了在不损害其生物活性的前提下分离这些小分子和多肽的能力。

这种基于等电聚焦（IEF）的方法在分离生物分子方面具有多项优势，包括能够从复杂混合物中浓缩纯化蛋白质、在聚焦过程中及之后维持其天然构象，以及以无交叉污染的独立纯化组分形式收集样品。必要时，可通过较窄的pH范围对样品进行再次聚焦，以纯化蛋白质亚型。由于已有小型IEF聚焦装置（约15 mL），该方法也可适用于较小体积的样品。本报告的新发现是，有机小分子和多肽可从复杂的植物提取物中实现分离。尽管很难普遍认为小分子可通过IEF从天然产物提取物中分离，但对于两性化合物而言是可行的。从匙羹藤（G. sylvestre）提取物中分离出的匙羹藤酸与苦味肽（gurmari...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 注射器滤器	费舍尔科技	09-720-004
2-巯基乙醇	西格玛	M3148
碳酸铵	西格玛-奥德里奇	207861-500
Bio-Lyte 3/10 两性电解质	伯乐	163-1113
Bio-Lyte 5/8 两性电解质	伯乐	163-1192
紧凑型低温恒温器	Lauda -Brinkmann	RM 6T	将水冷却设定为 4 °C，即使在 0 °C 下也可运行，因为当水通过 Rotofor 冷却芯时，循环水温将约为 5 °C 或更高，具体取决于电压。
考马斯亮蓝 R	西格玛-奥德里奇	B7920
透析袋（3,500 MWCO）	Spectrum Spectra/Por	132112T
匙羹藤植物叶提取物粉末（>25% 匙羹藤酸）	Suan Farma，美国新泽西州
培养箱	Lab companion	SI 300R
显微镜	徕卡	DM 6B
Mini protean 电泳仪	伯乐
pH 计	梅特勒-托利多	S20	用于测定 Rotofor（液相等电聚焦）组分的 pH 值
Rotofor	伯乐	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf（Rotofor 装配说明书）
RPMI-1640 培养基	HyClone	DH30255.01
密封胶带	伯乐	170-2960	也可使用透明胶带。
Sorvall legend micro 17 离心机	赛默飞世尔科技	75002432
TPP 组织培养板 - 96 孔平底	TPP	TP92696