本文介绍了一种用于研究原代小鼠多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集的详细实验方案。通过预先形成的α-突触核蛋白纤维诱导神经元内磷酸化α-突触核蛋白的聚集。对免疫荧光标记的细胞进行自动化成像并结合无偏倚的图像分析，使该方案成为适用于中高通量筛选抑制α-突触核蛋白聚集药物的可靠方法。
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摘要
摘要
本实验方案旨在建立一种稳定且可重复的α-突触核蛋白在原代多巴胺能神经元中聚集的模型。结合免疫染色与无偏倚的自动化图像分析，该模型可用于分析药物处理和基因操作对神经元培养中α-突触核蛋白聚集的影响。原代中脑培养物可提供可靠的真正胚胎期多巴胺能神经元来源。在本方案中，通过将α-突触核蛋白预形成的纤维（PFFs）直接加入神经元培养基中，模拟帕金森病的标志性组织病理学特征——路易小体（LB）。在加入PFF后7天即可通过免疫染色检测到多巴胺能神经元胞体中内源性磷酸化α-突触核蛋白的积累。体外细胞培养条件也适用于评估防止α-突触核蛋白积累的干预措施，例如小分子药物、神经营养因子，以及用于基因操作的慢病毒载体（如CRISPR/Cas9系统）。将神经元培养于96孔板中可提高实验设计的稳健性和统计效力。实验结束时，使用多聚甲醛固定细胞，用于免疫细胞化学染色和荧光显微镜成像。通过自动化显微镜对96孔板进行多光谱荧光成像以获取图像数据。利用免费软件对这些数据进行量化分析（例如，计数每孔中含有磷酸化α-突触核蛋白的多巴胺能神经元数量），该软件为无偏倚的高内涵表型分析提供了平台。PFF诱导的原代多巴胺能神经元中磷酸化α-突触核蛋白积累模型，为研究介导α-突触核蛋白包涵体形成与清除的潜在机制提供了可靠工具，同时具备高通量药物筛选和细胞表型分析的应用前景。
引言
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种神经退行性疾病，其特征是中脑黑质（substantia nigra, SN）中的多巴胺能神经元死亡，导致基底神经节多巴胺张力继发性降低，并引发相应的运动功能障碍1,2。PD 患者脑组织的主要组织病理学特征是神经元胞体内出现的细胞内蛋白质/脂质聚集物，称为路易小体（Lewy bodies, LB），或存在于神经突中的路易突（Lewy neurites, LN），统称为路易病理（Lewy pathology）3。脑内的路易病理似乎随着 PD 病情进展而扩展，呈现出类似致病因子通过神经元连接传播的模式。在黑质的多巴胺能神经元以及其他受神经退行性变影响区域的细胞中，均可发现大量的路易病理改变4。然而，在疾病进展过程中，蛋白质聚集的扩散和起始并不总是与神经元死亡相关，路易病理对神经元死亡的确切作用仍不明确5。
LB和LN已被证实由膜性成分和蛋白质成分组成3。前者包括膜碎片、囊泡结构（可能是溶酶体和自噬体）以及线粒体3。后者则包含至少300种不同的蛋白质6。Spillantini等人的一项标志性研究7表明，路易病理的主要蛋白质成分是α-synuclein。α-synuclein在神经元中高表达，与膜融合及神经递质释放相关，在路易病理中主要以错误折叠的淀粉样纤维形式存在，其中大部分在Ser129位点发生磷酸化（pS129-αsyn）4,8。
重要的是，研究还表明，由于具有类朊病毒特性，错误折叠的α-突触核蛋白可能在路易病理的形成中起致病作用4。错误折叠的α-突触核蛋白的类朊病毒特性已在帕金森病患者中脑组织提取物以及体外制备的α-突触核蛋白预形成的纤维（PFFs）中得到证实，这些物质可在体外培养的神经元和活体动物中诱导α-突触核蛋白聚集9,10。PFFs为研究α-突触核蛋白病理在多巴胺能神经元中的进展提供了一个可靠且稳健的模型。当PFFs被施加于原代培养神经元或注射入动物脑内时，可导致神经突和胞体中形成含α-突触核蛋白的包涵体11，这些包涵体重现了路易病理中的多种特征。所观察到的包涵体在Triton X中不溶，可被泛素化标记，能被淀粉样特异性染料硫黄素S染色，并含有在Ser129位点高度磷酸化的α-突触核蛋白11,12。重要的是，在α-突触核蛋白基因敲除动物中不会形成此类包涵体11，表明其形成依赖于内源性α-突触核蛋白。
尽管如此，直接比较PFF诱导的包涵体与帕金森病（PD）患者中的路易病理仍存在困难，因为人类路易小体（LBs）和路易神经突（LNs）具有高度异质性3。路易病理所观察到的异质性可能源于其形成的不同阶段、不同的解剖位置，或引发聚集过程的错误折叠α-突触核蛋白（α-synuclein）构象差异。这些相同因素也可能影响PFF诱导的pS129-αsyn阳性包涵体。事实上，最近的研究表明，在原代神经元培养中，PFF诱导的pS129-αsyn阳性包涵体代表了病理的极早期阶段，经过长期孵育后可成熟为与路易小体高度相似的结构12,13。
利用PFFs模拟错误折叠的α-突触核蛋白在早期的播散与聚集，对于药物开发具有重要价值，因为路易体病理的扩散被认为是帕金森病早期阶段的疾病标志之一。因此，在疾病极早期采用抑制聚集的治疗方法，可能有助于阻止或延缓帕金森病的进展。目前已有多个旨在减缓或阻止α-突触核蛋白聚集的临床试验正在进行14。对于疾病晚期患者，多巴胺能神经元前体细胞的移植可能是一种更优的治疗选择15。然而，在帕金森病患者脑组织的尸检分析中，已在移植的胚胎神经元中观察到路易体病理的存在16,17，这也表明需要采取措施防止α-突触核蛋白的聚集。
在体外，α-突触核蛋白PFFs已被证实可在永生化细胞系或更常见的啮齿类动物原代海马或皮层神经元中诱导聚集。然而，这些模型均未能很好地模拟多巴胺能神经元10。培养此类神经元需要在体外以特定数量进行高密度接种18。为了在材料有限（例如原代多巴胺能神经元）的情况下实现高接种密度，通常采用微岛培养法。在微岛培养中，细胞最初被接种于一个微小的培养基液滴中（通常为几微升），该液滴依靠表面张力维持在大孔板中央18。待神经元贴壁后，再将整个孔板加满培养基，而细胞仍保持在初始小面积区域内的高密度状态。除了实现高接种密度外，微岛培养还可避免细胞在孔边缘处接种，因为该区域常出现细胞密度和存活率的波动。微岛培养通常用于相对较大的孔板或培养皿中；然而，将中脑神经元培养于96孔板格式的微岛中，可实现对真正多巴胺能神经元中路易病理的中高通量研究。利用这些神经元进行的体外实验使我们发现了胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF），该因子可促进成熟多巴胺能神经元在体外和体内的存活19,20,21,22，并能防止多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集体的形成23。源自人类患者诱导多能干细胞的多巴胺能神经元因其人类来源及在体外更长的存活时间，构成了更为精确的模型。然而，与小鼠胚胎神经元中约一周即可观察到病理变化相比，在人类神经元中诱导出α-突触核蛋白病理通常需要数月时间，且/或需联合多种应激因素（例如α-突触核蛋白过表达与PFFs联用）24,25。此外，与原代胚胎神经元相比，人类多巴胺能神经元的维持成本更高、操作更繁琐，这在本质上限制了其在高通量应用中的使用。
此外，原代多巴胺能神经元培养物可通过基因编辑（例如使用CRISPR/Cas9）和/或药物处理进行改造23。这些培养物构成了用于分子通路解析和药物文库筛选等应用的快速且可重复的实验平台。尽管从这些培养物中获得的材料有限，但仍可进行小规模的基因组学/蛋白质组学分析。将原代神经元以96孔板形式培养，更适用于免疫细胞化学和荧光显微镜技术，并可进一步开展高内涵表型分析。通过对96孔板进行自动成像所获得的多光谱荧光图像，可转化为定量结果（例如每孔中含路易小体的神经元数量）。此类分析可使用免费软件（如CellProfiler26,27）完成。总体而言，以96孔板接种的原代胚胎中脑培养物为研究多巴胺能神经元及α-突触核蛋白聚集提供了稳定高效的平台，同时具备高通量表型筛选的可能性。
方案
所有动物实验均经芬兰国家动物实验委员会批准，并依照欧盟关于用于科研目的动物保护的立法规定进行。
1. 准备
- 使用0.46% D-葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、1% N2、0.2% 原霉素（primocin），并用DMEM/F12补足，配制多巴胺神经元培养基（DPM）。混合后过滤DPM。将DPM储存于4 °C，每份仅预热一次。
注意：DPM中不应含有胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），因为它会减少多巴胺神经元中α-突触核蛋白的积聚23。 - 准备硅化玻璃移液管，其具有极强的疏水性，从而在胚胎神经元初始操作过程中最大限度地减少细胞在表面的黏附和损失。
- 在2 L容器中，将10 mL硅化液加入1 L蒸馏水中，搅拌混合。将玻璃移液管浸入硅化液中15分钟。
- 用蒸馏水冲洗移液管3–5次。在室温下过夜晾干，或在100–120 °C加热的无菌空间中干燥1–2小时以加快干燥。
- 将移液管密封于高压灭菌袋中，通过标准高压灭菌程序进行灭菌。
- 通过向96孔板的中间孔中加入60 μL聚-L-鸟氨酸（PO）溶液，制备底部透明的PO包被96孔板，用于神经元接种；板边缘至少留出一整行或一整列孔，以避免边缘效应。将包被后的板在4 °C过夜或在室温下放置4小时。
- 在接种细胞前，彻底吸除PO溶液，并用100 μL 1× PBS洗涤孔内表面三次。吸除1× PBS后，打开板盖使其完全干燥。
注意：可回收使用过的PO溶液，经过滤后可重复利用。同一PO溶液最多可重复使用两次。 - 向先前包被的孔中加入50 μL DPM。用100 μL塑料吸头从孔中吸除DPM，同时以环形运动轻轻刮擦孔底边缘，以去除孔周区域的包被层。每个孔中央将保留一个PO包被的小岛。
- 在超净工作台内，向每个包被小岛的中央加入10 μL DPM，以形成微小岛。
注意：含有DPM覆盖微小岛的培养板可在细胞分离过程中置于超净工作台内保存1–2小时。
2. 从小鼠E13.5胚胎中分离腹侧中脑底部组织
注意：中脑底部解剖步骤请参见图1。
- 解剖前，向一个10 cm的培养皿中加入杜尔贝科缓冲液，并置于冰上保存。
- 根据机构指南处死一只E13.5的妊娠雌性小鼠。将小鼠仰面平放，用70%乙醇喷洒其前躯干。用镊子提起子宫上方的皮肤，用手术剪剪开切口以暴露子宫。
- 小心取出子宫并放入先前准备好的、置于冰上的10 cm培养皿中。
- 在室温下的超净台中，使用手术剪小心地将胚胎从子宫中取出。用镊子去除胚胎上的所有胎盘残留物，并将其转移至另一个盛有杜尔贝科缓冲液的10 cm培养皿中。
- 使用解剖镊或针，从图1A中标记的黑箭头位置处剪下头后部。将剪下的组织与胚胎其余部分分离（图1B）。
- 将剪下的组织后端朝向观察者（图1C），从尾侧向头侧轻轻切开（图1D）。从颅侧开口下方0.5 mm处，切取一个2 mm2–3 mm2的区域，如图1E所示。
- 将腹侧中脑底部组织（见图1F）收集至一个空的1.5 mL微量离心管中。在所有中脑底部组织收集完毕前，始终将微量离心管置于冰上。
注意：也可在完成所有胚胎脑组织解剖后，使用1 mL移液器收集中脑底部组织。
图1：从小鼠E13.5胚胎中解剖中脑腹侧板。（A）头部后部的切割位置以黑色箭头和白色虚线标出。（B）将该部分从胚胎其余部分上切除，被切除的部分以圆圈标示。（C）将该组织块旋转90°，使其后侧面向观察者。（D）从黑色箭头处沿尾侧至头侧方向（以白色虚线标示）将组织切开。（E）从切口下方0.5 mm–1 mm处，切取2 mm2–4 mm2的区域（以黑色线条标示）。（F）分离出中脑腹侧板（以黑色虚线方框标示）。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 以96孔板形式建立E13.5小鼠胚胎中脑原代培养
- 在将所有胚胎的中脑腹侧组织收集至同一1.5 mL离心管后，去除残留的Dulbecco缓冲液，并用缓冲液将组织块洗涤三次 500 μL 的 Ca2+，Mg2+无钙镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）
- 移除 HBSS 并添加 500 μL 加入0.5%胰蛋白酶至离心管中。37℃孵育 37 °C 30 分钟
- 孵育期间，将1.5 mL胎牛血清（FBS）预热至 37 °C，添加 30 μL 向FBS中加入DNase I并混匀。同时，将一支硅化玻璃移液管的管口进行火焰抛光，确保孔洞无锋利边缘，且直径与1 mL移液器吸头大小相近。
注意：作为替代方案，可使用低吸附的1 mL微量移液器吸头进行吹打。然而，硅化玻璃移液管似乎能获得最佳效果。 - 步骤3.2的孵育一结束，立即加入 500 μL 向部分消化的组织中加入 FBS/DNase 混合液。用玻璃移液管在 FBS/胰蛋白酶混合液中吹打组织，吹打至组织解离成微小的、几乎不可见的颗粒。吹打过程中避免产生气泡。
- 让残留颗粒依靠重力自然沉降到微量离心管底部。吸取上清液时避免触及底部沉淀物，将上清液转移至一个空的15 mL圆锥形聚丙烯管中。
- 将第3.3步的FBS/DNase I（98:2）用 1,000 μL 加入HBSS以配制FBS/DNase-I/HBSS（49:1:50）溶液，通过反复吹打混匀。添加 1,000 μL 将新配制的混合液加入微型离心管中剩余的颗粒中。再次吹打混匀，并重复步骤 3.5。
- 再次重复上一步，以用尽全部 FBS/DNase-I/HBSS（49:1:50）。
- 将步骤 3.5、3.7 和 3.8 中收集到 15 mL 离心管内的全部上清液合并后，使用台式离心机以 100 x g 离心约 3 mL 上清液 g，5 分钟。移除上清液，切勿触碰底部的细胞沉淀。
- 将2 mL DPM加入管中重悬细胞沉淀，100 x g离心沉淀 g 5分钟。弃上清液，重复洗涤2次，以尽量减少沉淀细胞中的碎片。
注意: 始终使用新鲜且预热的DPM培养神经元。洗涤步骤中DPM无需新鲜配制，但应预先温育至 37 °C. - 用新鲜的温DPM稀释细胞，并转移至微量离心管中。DPM的稀释量取决于用于组织解剖的胚胎数量。例如，使用 150 μL 将十个胚胎获得的细胞用DPM稀释。
- 转移 10 μL 将 DPM 中的细胞转移至微量离心管中。用其混匀。 10 μL 0.4% 台盼蓝染色液。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞（即台盼蓝染色阴性细胞）。
注意：每孔接种 30,000 个细胞，以获得每孔约 1,000 个多巴胺能神经元。若细胞密度高于每孔 30,000 个细胞，则 6 μL，用 DPM 进一步稀释细胞，使接种体积不少于 6 μL. - 不要触碰孔板底部，移除步骤1.6中形成的微岛上的DPM。
- 为获得各孔中可重复的细胞密度，铺板前需通过轻柔吹打混匀细胞。使用 1–10 μL 微量移液器，添加 6 μL 将细胞迁移至每个原微岛位置的孔板中央。
- 用液体填充板边缘的空孔 150 μL 加水或1×PBS以减少含神经元培养物的孔中液体的蒸发。将培养板置于培养箱中孵育 37 °C，5% CO2 1小时。
- 孵育1小时后，从培养箱中取出培养板，加入 100 μL 将 DPM 加入含细胞的每个孔中，并放回培养箱。
- 接种后两天（体外培养第2天，即DIV2），移除 25 μL 并添加 75 μL 新鲜DPM，使终体积达到 150 μL 并尽可能避免蒸发。
- 更换一半培养基为新鲜的 DPM（即，移除 75 μL 并添加 75 μL 在DIV5时加入新鲜DPM。DIV5之后不要进行任何换液操作。
4. 利用预先形成的纤维诱导原代胚胎多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集
有关PFFs的获取与验证方案已在近期多篇出版物中进行了详细描述和讨论11,28,29,30。每次操作PFFs后，须先用1% SDS、再用70%乙醇清洁层流罩或任何可能接触过PFFs的设备31。
- 实验前，用1×PBS将PFFs稀释至终浓度为100 μg/mL。将稀释后的PFFs置于微量离心管中，使用带有水浴冷却（4 °C）的高功率浴式超声仪进行超声处理，共10个循环，每个循环30秒开启/30秒关闭。
注意：必须充分超声处理纤维，以生成约50 nm长的片段。超声处理后PFFs的大小可通过透射电子显微镜图像直接测定，具体方法如Patterson等30所述。超声处理可采用上述高功率浴式超声仪完成，也可使用探头式超声仪30。超声处理后的PFFs可分装保存于-80 °C，避免反复冻融。 - 在DIV8时，向每孔150 μL培养基中加入3.75 μL浓度为100 μg/mL的PFFs，使终浓度为2.5 μg/mL。对照组每孔加入等体积的1×PBS。
- 用1×PBS配制4%多聚甲醛（PFA），分装后储存于-20 °C。操作步骤如下：
注意：PFA具有毒性，配制时需佩戴口罩和手套，始终在超净工作台内操作，并按照机构规定处理所有固态和液态PFA废弃物。- 将500 mL 1×PBS加入1 L容器中并加热。在容器中放入搅拌子，并将容器置于带加热功能的磁力搅拌器上。调节温度至40–60 °C，防止沸腾的同时保持溶液温热。
- 在通风橱内，使用一次性塑料量杯称取20 g PFA粉末。小心地将PFA粉末加入盛有1×PBS的容器中，开始搅拌溶液。
- 向溶液中加入200 μL 5 M氢氧化钠，并继续搅拌约15分钟，直至PFA完全溶解。
- 当溶液呈现均一状态后，加入168 μL 5 M盐酸以调节pH至约7。使用一次性固定色标pH试纸检测pH值。
- 将容器从加热装置上取下，冷却至室温。过滤溶液并分装，储存于-20 °C。使用前在室温下解冻，解冻后不可再次冷冻。
- 在DIV15时，用移液器吸除各孔中的全部培养基。每孔加入50 μL 4% PFA固定细胞，在室温下孵育20分钟。孵育结束后吸除PFA，每孔加入100 μL 1×PBS洗涤细胞。吸除1×PBS后，再重复洗涤两次。
- 每孔保留100 μL 1×PBS，防止干燥。将培养板储存于4 °C，待进行免疫化学染色时取出使用。
5. 在96孔板中对原代胚胎多巴胺能神经元进行免疫荧光染色及自动化成像
- 移除 1x PBS，每孔加入 100 μL 含 0.2% Triton X-100 的 PBS（PBST），室温孵育 15 分钟以透化细胞。
- 移除 PBST，每孔加入 50 μL 含 5% 正常马血清（NHS）的 PBST。为阻断非特异性抗原活性，室温孵育 1 小时。
- 用含 5% NHS 的 PBST 将抗 TH 和抗 pS129-αsyn 的一抗稀释至 1:2,000。每孔加入 50 μL 稀释后的一抗，4 °C 过夜孵育。
- 移除一抗溶液，每孔加入 100 μL 1x PBS 洗涤细胞。移除 1x PBS，重复洗涤 2 次。
- 为防止荧光分子淬灭，请在最低光照条件下操作。将荧光标记的二抗（1:400）用 PBST 稀释。每孔加入 50 μL 稀释后的二抗，室温孵育 1 小时。
- 移除二抗溶液，每孔加入 100 μL 1x PBS 洗涤细胞。移除 1x PBS，重复洗涤 2 次。
- 移除 1x PBS，每孔加入 50 μL 浓度为 200 ng/mL 的 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）以染色培养细胞的细胞核，室温孵育 10 分钟。
- 用 100 μL 1x PBS 每次 5 分钟，洗涤细胞 3 次。最后一次洗涤后每孔保留 100 μL 1x PBS。用铝箔包裹培养板，4 °C 保存直至成像。
- 使用配备 10x 物镜的高内涵板扫描仪（见材料表），在 96 孔观察板中对原代胚胎多巴胺能神经元进行成像。
- 根据 96 孔板的规格（如板型、生产商、尺寸、孔间距以及培养基类型和体积）调整成像参数。
- 选择孔内成像区域以覆盖微岛中的所有细胞。选取一个示例孔进行自动对焦调整，初始对焦基于 DAPI 信号。
- 根据对照孔染色强度校准各荧光通道的采集时间。调整参数，使在 PFF 处理的对照孔中，可清晰区分细胞胞体中含有 pS129-αsyn 聚集体的多巴胺能细胞，从而能够明确量化 pS129-αsyn 阳性与阴性细胞。
注意：不含 PFF 的孔不应出现 pS129-αsyn 染色，因此这些孔可用作调节 pS129-αsyn 信号强度的阴性对照。 - 使用 10x 物镜，以完全相同的参数同时对所有选定孔进行所有荧光通道的免疫荧光染色成像。
- 可选：使用特异性识别纤维状 α-突触核蛋白的抗体，对部分孔中的 α-突触核蛋白包涵体进行标记，以确认 pS129-αsyn 阳性包涵体数量的变化反映了蛋白聚集减少，而非 pS129-αsyn 磷酸化或去磷酸化的抑制。
- 重复步骤 5.3，将 pS129-αsyn 抗体替换为 α-突触核蛋白纤维抗体（1:2,000）。按照步骤 5.13 对染色后的聚集性 α-突触核蛋白进行成像。
6. 高内涵图像分析
注意：此步骤使用开放获取软件 CellProfiler 3.15 版本和 CellProfiler Analyst 2.2.1 版本进行27,32。然而，具备一定经验后，也可在其他版本或类似软件中建立相应的图像分析流程。有关详细说明，请参阅软件页面（见材料表）。
- 下载并安装 CellProfiler 和 CellProfiler Analyst 软件。
- 打开 CellProfiler。选择 文件|导入|从文件导入流程，并加载提供的示例流程文件 TH_LB_V1.cpipe（参见补充文件）。
注意：示例流程需要根据所获取图像的特性及图像采集平台进行特定调整。Example_Images可用于软件的初步测试。 - 通过将图像拖拽至图像模块中加载待分析图像。使用筛选选项，仅选择加载文件夹中的图像文件。
- 使用元数据模块从图像文件名中提取孔位、视野和通道信息。点击放大镜图标，并输入正则表达式，以从文件名中提取板号、孔位、成像位点和通道信息。
注意：正则表达式将取决于微孔板显微镜的文件命名规范。点击放大镜旁边的问号图标，可查看语法详情。 - 在名称与类型模块下，为 DAPI、TH 和 pS129-αsyn 染色选择正确的通道编号（默认通道为 1、2 和 3）。在分组模块中，选择“否”。
- 使用元数据模块从图像文件名中提取孔位、视野和通道信息。点击放大镜图标，并输入正则表达式，以从文件名中提取板号、孔位、成像位点和通道信息。
- 使用识别初级对象模块，基于 TH 染色对多巴胺能神经元的胞体进行分割。
注意：具体参数值需根据微孔板的染色和成像方式初步优化。若后续微孔板以相似方式处理，则无需或仅需极少进一步调整。 - 使用测量对象荧光强度模块获取 TH 和 DAPI 通道的荧光强度信息。
- 使用测量对象大小与形态模块测量分割所得多巴胺能神经元的大小和形态特征。
- 使用测量纹理模块测量从分割的多巴胺能神经元中提取的 TH 通道纹理特征信息。
- 使用导出至数据库模块将测量结果保存至数据库。
- 根据实验命名方案命名数据库文件（例如：ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db）。选择数据库文件的输出文件夹。数据库文件可能达数吉字节大小，建议保存在图像文件的父文件夹中。
- 打开 CellProfiler Analyst，选择在步骤 6.8 中创建的 V1_THCells.properties 文件。打开 工具|分类器。
- 将分割的细胞分为两类：阳性（即正确分割的多巴胺能神经元胞体）和阴性（即分割或染色伪影）。参见图 2A 和 2B。
- 将获取的细胞数量设置为 50 随机 细胞，然后点击 获取（这将加载步骤 6.4 中分割的细胞图像）。通过将细胞拖拽至窗口底部对应的分类框中，对至少 30 个细胞 进行分类。根据需要获取更多细胞。
- 在下拉菜单中选择 使用快速 Gentle Boosting，设置 最大规则数为 50，然后点击 训练。
- 将“获取”设置为 50 阳性 细胞，点击 获取 以根据分类器获取 TH 阳性细胞（图 2A）。利用所得结果评估训练后分类器的质量。
- 重复步骤 6.10.1–6.10.3，添加新的训练样本细胞，直至结果满意。
- 选择 高级|编辑规则…，在新窗口中 全选文本（Ctrl+a），复制（Ctrl-c）至 记事本（Ctrl-v），并保存为 TH_rules.txt 文件。
注意：根据神经元培养密度以及染色和成像质量，此步骤可能并非必需，因为有可能在步骤 6.4 中设置参数，以高准确度仅分割 TH 阳性细胞。若如此，则无需完整运行 TH_LB_V1.cpipe，而应将 识别初级对象模块 的正确参数直接填入 TH_LB_V2.cpipe 中对应模块。
图2：基于DAPI、TH和pS129-αsyn免疫荧光，使用CellProfiler Analyst软件对多巴胺能神经元及pS129-αsyn阳性多巴胺能神经元进行定量分析。（A）根据DAPI染色（蓝色）选择阳性组中的TH阳性细胞，图像中首个被选中的细胞以小方框标记，并围绕细胞体周围的TH染色（灰色）进行识别。（B）非细胞类的干扰信号被归入阴性组。（C）根据pS129-αsyn染色（红色）的大包涵体选择pS129-αsyn阳性的TH神经元，图像中首个被选中的细胞以小方框标记，包涵体位于细胞核周围或细胞体中。（D）不含pS129-αsyn包涵体的TH细胞被归入阴性组。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看该图的放大版本。
- 打开 CellProfiler，选择 文件|导入|从文件导入流程，并加载 TH_LB_V2.cpipe 文件。重复步骤 6.3–6.7。此部分流程应与 TH_LB_V1.cpipe 完全相同。
- 使用 FilterObjects 模块 仅保留真正的 TH 阳性细胞用于后续分析。
- 将 筛选模式 设置为 规则。在 规则 或 分类器文件名 中选择步骤 6.10.5 创建的 TH_rules.txt 文件。
- 如果 TH 阳性细胞被分选至左下窗口，则将 类别编号 字段设置为 1。
- 使用 MeasureObjectIntensity 模块 获取 pS129-αsyn 通道的荧光强度信息。
- 使用 MeasureTexture 模块 测量经筛选细胞 TH 通道的纹理特征信息。
- 使用 MeasureObjectSizeShape 模块 测量筛选后细胞的大小和形态特征。
- 使用 ExportToDatabase 模块 将测量结果保存至数据库。
- 根据实验命名方案为数据库文件命名（例如，ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db）。选择数据库文件的输出文件夹。
- 打开 CellProfiler Analyst 并选择 V2_THpos.properties 文件。
- 将已分割的细胞分为两类——pS129-αsyn 阳性细胞和 pS129-αsyn 阴性细胞（图 2C、D）。
- 将获取的细胞数量设置为 50 个随机 细胞，然后点击 获取（此操作将加载步骤 4 中分割的细胞图像）。通过将细胞拖动到窗口底部对应的分类框中，对每个类别至少分类 30 个细胞。
- 在 下拉 菜单中，选择使用 快速温和提升法（Fast Gentle Boosting），最大规则数设为 50，或选择 随机森林 分类器。点击 训练。
- 将“获取”设置为 50 个阳性 细胞，点击 获取 以根据分类器获取 pS129-αsyn 阳性细胞（图 2C）。将“获取”设置为 50 个阴性 细胞，点击 获取 以根据分类器获取 pS129-αsyn 阴性细胞（图 2D）。评估训练所得分类器的质量。
- 重复步骤 6.17.2–6.17.4，添加新的示例细胞以进一步训练分类器，直至结果满意为止。
- 点击 全部评分，生成结果表格，汇总每个孔中 pS129-αsyn 阳性和阴性多巴胺能神经元的数量。
结果
铺板后几天（DIV1–DIV3），通过明场显微镜观察评估培养细胞的健康状态及分布均匀性，以及各孔内条件的一致性（图3）。培养的中脑细胞均匀分布在铺板前形成的微岛区域内（图3A、B）。原代神经元已均匀贴附于包被表面，并形成神经突起（图3B）。在某孔中观察到一小团细胞聚集体（直径小于150 μm），作为示例展示（图3C）。
图3：铺板后数天（例如，DIV3），通过明场显微镜观察中脑原代培养物的状态。（A）培养细胞在PO包被的微岛中央区域扩散，微岛半径约为4.4 mm（白色箭头所示），该微岛通过从约1 mm宽的孔板边缘刮除PO形成（黑色箭头所示）。（B）原代神经元在区域内均匀分布，并可见神经元投射（红色箭头标示）。（C）直径小于150 μm的细胞团由蓝色箭头标示。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
培养15天后，采用抗TH和抗pS129-αsyn抗体对原代小鼠中脑细胞进行免疫染色，并使用自动显微镜成像。包被的微岛在孔板中央为细胞附着提供了限定区域（图4A，B）。TH标记的多巴胺能神经元以单层形式分布在微岛周围，彼此分离，无任何聚集现象（图4A’和4B’）。
图 4：在 DIV15 时，每个微岛中定量了 800–1,000 个多巴胺能细胞，无论是否进行 PFF 处理。 胚胎中脑培养物的代表性图像，使用抗-TH 和抗-pS129-αsyn 抗体进行免疫染色。(A, A’, A’’) 未接受 PFF 处理的对照细胞。(B, B’, B’’) 经 PFF 处理并出现 pS129-αsyn 包涵体的细胞。(C) 接受溶剂（对照）、PFF 或 PFF 加 50 ng/mL GDNF 处理的孔中 TH 阳性细胞数量的定量结果。(D) 接受溶剂（对照）、PFF 或 PFF 加 50 ng/mL GDNF 处理的 TH 阳性细胞中 pS129-αsyn 聚集体的定量结果。统计学显著性通过随机区组设计 ANOVA 计算得出。**p < 0.01，n = 4 个独立培养板（生物学重复），每组处理包含每板 3–6 个孔（技术重复）。比例尺 = A、B 图为 300 μm；A’、B’ 图为 50 μm；A’’、B’’ 图为 25 μm。 请点击此处查看该图的高清版本。
未经PFF处理的培养物中未检测到pS129-αsyn信号（图4A’ 和 4A’’），而经α-突触核蛋白PFF处理的培养物则形成了pS129-αsyn阳性包涵体（图4B’ 和 4B’’）。体外PFF处理7天后，与其它实验组相比，TH阳性神经元数量未出现显著下降（图4C）。PFF处理的培养物中约有40%的pS129-αsyn阳性TH阳性多巴胺能神经元。使用阳性对照GDNF处理后，可降低具有pS129-αsyn阳性包涵体的TH阳性多巴胺能神经元的比例（图4D，原始数据及示例图像详见补充文件）。
补充文件：使用 CellProfiler 和 CellAnalyst 软件包进行高内涵图像分析的示例流程、图4E、F 的示例图像和原始数据。（1-9）示例图像，可使用 ImageJ 或 CellProfiler 打开。（10）Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs。（11）TH_LB_V1.cpipe（步骤 6.2–6.8），（12）TH_LB_V2.cpipe（步骤 6.11–6.18） 请点击此处下载该文件。
讨论
路易体病理的扩散是帕金森病（PD）的组织病理学特征之一，其中磷酸化丝氨酸129位点的α-突触核蛋白（pS129-αsyn）是其主要成分。抑制或减缓聚集态pS129-αsyn的积累，可能有助于延缓多巴胺能神经元的变性及α-突触核蛋白病的进展。然而，pS129-αsyn聚集导致多巴胺能神经元死亡的具体机制仍有待阐明。来自不同疾病阶段患者脑组织尸检研究的证据，以及在移植的胎儿神经元中观察到pS129-αsyn阳性包涵体的现象，强烈提示路易体病理可在细胞间传播16,17,33。因此，近期研究已利用α-突触核蛋白预制纤维（PFFs）成功模拟了pS129-αsyn的朊病毒样传播过程9,10。建立一种在多巴胺能神经元中稳定、经济且具有相对高通量或中通量的pS129-αsyn传播与积累模型，将显著加快针对该过程的新型治疗手段和化合物的筛选进程。
由于多巴胺能神经元的丢失是帕金森病（PD）运动症状的主要原因，且这些细胞具有多种独特特性2,34,35，因此从转化医学的角度来看，建立pS129-αsyn在多巴胺能神经元中类朊病毒样扩散的模型是最具相关性的模型类型。此前已有研究描述了利用胚胎中脑神经元在4孔板上构建微岛培养体系并结合半自动定量分析的实验方案18。本文所述方案已适配至96孔板，微岛制备更为简便，经验丰富的研究人员可在一天工作时间内完成最多四块、每块含60个孔的培养板的制备。在96孔板中培养多巴胺能神经元可减少药物用量，同时实现慢病毒载体的高效转导。此外，还可联合不同处理方式，开展更为复杂的实验研究。
在施加任何处理（包括PFFs）之前，应使用明场显微镜检查培养质量。如果显微镜系统未配备带加热功能的CO2培养舱，细胞在培养箱外停留的时间不应超过几分钟，因为原代小鼠多巴胺能神经元较为脆弱，易受应激影响。基于相同原因，建议首次成像在接种后24小时（DIV1至DIV3之间）进行。细胞应呈现存活状态，具有清晰的胞体，并在微岛内均匀分布。原代神经元应已贴附于多聚鸟氨酸（PO）包被的表面，并开始形成神经突起。若消化吹打过程操作不当或接种密度过高，可能出现小团细胞聚集（即直径小于150–200 μm）。除非每孔中存在多个和/或较大团块，否则这些小团块通常不会影响实验结果。然而，细胞聚集会显著增加图像分析过程中识别免疫组织化学标记物及单个细胞的难度。因此，必须通过仔细的包被、吹打操作以及控制接种密度来避免此类团块的形成。若某些孔中无法观察到上述条件的均一性，则不应将这些存在缺陷的孔纳入实验。此类排除操作应在实施任何处理前完成。
此外，使用96孔板可在染色过程中方便地使用多通道移液器，并可通过自动板式显微镜直接观察，进一步提高通量。自动图像定量分析对于高内涵成像平台的数据分析至关重要。除了能够处理每次实验获得的数千张图像外，它还能对所有处理组进行无偏倚、一致的定量分析。所提出的图像分析工作流程基于以下简单原则：对多巴胺能神经元进行分割，通过有监督的机器学习筛选正确分割的细胞，随后再次利用有监督的机器学习对表型（pS129-αsyn阳性与pS129-αsyn阴性）进行定量分析。尽管该任务可设想采用多种不同方法，但我们发现，由于多巴胺能神经元培养密度高、细胞形态多样以及存在强染色的神经突，结合分割与机器学习的方法在多巴胺能神经元培养中最为稳健。所提出的图像分析算法已在CellProfiler和CellProfiler Analyst中实现，二者为开源、免费的高内涵图像分析软件26,27。该算法也可在其他图像分析软件中实现，无论是开源软件（如ImageJ/FIJI、KNIME）还是商业软件。然而，根据我们的经验，这些软件通常为了使用便捷而牺牲了自定义能力，因此在复杂分析中可能表现不佳。我们发现，CellProfiler和CellProfiler Analyst软件包结合了大量内置算法、极高的工作流程设计灵活性，以及对高内涵成像数据的并行高效处理能力，能够提供特别可靠的结果。
所述方案也可适用于其他通过不同抗体免疫染色鉴定的细胞表型的定量分析，例如其他神经元群体的标志物（如 DAT、GAD67、5-HT 等）以及蛋白质聚集体（如磷酸化 Tau、泛素）。也可联合使用多种荧光标记物以区分多种表型（例如处于不同成熟阶段的包涵体细胞）。通过在测量步骤中增加包含额外标志物免疫荧光图像的通道，并将细胞分入多个类别，即可在所述图像分析流程中轻松实现多种表型的自动化分类。然而，同时使用多种标记物需要优化免疫染色和成像条件。此外，为了获得更高质量的免疫荧光成像效果，建议使用专为荧光显微镜设计的特殊黑色壁 96 孔板。但这类耗材的成本明显高于标准细胞培养板，而后者已足以满足本方案中所述分析的需求。
所使用的PFFs的类型和质量对实验结果至关重要。PFFs既可能影响检测的稳健性，也可能影响结果的解释。制备条件可能会影响PFFs的接种效率，事实上已有报道指出具有不同生理特性的PFF "株系"的存在36。然而，PFFs的制备与验证超出了本文的范围，相关方法已在多篇文献中详细描述11,28,29,30。除了制备方案外，还需根据具体的实验条件，考虑PFFs中α-突触核蛋白的来源物种（例如小鼠、人源）以及使用野生型或突变型蛋白（例如人源A53T α-突触核蛋白）。研究表明，PFFs诱导pS129-αsyn聚集的程度依赖于培养物的年龄（即体外培养天数），更成熟的培养物表现出更显著的诱导效应11。这可能是由于更成熟的培养物中神经元连接数量增加，以及α-突触核蛋白表达水平升高所致。在我们的实验中，于DIV8（体外培养第8天）进行PFF处理可获得最稳健的结果，此时多巴胺能神经元胞体中pS129-αsyn的聚集显著，且未影响神经元存活。本方案非常适合研究干预内源性α-突触核蛋白聚集早期事件的治疗方法，因为我们是在接种PFFs后相对较早的时间点（7天）定量分析pS129-αsyn阳性包涵体。在此时间点，大量细胞中已出现胞内包涵体，可通过免疫染色清晰识别，且尚未观察到由PFF引起的细胞死亡，从而简化了结果的解读。重要的是，由于PFF诱导形成的包涵体在形态和组成上可能随时间发生变化12,13，原则上可通过在更晚的时间点进行固定和免疫染色，对本方案进行调整以研究更成熟的包涵体。然而，将多巴胺能神经元在体外培养超过15天需要极为谨慎的操作，且可能因细胞在未接种PFF的情况下无法存活而引入额外变异。此外，长期培养也会使药物处理方案更加复杂。许多化合物在细胞培养基中的稳定性有限或尚未被充分表征，且药物补充并非易事，因为完全更换培养基会损害多巴胺能神经元的存活。
在基于PFF的α-突触核蛋白聚集模型中，Ser129位点的磷酸化现象被广泛报道，并且与错误折叠和聚集的标志物（如硫黄素S、泛素或构象特异性抗体）共定位11,12。在我们的实验中，pS129-αsyn免疫染色信号最强、背景最低，分析最为简便，在筛选多种处理条件时可获得稳健的结果。重要的是，pS129-αsyn抗体的免疫染色不会检测到仍存在于细胞外的PFFs，从而显著降低背景信号。然而，必须注意的是，Ser129磷酸化可能是与α-突触核蛋白错误折叠相关的最早事件之一，并且在特定条件下可能受到不同的调控。因此，任何显示对pS129-αsyn具有积极作用的结果，均应通过其他标志物加以验证。
统计分析应根据实验设计相应地进行调整。实验至少需要进行三次独立的生物学重复（即独立的原代神经元培养）。这些重复实验应接种在不同的培养板上，并独立处理。我们采用随机区组设计的方差分析（ANOVA）37来分析来自不同培养板的重复实验数据，以考虑不同实验板之间数据的配对关系。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Kelvin Luk教授慷慨提供α-突触核蛋白PFFs，感谢Conjung Zheng建立和培养神经元细胞，以及赫尔辛基大学生物技术研究所光学显微镜单元在免疫染色细胞成像方面的支持。本工作获得了芬兰商业芬兰（芬兰创新资助机构）3i-再生项目、芬兰科学院（项目编号#309489、#293392、#319195）、Sigrid Juselius基金会，以及波兰科学院Maj药理学研究所法定资金的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4% 台盼蓝染色液 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR 聚丙烯离心管 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M 盐酸 | N/A | N/A | 媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所 |
| 5 M 氢氧化钠 | N/A | N/A | 媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所 |
| 96 孔视窗板（黑色） | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% 乙醇（EtOH） | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil 硅化液 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| 高压灭菌 1.5 ml 微量离心管 | N/A | N/A | 媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所 |
| Bioruptor 超声破碎仪 | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| 无 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS） | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler 和 CellAnalyst 软件包 | N/A | N/A | 免费开源软件 |
| Centrifuge 5702 离心机 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO₂ 培养箱 | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| 细胞计数板 | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| 配备气浮台和机柜的 DeltaVision 超高分辨率显微镜 | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I（Dnase I） | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 培养基 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| 驴抗小鼠 AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| 驴抗兔 AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| 驴抗绵羊 AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| 杜氏缓冲液 | N/A | N/A | 媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand 普通经济型 PTFE 搅拌子 | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano 自动成像系统 | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| 小鼠单克隆抗酪氨酸羟化酶抗体 | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 添加剂 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| 正常马血清 | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| 95% 多聚甲醛粉末 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix 显色固定 pH 指示条 | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | N/A | N/A | 媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所 |
| 聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| 兔单克隆抗α-突触核蛋白纤维抗体 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| 兔单克隆抗磷酸化丝氨酸129-α-突触核蛋白抗体 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic IKA 磁力搅拌器 | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| 重组人胶质细胞源性神经营养因子（hGDNF） | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 或 Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| 重组小鼠α-突触核蛋白预形成纤维（PFFs） | N/A | N/A | 合作研究者 Kelvin C Luk 教授惠赠 |
| 研究用体视显微镜系统 | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| 绵羊多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体 | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 自动细胞计数仪 | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| 胰蛋白酶 | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
参考文献
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