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方法文章

向大鼠和小鼠脑内动脉内递送神经干细胞：应用于脑缺血

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DOI：

10.3791/61119

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2020年6月26日

 ,  ,  , 
1College of Public Health, Shaanxi University of Chinese Medicine, 2Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, University of Kentucky

本文内容

摘要

本文报道了一种通过小鼠颈总动脉或大鼠颈外动脉在缺血性脑卒中后递送神经干细胞的方法，该方法适用于注射溶液或悬浮液。注射后的细胞广泛分布于脑实质中，并可在递送后长达30天内被检测到。

摘要

神经干细胞（NSC）治疗是一种针对脑卒中、创伤性脑损伤及神经退行性疾病新兴的创新疗法。与颅内给药相比，经动脉途径注射NSC侵入性更小，且能使神经干细胞在脑实质内实现更广泛的分布。此外，动脉内给药可利用脑循环的首过效应，减少细胞在肝脏和脾脏等外周器官中的滞留风险，而外周注射常伴随此类并发症。本文详细描述了在小鼠和大鼠中，通过颈总动脉（小鼠）或颈外动脉（大鼠）向缺血性脑卒中后同侧半球输送NSC的方法。通过使用GFP标记的NSC，我们展示了在缺血后1天、1周和4周时，NSC在啮齿类动物同侧半脑中广泛分布的情况，其中在缺血损伤区域内部或附近密度更高。除了长期存活外，我们在4周时还观察到了GFP标记细胞分化的证据。本文所述的NSC经动脉给药方法也可用于递送治疗性化合物，因此在多种物种的不同中枢神经系统损伤和疾病模型中具有广泛的应用前景。

引言

干细胞（SC）疗法在治疗脑卒中、头部外伤和痴呆等神经系统疾病方面具有巨大潜力1,2,3,4,5,6。然而，如何高效地将外源性干细胞递送至病变脑组织仍是一个难题2,6,7,8,9,10,11,12,13。通过外周途径（如静脉注射（IV）或腹腔注射（IP））递送的干细胞会受到微循环中的首过清除效应影响，尤其是在肺、肝、脾和肌肉中8,9,13,14，从而增加细胞在非靶向区域积聚的风险。侵入性的脑内注射方法则会导致局部脑组织损伤，并且干细胞在注射部位附近的分布范围极为有限2,6,8,14,15,16。我们近期建立了一种基于导管的动脉内注射方法，用于递送外源性神经干细胞（NSCs），本文描述了该方法在局灶性缺血性脑卒中啮齿类动物模型中的应用。我们使用涂有硅胶的细丝阻塞小鼠或大鼠左侧大脑中动脉（MCA），从而在一侧大脑半球诱导短暂（1小时）的缺血-再灌注损伤17,18,19。在此模型中，通过激光多普勒或激光散斑成像技术可重复观察到同侧半球脑血流量（CBF）下降约75–85%17,19，并产生稳定的神经功能缺损17,18,19。

为节省时间，视频以正常速度的两倍播放，并且未展示皮肤准备、缝合伤口等常规外科操作，以及电动注射泵的使用和设置过程。神经干细胞（NSCs）的动脉内递送方法是在啮齿类动物实验性脑卒中模型——大脑中动脉闭塞（MCAO）模型背景下进行演示的。因此，我们包含了短暂性缺血性脑卒中手术步骤，以便后续在同一动物先前手术部位的基础上，展示如何实施第二次手术，即动脉内注射。通过评估外源性神经干细胞在体内的分布与存活情况，验证了在啮齿类脑卒中模型中进行动脉内NSC递送的可行性。NSC治疗减轻脑部病理改变和神经功能障碍的有效性将另行报道。

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方案

所有涉及动物的实验程序均经肯塔基大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并采取适当措施以尽量减少手术相关的应激或疼痛。

1. 注射导管和手术钩的制备

  1. 构建注射导管（图1）。准备所需材料，包括：MRE010、MRE025 和 MRE050 导管，20 G、26 G 和 27 G 注射针（图2A），600 目砂纸、瞬干胶和双组分 5 分钟环氧树脂。
    1. 从针座端起，在 1 cm 处截断 20 G 和 26 G 针头，并在砂纸上打磨断端（图2B）。用 10 mL 双蒸水冲洗针头以清洁针腔。
      注意：使用两种不同的设计（图1）。设计 1 为单接头，用于注射溶液或悬浮液。设计 2 具有 20 G 和 26 G 鲁尔锁接头，分别用于细胞注射（20 G 针）和冲洗死腔体积（26 G 针），以确保将含神经干细胞（NSC）的溶液全部注入。
  2. 设计 1：将一段 3–4 cm 长的 MRE010 导管插入一段 15 cm 长的 MRE025 导管中，并用瞬干胶固定。
    1. 将 MRE025 导管的另一端连接至一段 MRE050 导管，并用瞬干胶固定。将一根钝化的 20 G 针头插入 MRE050 导管的剩余末端，并用瞬干胶固定（图1）。
    2. 使用环氧树脂进一步加固各连接部位。该导管设计适用于试剂注射（如化学物质、药物溶液或其他生物制剂，如细胞因子）。
  3. 设计 2：将一段 3–4 cm 长的 MRE010 导管插入一段 15 cm 长的 MRE025 导管中，并用瞬干胶固定。
    1. 将 MRE025 导管的另一端连接至一段 MRE050 导管，并用瞬干胶固定。将一根钝化的 20 G 针头插入 MRE050 导管的剩余末端，并用瞬干胶固定。
    2. 沿注射流向，在靠近第一根针头尖端的位置，将一根钝化的 26 G 针头插入 MRE050 导管，并用瞬干胶固定（图1 和 图2C）。使用透明环氧树脂加固两根针头及 MRE050 导管段（图2C）。该设计允许在通过针 1（20 G）注射神经干细胞后，通过针 2（26 G）注入载体溶液，以冲洗导管内的死腔体积，从而实现对注射体积的更精确控制。
    3. 使用 20 G 针头进行神经干细胞注射，以尽量减少对细胞的损伤，避免影响其活力。
  4. 构建完成后，先用 10 mL 双蒸水冲洗导管，再用 70% 乙醇冲洗，然后在 70% 乙醇中浸泡过夜。
  5. 手术前，将导管从 70% 乙醇中取出，用 10 mL 无菌 PBS 冲洗，并将其放入已灭菌的手术器械盒中保存和运输。
  6. 手术钩的制备
    1. 从 27 G 针头截取一段 1.5–2 cm 长的针杆，用砂纸打磨两端至钝化。然后使用小型止血钳将针杆一端弯成钩状，另一端弯成环状。
    2. 将一段 10–15 cm 长的 MRE025 导管穿过环状端，并用透明外科胶带固定（图2D）。用相同方法再制作两个钩子。
    3. 将所有钩子和导管系统浸泡于 70% 乙醇中，待用。

2. 动物准备：给药、饲养、环境适应

  1. 本研究使用雄性和雌性 C57BL/6 小鼠（10–12 周龄，每时间点 n=10）和 Wistar 大鼠（10–12 周龄，n=10）。
  2. 将动物饲养在环境可控的动物实验室内，自由摄取食物和水。
  3. 在脑卒中手术前，让动物至少适应环境 1 周。
    注：1 只小鼠和 1 只大鼠在脑卒中手术后 1 天死亡，另有 1 只小鼠因严重瘫痪出于人道原因在卒中后第 3 天于神经干细胞注射前实施安乐死。

3. 小鼠和大鼠神经干细胞（NSCs）的培养

注意：神经干细胞（NSC）的分离与培养遵循既定方案20。

  1. 小鼠
    1. 从与GFP阳性雄性小鼠（B6 ACTb-EGFP）交配的定时妊娠C57BL/6雌性小鼠的E18胚胎皮层中分离野生型（WT）和GFP标记的NSCs。为鉴定GFP（+）胚胎，将收获的胚胎置于荧光显微镜下使用FITC通道观察。GFP（+）胚胎显示绿色荧光信号，而WT胚胎仅显示微弱的自发荧光（图3A）。
  2. 大鼠
    1. 从年轻成年WT大鼠的脑室下区（SVZ）分离NSCs。按照制造商说明书，在注射前用DiI进行标记21。
  3. 培养小鼠或大鼠NSCs，直至其形成神经球，当神经球直径达到约100 µm时进行传代（图3B）。用于注射的NSCs应处于第3至第5代之间。
  4. 使用胚胎干细胞标志物抗体组合验证其干细胞特性（图3C）。
  5. 在注射当天，收集NSC神经球，用细胞解离液解离后，重悬于无钙、无镁的PBS中，细胞浓度为107个/mL，并置于湿冰上保存直至注射。

4. 手术准备

  1. 手术前，使用银色记号笔在商用MCAO缝合线上距离尖端9 mm（小鼠）或15 mm（大鼠）处标记一个点，作为术中插入长度的参考。每次手术前对手术器械（剪刀、镊子）进行高压灭菌，并在每次操作之间使用玻璃珠灭菌器进行加热灭菌。
  2. 通过吸入5%异氟烷诱导动物麻醉，并以1–2%异氟烷维持麻醉。通过观察动物的一般状况（呼吸模式、胡须运动和自发体位矫正）、角膜反射以及足趾夹捏反应来评估麻醉深度。
  3. 将动物仰卧于加热垫上，使用聚维酮碘溶液对动物手术区域进行剪毛和擦拭消毒，随后用70%乙醇冲洗。术中使用眼用软膏（例如人工泪液软膏）保护动物眼睛，防止干燥。
  4. 手术人员需使用杀菌洗手液彻底清洁双手，并佩戴口罩、无菌手套和洁净实验服。

5. 大脑中动脉阻塞（MCAO）卒中手术

注意：在小鼠或大鼠单侧大脑诱导缺血性脑卒中的手术方法相似，均是将缝线插入颈内动脉（ICA）以阻断血流（图4）17,18,19,22。然而，选择用于插入缝线的动脉取决于后续干细胞注射所需的操作空间。大鼠的颈外动脉（ECA）段具有足够的操作空间，可允许进行两次独立且连续的手术（脑卒中建模和NSC注射），而小鼠则不具备这一条件，因此需要采用替代方法。有关脑卒中诱导后的脑血流变化、脑梗死面积及神经功能缺损情况，已在作者先前的报道中有所描述17,18,19。

  1. 为诱导缺血性脑卒中，开始小鼠和大鼠手术时，先在颈部区域做正中切口，并分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。图4）。注意避免拉伸、移位或挤压颈总动脉（CCA）或迷走神经。由于后续动脉选择和手术步骤有所不同，小鼠与大鼠的MCAO手术将分别描述。
  2. 小鼠MCAO手术（图4A)
    1. 在颈总动脉（CCA）下方放置三根编织的6-0尼龙缝线图4A，步骤1），使用近端结扎线打一个紧密的外科结，尽可能远离分叉处以阻断血管图4A，步骤 2）。剪短缝合线末端。
    2. 在颈总动脉远端打一个滑结（注意：不要过度收紧，因该结将在第6步中松开），并在两个已收紧的结之间打一个松散的滑结图4A，步骤 2。
    3. 切开一个小切口（~ ¼ - ⅓ 用显微剪刀在颈总动脉（CCA）近端结扎处附近剪开约三分之一周长的小口图4A，步骤 3），并小心插入商用硅胶包被的 7-0 实心尼龙线栓（图4A，步骤4）。用中间的线固定此缝线，适度收紧（图4A，步骤5）确保切口无血液渗漏，且颈内动脉（ICA）的反流不会导致硅胶包被尼龙线栓移动，同时仍允许用镊子轻轻推动缝合线向颈外动脉（ECA）方向前进。
    4. 松开上方（远端）的活结（图4A，步骤6）并将尼龙线推进至颈内动脉，直至其尖端超过分叉处9 mm（以缝线上银色标记作为参考）。扎紧上方两个滑结以固定缝线，防止血液反流。
    5. 1 小时后撤出细丝（图4A，步骤7），并使用中间结扎线结扎CCA以防止出血（图4A，按步骤5-7的相反顺序操作，最终结果如步骤8所示）。松开上方的结。用4-0外科缝线关闭切口。
  3. 大鼠MCAO手术（图4B)
    1. 在颈外动脉（ECA）下方放置两根编织的6-0尼龙缝线图4B，步骤1），并在远端尽可能远处打一个紧结（图4B，步骤 2）。
    2. 在颈内动脉和颈总动脉上放置血管夹以阻断动脉血流（图4B，步骤3）。滑结可作为血管夹的替代方法。
    3. 用显微剪刀在颈外动脉（ECA）上做一个小切口（图 4B，步骤3-4），插入商用硅胶包被的6-0尼龙线 filament（图4B，步骤5），并用滑结在ECA上妥善固定。
    4. 松开 ICA 上的血管夹，将尼龙丝推进 ICA，直至银色标记（15 mm）到达分叉处图4B，步骤6），然后用2号缝线固定nd ECA 上的结（图4B，步骤 6。
    5. 缺血1小时后，撤出该线栓并结扎切口以防止出血（图4B，步骤7），从颈总动脉（CCA）上移除血管夹（最终结果如步骤8所示），并用4-0外科缝线关闭切口。

6. 恢复

  1. 卒中手术后，将动物置于加热垫上，直至其完全恢复意识。
  2. 通过皮下注射给予镇痛药物。将动物放回饲养笼中，并可自由获取水和食物。

7. 动脉内注射

  1. 用70%乙醇清洗整个导管，并浸泡过夜直至使用。注射前，将针头的鲁尔锁接头与无菌注射器连接，用10 mL无菌PBS冲洗导管系统的整个管腔侧。
  2. NSC注射的时间窗与准备
    注意：根据经验及其他研究团队的报告，NSC注射的时间对于受试动物及外源性NSC的存活至关重要。在我们的初步研究中，早期时间点（再灌注后6小时内）注射NSC导致较高的死亡率。因此，我们测试了较晚的注射时间点，并确定卒中后2天（48小时）至3天（72小时）之间的时间窗对动物是安全且可耐受的，并能有效实现NSC在脑实质内的分布。本文所展示的结果均来自卒中后3天接受NSC注射的动物。
    1. 将注射泵的注射速率设定为小鼠20 µL/min，大鼠50 µL/min。注射速度过快或持续时间过长可能导致全身容量超负荷，小鼠比大鼠对此更为敏感。
    2. 简言之，在卒中手术后第3天，用异氟烷麻醉动物，并将其仰卧于加热垫上。
    3. 重新打开颈部切口，再次暴露ECA、ICA和CCA（图5，步骤1）。与卒中手术相同，根据物种确定注射路径：小鼠使用CCA进行NSC注射，大鼠使用ECA23。
  3. 通过小鼠CCA进行动脉内注射
    1. 在CCA下方放置两根6-0编织尼龙缝线。在分叉处与前次卒中手术的下结扎点之间，每根缝线打一个松动的滑结（图5，步骤2）。
    2. 收紧上方滑结，然后在下结扎点上方做一个小切口（图5，步骤3）。通过切口插入MRE010导管（图5，步骤4），并用中间结扎线固定，确保不阻塞注射流路（图5，步骤5）。松开上方结扎线并调整导管位置时，应可见导管内有血液回流。
    3. 在ECA上放置血管夹，通过该导管以20 µL/min的速度在5分钟内注入1 × 106个GFP-NSC，随后以相同速度用50–100 µL PBS冲洗。
    4. 注射完成后，用上方滑结在切口上方结扎CCA，并撤出MRE010导管（图5，步骤6）。收紧并修剪中间结和上方结。移除ECA上的血管夹。参见图5的最终图像（步骤7）。
    5. 用4-0外科缝线关闭切口。
    6. 在加热垫上充分恢复，并皮下注射镇痛剂后，将动物放回其原有笼具中。
  4. 通过大鼠ECA进行动脉内注射
    1. 用血管夹暂时阻断ECA和CCA（图5，步骤2）。
    2. 在ECA近端做一小切口（图5，步骤3），插入MRE010导管，并用结扎线固定（图5，步骤4）。
    3. 移除两个血管夹，使用电动注射泵以50 µL/min的速度在2分钟内注入5 × 106个NSC（溶于100 µL PBS中），随后以相同速度用50–100 µL PBS冲洗（图5，步骤5）。
    4. 注射完成后，再次用血管夹阻断CCA和ECA，在撤出注射导管后，于第二切口近端结扎ECA（图5，步骤6）。
    5. 移除两个血管夹（图5，步骤7），并用4-0外科缝线关闭切口。
    6. 在加热垫上充分恢复，并皮下注射镇痛剂后，将动物放回其原有笼具中。
  5. 组织学检测
    1. 在注射NSC或载体溶液后，对接受缺血性卒中建模的大小鼠实施安乐死，并经心灌注4%多聚甲醛，随后采集其脑组织，分别于注射后1天（大小鼠）、7天（小鼠）和30天（小鼠）进行取材。这四个组每组均包括5只注射NSC和5只注射载体的动物。
    2. 将脑组织固定过夜，并在30%蔗糖中冷冻保存3天。
    3. 将脑组织包埋于OCT中，切片 厚度为40 µm，通过免疫染色检测NSC的分布情况，所用细胞特异性标记物包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞）、Tuj1（成熟神经元）和双皮质素（DCX，未成熟神经元）。
      注意：由于缺乏表达GFP的大鼠品系，我们使用DiI（一种短暂的荧光标记物）标记大鼠NSC，该标记仅支持相对较短时间的观察。因此，大鼠NSC的分布仅在卒中后1天进行检测。

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结果

在缺血性脑组织中可轻易检测到GFP标记的NSCs，主要位于同侧半球，尤其是半暗带区域及损伤边缘（图6）。成像与分析过程中，观察者处于单盲状态。

例如，在注射后第1天，可在小鼠海马体内检测到神经干细胞（NSCs）。即使在此早期时间点，部分神经干细胞在齿状回中也显示出与未成熟神经元标志物DCX共表达（图6A）。

在卒中后第10天（NSC注射后第7天），在纹状体和皮层的损伤边缘区（分水岭区域）观察到外源性GFP-NSCs密度最高（图6B）。值得注意的是，在注射后7天，许多GFP-NSCs也开始表达DCX（由蓝色圆圈标示），表明其向神经元方向分化。与接受载体溶液注射的动物相比，NSC注射还增加了同侧半球的DCX染色（红色）信号。

注射后30天，仍可在损伤皮层中检测到神经干细胞，其中部分细胞表现出胶质细胞...

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讨论

干细胞治疗神经系统疾病仍处于早期探索阶段。其中一个主要问题是，目前尚无成熟的方法能够将干细胞（SCs）或神经干细胞（NSCs）充分递送至大脑。

尽管通过静脉（IV）、腹腔（IP）或脑实质/脑内注射后可在脑内检测到外源性施万细胞（SCs）/神经干细胞（NSCs），但每种递送方式均存在局限性。通过外周注射（IV或IP）后，脑内可检测到的细胞数量估计极低，仅占注射或输注细胞的一小部分。脑内注射则导致分布极为局限，并可能直接引起脑损伤2,6,7,8,9,10,11,12

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致谢

本研究获得以下资助：美国心脏协会（AHA）奖项14SDG20480186（授予LC），山西中医药大学学科创新团队项目2019-QN07（授予BZ），肯塔基州脊髓与头部损伤研究信托基金14-12A（授予KES和LC）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20 G 针头Becton & DickinsonBD PrecisionGlide 305175注射导管制备
26 G 针头Becton & DickinsonBD PrecisionGlide 305111注射导管制备
27 G 针头Becton & DickinsonBD PrecisionGlide 305136注射导管制备
4-0 NFS-2 缝合线（带针）Henry Schein 动物健康56905手术
6-0 尼龙缝合线Teleflex/Braintree Scientific104-s手术
AccutaseSTEMCELL Technologies7922细胞解离溶液
刀片Bard-Parker10手术
Buprenorphine-SR LabZooPharmBuprenorphine-SR Lab®镇痛（0.6–1 mg/kg，持续 3 天）
无钙/镁 PBSVWR02-0119-0500神经干细胞解离
DCX 抗体MilliporeAB2253免疫染色
GFAP 抗体Invitrogen180063免疫染色
异氟烷Henry Schein 动物健康50562-1手术
小鼠用 MCAO 线栓Doccol702223PK5Re手术
大鼠用 MCAO 线栓Doccol503334PK5Re手术
MRE010 导管Braintree ScientificMRE010注射导管制备
MRE025 导管Braintree ScientificMRE025注射导管制备
MRE050 导管Braintree ScientificMRE050注射导管制备
Nu-Tears 眼膏NuLife PharmaceuticalsNu-Tears Ointment术中眼部护理
S&T 镊子 - SuperGrip 尖端 JF-5TC 角形Fine Science Tools00649-11手术
S&T 镊子 - SuperGrip 尖端 JF-5TC 直形Fine Science Tools00632-11手术
超级胶水Pacer Technology15187注射导管制备
注射泵Kent ScientificGenieTouch手术
Tuj1 抗体MilliporeMAb1637免疫染色
双组分 5 分钟环氧树脂Devcon20445注射导管制备
Vannas 弹簧剪Fine Science Tools15000-08手术
血管夹Fine Science Tools00400-03手术
蔡司显微镜ZeissAxio Imager 2显微成像

参考文献

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颈总动脉颈外动脉大脑中动脉闭塞GFP标记细胞手术钩注射导管干细胞治疗
向大鼠和小鼠脑内动脉内递送神经干细胞：应用于脑缺血
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