本文报道了一种通过小鼠颈总动脉或大鼠颈外动脉在缺血性脑卒中后递送神经干细胞的方法，该方法适用于注射溶液或悬浮液。注射后的细胞广泛分布于脑实质中，并可在递送后长达30天内被检测到。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
神经干细胞（NSC）治疗是一种针对脑卒中、创伤性脑损伤及神经退行性疾病新兴的创新疗法。与颅内给药相比，经动脉途径注射NSC侵入性更小，且能使神经干细胞在脑实质内实现更广泛的分布。此外，动脉内给药可利用脑循环的首过效应，减少细胞在肝脏和脾脏等外周器官中的滞留风险，而外周注射常伴随此类并发症。本文详细描述了在小鼠和大鼠中，通过颈总动脉（小鼠）或颈外动脉（大鼠）向缺血性脑卒中后同侧半球输送NSC的方法。通过使用GFP标记的NSC，我们展示了在缺血后1天、1周和4周时，NSC在啮齿类动物同侧半脑中广泛分布的情况，其中在缺血损伤区域内部或附近密度更高。除了长期存活外，我们在4周时还观察到了GFP标记细胞分化的证据。本文所述的NSC经动脉给药方法也可用于递送治疗性化合物，因此在多种物种的不同中枢神经系统损伤和疾病模型中具有广泛的应用前景。
引言
干细胞（SC）疗法在治疗脑卒中、头部外伤和痴呆等神经系统疾病方面具有巨大潜力1,2,3,4,5,6。然而，如何高效地将外源性干细胞递送至病变脑组织仍是一个难题2,6,7,8,9,10,11,12,13。通过外周途径（如静脉注射（IV）或腹腔注射（IP））递送的干细胞会受到微循环中的首过清除效应影响，尤其是在肺、肝、脾和肌肉中
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及动物的实验程序均经肯塔基大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并采取适当措施以尽量减少手术相关的应激或疼痛。
1. 注射导管和手术钩的制备
- 构建注射导管（图1）。准备所需材料，包括：MRE010、MRE025 和 MRE050 导管，20 G、26 G 和 27 G 注射针（图2A），600 目砂纸、瞬干胶和双组分 5 分钟环氧树脂。
- 从针座端起，在 1 cm 处截断 20 G 和 26 G 针头，并在砂纸上打磨断端（图2B）。用 10 mL 双蒸水冲洗针头以清洁针腔。
注意：使用两种不同的设计（图1）。设计 1 为单接头，用于注射溶液或悬浮液。设计 2 具有 20 G 和 26 G 鲁尔锁接头，分别用于细胞注射（20 G 针）和冲洗死腔体积（26 G 针），以确保将含神经干细胞（NSC）的溶液全部注入。
- 从针座端起，在 1 cm 处截断 20 G 和 26 G 针头，并在砂纸上打磨断端（图2B）。用 10 mL 双蒸水冲洗针头以清洁针腔。
- 设计 1：将一段 3–4 cm 长的 MRE010 导管插入一段 15 cm 长的 MRE025 导管中，并用瞬干胶固定。
- 将 MRE025 导管的另一端连接至一段 MRE050 导管，....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在缺血性脑组织中可轻易检测到GFP标记的NSCs，主要位于同侧半球，尤其是半暗带区域及损伤边缘（图6）。成像与分析过程中，观察者处于单盲状态。
例如，在注射后第1天，可在小鼠海马体内检测到神经干细胞（NSCs）。即使在此早期时间点，部分神经干细胞在齿状回中也显示出与未成熟神经元标志物DCX共表达（图6A）。
在卒中后第10天（NSC注射后第7天），在纹状体和皮层的损伤边缘区（分水岭区域）观察到外源性GFP-NSCs密度最高（图6B）。值得注意的是，在注射后7天，许多GFP-NSCs也开始表达DCX（由蓝色圆圈标示），表明其向神经元方向分化。与接受载体溶液注射的动物相比，NSC注射还增加了同侧半球的DCX染色（红色）信号。
注射后30天，仍可在损伤皮层中检测到神经干细胞，其中部分细胞表现出胶质细胞.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
干细胞治疗神经系统疾病仍处于早期探索阶段。其中一个主要问题是，目前尚无成熟的方法能够将干细胞（SCs）或神经干细胞（NSCs）充分递送至大脑。
尽管通过静脉（IV）、腹腔（IP）或脑实质/脑内注射后可在脑内检测到外源性施万细胞（SCs）/神经干细胞（NSCs），但每种递送方式均存在局限性。通过外周注射（IV或IP）后，脑内可检测到的细胞数量估计极低，仅占注射或输注细胞的一小部分。脑内注射则导致分布极为局限，并可能直接引起脑损伤2,6,7,8,9,10,11,12
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本研究获得以下资助：美国心脏协会（AHA）奖项14SDG20480186（授予LC），山西中医药大学学科创新团队项目2019-QN07（授予BZ），肯塔基州脊髓与头部损伤研究信托基金14-12A（授予KES和LC）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20 G 针头 | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | 注射导管制备 |
| 26 G 针头 | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | 注射导管制备 |
| 27 G 针头 | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | 注射导管制备 |
| 4-0 NFS-2 缝合线（带针） | Henry Schein 动物健康 | 56905 | 手术 |
| 6-0 尼龙缝合线 | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | 手术 |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | 细胞解离溶液 |
| 刀片 | Bard-Parker | 10 | 手术 |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | 镇痛（0.6–1 mg/kg，持续 3 天） |
| 无钙/镁 PBS | VWR | 02-0119-0500 | 神经干细胞解离 |
| DCX 抗体 | Millipore | AB2253 | 免疫染色 |
| GFAP 抗体 | Invitrogen | 180063 | 免疫染色 |
| 异氟烷 | Henry Schein 动物健康 | 50562-1 | 手术 |
| 小鼠用 MCAO 线栓 | Doccol | 702223PK5Re | 手术 |
| 大鼠用 MCAO 线栓 | Doccol | 503334PK5Re | 手术 |
| MRE010 导管 | Braintree Scientific | MRE010 | 注射导管制备 |
| MRE025 导管 | Braintree Scientific | MRE025 | 注射导管制备 |
| MRE050 导管 | Braintree Scientific | MRE050 | 注射导管制备 |
| Nu-Tears 眼膏 | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | 术中眼部护理 |
| S&T 镊子 - SuperGrip 尖端 JF-5TC 角形 | Fine Science Tools | 00649-11 | 手术 |
| S&T 镊子 - SuperGrip 尖端 JF-5TC 直形 | Fine Science Tools | 00632-11 | 手术 |
| 超级胶水 | Pacer Technology | 15187 | 注射导管制备 |
| 注射泵 | Kent Scientific | GenieTouch | 手术 |
| Tuj1 抗体 | Millipore | MAb1637 | 免疫染色 |
| 双组分 5 分钟环氧树脂 | Devcon | 20445 | 注射导管制备 |
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-08 | 手术 |
| 血管夹 | Fine Science Tools | 00400-03 | 手术 |
| 蔡司显微镜 | Zeiss | Axio Imager 2 | 显微成像 |
参考文献
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D.,....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
