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利用分子动力学模拟解析EGFR体细胞激活突变的结构效应

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DOI：

10.3791/61125

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2020年5月20日

 ,  ,  , 
1Structural Bioinformatics Laboratory, Biochemistry, Faculty of Science and Engineering, Åbo Akademi University, 2Medicity Research Laboratories and Institute of Biomedicine, University of Turku, 3Turku Bioscience Centre, University of Turku and Åbo Akademi University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, University of Turku and Turku University Hospital

本文内容

摘要

本实验方案的目的是利用分子动力学模拟，研究EGFR激酶蛋白激活突变所引起的动态结构变化。

摘要

已在癌症患者中报道了表皮生长因子受体（EGFR）家族（ErbB）受体酪氨酸激酶（RTK）中存在的大量体细胞突变，但其中仅有少数突变经过实验验证并被证明可导致ErbB功能改变。ErbB受体在配体结合后发生二聚化并被激活，受体的动态构象变化是启动下游信号传导的内在基础。针对两种经实验验证可改变EGFR功能的突变——A702V突变和Δ746ELREA750缺失突变，本方案将说明如何利用分子动力学（MD）模拟来探究以下方面：（1）与野生型EGFR相比，突变型酪氨酸激酶结构的构象稳定性；（2）结构变化及构象转变及其与观察到的功能改变之间的关系；（3）突变对ATP结合强度以及激活态非对称二聚体中激酶结构域间相互作用的影响；（4）突变对EGFR结合位点内与酶激活相关的关键相互作用的影响。本方案提供了一套详细的逐步操作流程，以及更广泛适用于利用分子动力学模拟研究蛋白质结构、探索其结构动态性与生物学功能关系的指导建议。

引言

人表皮生长因子受体（EGFR）家族（ErbB）属于受体酪氨酸激酶（RTKs），包含四个成员：EGFR/ErbB1/HER1、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3 和 ErbB4/HER4。ErbB 受体调控细胞生长与增殖、分化、迁移和存活等基本细胞过程1,2，因此是重要的原癌基因。ErbB 受体（尤其是 EGFR 和 ErbB2）的异常活化常与人类癌症相关，使其成为抗癌治疗的关键靶点2,3。

已在多种人类恶性肿瘤中报道了ERBB基因的多种体细胞改变3,4,5。其中研究最为清楚的例子包括非小细胞肺癌（NSCLC）中表皮生长因子受体（EGFR）激酶结构域内反复出现的激活型点突变和短的框内缺失。这些EGFR突变是驱动癌症生长的关键因素，并可预测肿瘤对靶向EGFR的抗癌药物的敏感性6,7,8。然而，在大多数癌症中，EGFR的体细胞突变发生在这些反复出现的“热点”区域之外，并分布于该受体全长1210个氨基酸的整个序列中。事实上，人类癌症中已发现EGFR一级序列上的大多数残基均可能发生突变9。尽管如此，除少数热点突变外，绝大多数与癌症相关的EGFR突变的功能意义仍不清楚。

ErbB家族蛋白的单体结构包含一个较大的氨基端胞外结构域，其后是一个跨膜α螺旋，连接至胞内酪氨酸激酶结构域以及含有胞内信号蛋白结合位点的羧基端尾部区域。配体结合会引发胞外结构域发生显著的构象改变，暴露出二聚化臂，这些二聚化臂通过彼此对称交叉并以其芳香族/疏水性表面相互作用，从而促进受体二聚体的形成。受体二聚化后，酪氨酸激酶结构域以不对称方式相互接触（图1），导致激酶被激活，进而磷酸化受体单体的羧基端尾部，并最终激活下游信号通路10,11。

EGFR信号通路示意图，显示细胞膜上的激酶激活及EGF结合。
图1：EGFR二聚体的结构。 当EGFR的胞外结构域与生长因子（EGF，表皮生长因子）结合后，EGFR形成二聚体。受体激酶结构域通过与激活型激酶结构域的不对称相互作用而被激活，随后其C端尾部在酪氨酸残基上发生自磷酸化（改编自Tamirat等12）。请点击此处查看该图的放大版本。

由于单体 化学平衡概念；反应方程式；动态过程；可逆反应；平衡状态。 二聚体转变过程中发生的动态结构重排，以及与不对称二聚体形成相关的激酶激活，受体结构全长上发生的突变均可能对受体功能产生影响。本文中，我们介绍了来自先前研究的几个实例，其中通过突变建模与可视化分析已足以解释其对功能造成的影响。

示例1：一项已报道的突变ErbB4中的D595V13，导致ErbB4二聚化及磷酸化增强14。突变位点位置的可视化对于理解所观察到的功能效应至关重要：D595V位于胞外域二聚体臂的对称交叉处（图2A）。这些臂结构主要由芳香族和疏水性氨基酸组成，将极性的天冬氨酸替换为缬氨酸，预期会增强“黏性”疏水相互作用，从而稳定二聚体，并延长磷酸化发生的时间14。最初在每条臂上发现天冬氨酸令人意外，但回顾来看，可将其视为一种活性调控的时间机制，即极性酸性侧链降低了完整二聚体的亲和力和寿命，从而限制激酶介导的磷酸化和信号传导。而缬氨酸的替换则通过进一步稳定ErbB4二聚体，消除了这一保护机制。

带有标记氨基酸 D595、G802、D861 的蛋白质-配体相互作用图；结构分析。
图 2：ErbB4 激活突变及导致激酶失活的 ErbB4 突变的位置。（A）D595（激活型 D595V 突变）位于 ErbB4 胞外域模型的芳香族/疏水性二聚臂上；这些臂在结合生长因子后发生相互关联；（附近的残基以棍状表示）。（B）在 ErbB4 中，G802（失活型 G802dup 突变）有助于形成围绕 ATP 腺嘌呤环的结合口袋，而催化位点 D861（失活型 D861Y 突变）可结合 Mg2+（未显示）和 ATP 的 γ-磷酸基团。请点击此处查看该图的放大版本。

示例2：人们可能预期，靶向激酶结构域ATP结合位点的体细胞突变会改变或消除其酶活性，从而导致信号传导功能受损或完全丧失的激酶失活型受体。在来自乳腺癌、胃癌、结直肠癌或非小细胞肺癌（NSCLC）患者的九种已报道突变中，经实验检测，其中两种突变表现出显著降低的磷酸化活性1516：G802dup（G → GG）和D861Y。这两种失活性体细胞突变均位于酪氨酸激酶结构域的ATP结合位点内（图2B）：甘氨酸的重复插入会破坏腺嘌呤环结合位点的柔性结构，而靠近末端磷酸基团处的小分子天冬氨酸被体积较大的酪氨酸取代，则会物理性阻碍Mg2+-ATP的结合。然而，由于ErbB4可与ErbB2形成异源二聚体（ErbB2本身不结合生长因子，必须依赖与其他能够结合配体的ErbB家族成员结合才能实现异源二聚化），因此ErbB2（活性）-ErbB4（激酶失活）异源二聚体仍可通过Erk/Akt信号通路促进细胞增殖；但由于ErbB4激酶失活，无法激活STAT5信号通路，细胞将不能完成分化16。

在近期的研究中，ErbB蛋白的动态运动被发现与理解某些突变对ErbB功能的影响密切相关，尤其是发生在酪氨酸激酶结构域内的突变。酪氨酸激酶结构域由N叶（主要为β折叠）和C叶（主要为α螺旋）组成，二者之间为ATP结合的催化位点。N叶包含αC螺旋和P环，而活化环（A环）和催化环则位于C叶17,18,19。酪氨酸激酶结构域的晶体结构揭示了两种非活性构象，其中大多数结构呈现Src样非活性状态。在活性构象中，A环上的催化性天冬氨酸朝向ATP结合位点，且αC螺旋朝向ATP结合口袋（“αC-in”构象），形成稳定的谷氨酸-赖氨酸离子对相互作用。

由于ErbB受体及其激酶结构域是高度动态的实体，特别是在突变对功能和生物学活性的影响很可能与ErbB构象状态紧密相关的情况下，评估突变时必须考虑其所经历的动态变化范围。ErbB的X射线晶体结构仅提供三维结构的静态快照，这些快照可能无法充分反映突变所引起的动态效应。为了探究三维（3D）结构所能访问的“能量景观”所对应的动态变化范围，分子动力学（MD）模拟被广泛应用20。对于可能导致酪氨酸激酶结构域内局部构象变化或稳定复合物的突变，进行约100纳秒量级的模拟可能已足够。然而，更大尺度的构象变化（例如激酶结构域在活性与非活性构象之间的转换）则需要更长的模拟时间——通常达到微秒量级21。

关于下述实验方案，我们考虑了酪氨酸激酶结构域内的两个激活突变（图3）。这两个突变均位于激酶结构域中经历局部构象变化的位点，这些变化决定了激酶是否处于活性状态，因此在这两种情况下均应用了分子动力学（MD）模拟。在第一种情况下，我们研究直接影响EGFR受体激酶结构域ATP结合位点及催化机制的变化，特别考察外显子19缺失突变的影响，该突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中具有广泛关联性4,7。Δ746ELREA750突变缩短了αC螺旋前的β3-αC环长度——该αC螺旋在激酶激活时会向结合/活性位点移动，并通过将K745赖氨酸定位以与ATP相互作用，参与形成螺旋上E762与K745之间的关键静电相互作用——从而使该结构域更倾向于激活状态12。在第二种情况下，我们研究EGFR的A702V突变，该突变已被iScream平台证实为一种新型功能获得性激活突变9，并在一名非小细胞肺癌患者中被发现22。受体激酶结构域上的丙氨酸702（A702）位于跨膜区邻近段B（juxtamembrane segment B），处于受体与激活激酶结构域的界面处，在此不对称激酶二聚体复合物中，激酶的构象变化是实现激活所必需的9。

激酶相互作用三维图、蛋白质结构、激活域与接收域、分子生物学研究。
图3：EGFR的不对称激酶结构域二聚体。 A702V突变位于激活域与接收域激酶结构域之间关键的相互作用界面上，靠近αC螺旋，并邻近激活域激酶中的异亮氨酸941。由不对称二聚体形成所诱导的构象变化导致激酶被激活。包含ELREA序列的β3-αC环位于αC螺旋的上游；在激活过程中，αC螺旋向ATP结合位点内侧移动。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

注意：以下将讨论使用分子动力学（MD）模拟研究 ΔELREA 和 A702V 突变对 EGFR 结构影响的详细步骤：

1. 结构准备

注意：为了研究 ΔELREA 突变的结构影响，以下列方式制备野生型和突变型的无配体活性态、ATP结合活性态以及无配体非活性态的EGFR单体结构。

  1. 打开 Chimera23 可视化程序（https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/），以准备野生型无配体活性 EGFR 激酶结构。在 文件 菜单中点击 通过 ID 获取 选项，选择蛋白质数据库（PDB24），并指定 PDB 编号 2GS225（分辨率为 2.8 Å）。PDB 是一个存储通过不同实验技术（包括 X 射线晶体学、核磁共振波谱、冷冻电子显微镜和中子衍射）解析的三维结构的数据库。
  2. 从 EGFR 的 PDB 结构 1M1426（2.6 Å）和 3W2S27（1.9 Å）中提取缺失的结构片段，并将其添加至 2GS2。为此，打开 1M14 和 3W2S，并使用 工具 → 结构比对 菜单中的 MatchMaker 选项将它们与 2GS2 进行叠加。
    1. 从 1M14 和 3W2S 中裁剪出需要添加的片段。选择 2GS2 中缺口前一个残基的末端原子，以及从 1M14 和 3W2S 中需添加的原子（有关添加片段的详细信息，请参见 表 1）。在命令行输入 bond sel 并按 回车。该结构即为 模板 结构。
  3. 利用步骤 1.2 中获得的模板结构，构建 EGFR 激酶结构域的 ΔELREA 缺失突变体形式。通过保存模板结构的序列（收藏夹 → 序列 → 文件 → 另存为）生成 ΔELREA EGFR 的 FASTA 格式序列，然后删除第 746–750 位残基处的 ELREA 序列。
    1. 在 Chimera 中打开 ΔELREA EGFR 序列，并使用 序列 菜单将其与 2GS2 模板结构的序列进行比对。在比对窗口中选择 结构 → Modeller（同源建模）28 选项。
    2. 在弹出窗口中，指定 2GS2 复合结构为模板，突变序列作为待建模的查询序列，然后点击 确定。从生成的多个模型中选择一个突变模型，依据 zDOPE 评分（通常选择评分最低者）并结合视觉检查进行判断。
  4. 为准备 ATP 结合态的野生型 EGFR 激酶结构，使用 PDB 结构 2ITX29（2.98 Å）作为主结构。按照步骤 1.2 的方法，利用结构 2GS625（2.6 Å）和 3W2S 补全缺失的片段（见 表 1）。通过文本编辑器打开生成的 PDB 文件，将配体 ANP 中的 N3B 氮原子更改为氧原子，从而将 ANP 转换为 ATP。
  5. 按照步骤 1.1 所述，在 Chimera 中打开步骤 1.4 得到的结构。从 PDB 结构 2ITN29（2.47 Å）中添加一个镁离子，以使 Mg2+ 离子的位置与参考结构相似。
  6. 基于步骤 1.5 得到的结构，参照步骤 1.3 的方法构建 ΔELREA 突变体形式。
活性EGFR（无配体）非活性EGFR（无配体）ATP结合型活性EGFR
主结构2GS22GS72ITX
用于构建缺失环的结构1M14 (723-725)3W2S (958-984)2GS6 (862-865)
3W2S (967-981)4HJO (848-850)3W2S (990-1001)

表1：用于构建无配体活性态、无配体非活性态和ATP结合活性态复合模型的结构。 主要结构中缺失的区域（括号内为氨基酸范围）由所列结构构建而成。

  1. 为准备野生型无配体非活性EGFR激酶结构，按照步骤1.1打开PDB结构2GS725（2.6 Å），并删除结合的配体和晶体水分子。使用步骤1.2中的方法，从结构3W2S和4HJO30（2.75 Å）中补充2GS7中缺失的片段（见表1）。基于最终的非活性EGFR结构，按照步骤1.3中的方法构建突变体模型。
    注意：对于A702V突变的研究，采用EGFR不对称二聚体结构，因为该突变位于激酶结构域的近膜B区段，该区段构成了二聚体界面的大部分区域。野生型和A702V突变型EGFR结构的构建方法如下：
  2. 野生型不对称二聚体结构由PDB结构2GS2构建而成，该结构最初以单体形式呈现。为转换为包含激活激酶和受体激酶的生物学组装形式（即不对称排列），按照步骤(1.1)在Chimera中打开2GS2，然后点击Tools → Higher-Order Structure → Unit Cell菜单进行对称性计算。选择2GS2结构并点击Make copies。最后，从对称操作生成的多个二聚体副本中选择并保存一个单独的不对称二聚体。
  3. 利用步骤1.8获得的野生型不对称EGFR结构，在Chimera中通过Tools → Structure editing → Rotamers功能将第702位的丙氨酸替换为缬氨酸，从而构建A702V突变体。
    注意：综合而言，分别为ΔELREA和A702V突变研究准备了六个单体和两个二聚体EGFR结构。每个结构随后均使用Maestro程序中的蛋白预处理向导31进行处理，并采用Amber程序32进行分子动力学模拟。
  4. 在Maestro中使用File → import structure选项打开结构。然后点击protein preparation wizard按钮，并依次执行以下操作：添加氢原子、构建缺失的侧链原子、使用PROPKA在pH 7.0条件下确定可电离残基的质子化状态、优化天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸残基的取向以形成氢键，最后对结构进行能量最小化。

2. 系统设置

  1. 打开 Amber 软件包中包含的 leap 程序。导入 ff14SB 力场33（source leaprc.protein.ff14SB）和 TIP3P 水分子34（source leaprc.water.tip3p）。对于 ATP 结合体系，还需导入 ATP 的参数35（loadamberparams frcmod.phosphate, loadamberprep ATP.prep）。然后加载结构（mol = loadpdb structure.pdb）。
  2. 将结构溶剂化为一个正交八面体水盒，使用显式 TIP3P 水分子，水盒在蛋白质表面原子各个方向上延伸 10 Å（solvateoct mol TIP3PBOX 10.0）。
  3. 检查构建的体系（Check mol），并通过添加必要的离子进行中和（addions mol Na+ 0）。为了充分模拟生物分子体系，向模拟盒子中添加额外的 Na+/Cl- 原子，使体系盐浓度达到 0.15 M（addions mol Na+ X, addions mol Cl- X），其中 X 替换为以下计算结果：目标盐浓度 × 水分子数 × 每个水分子所占体积 × 阿伏伽德罗常数。
  4. 生成并保存体系的拓扑结构文件和坐标文件，这些文件将作为后续生产模拟的输入（saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd）。

3. 分子动力学模拟

  1. 使用 Amber 软件，首先对模拟体系进行 5000 个循环的最陡下降法和共轭梯度能量最小化，以避免出现不利的构型。将最小化过程分为多个步骤，逐步将溶质原子所受的限制力从 25 kcal mol-1 Å-2 降低至 0 kcal mol-1 Å-2。
    1. 在最小化输入文件 min.in 中，调整 maxcyc 变量以设定总最小化循环次数（maxcyc = 5000），并使用 ncyc 指定最陡下降算法的循环次数。利用 restraint_wt 变量对由 restraintmask 参数指定的溶质原子施加限制力。然后按以下命令运行最小化程序：
      $AMBERHOME/bin/sander -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd
      注：所采用的策略和具体参数可根据个人偏好进行调整。更多细节和指导信息可参考 Amber 手册及官方网站（https://ambermd.org/index.php）
  2. 将体系从 0 K 加热至 300 K，持续 100 ps，同时对溶质原子施加 10 kcal mol-1 Å-2 的限制力。为此，在 heat.in 输入文件中设置 tempi = 0.0、temp0 = 300.0、dt = 0.002 ps、nstlim = 50000 以及 restraint_wt = 10。使用以下命令执行加热过程：
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
  3. 在 NPT 系综下对体系进行 900 ps 的平衡，保持原子数、温度（temp0 = 300.0）和压力（ntp = 1）恒定，并采用 Berendsen 方法进行控温（ntt = 1）。对长程静电相互作用设置 9 Å 的截断距离（cut = 9.0）。逐步将溶质原子的限制力降低至 0.1 kcal mol-1 Å-2（restraint_wt = 0.1）。运行包含上述参数设置的平衡输入文件 equil.in，命令如下：
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst
  4. 通过一次无限制的 5 ns 模拟完成最终平衡（设置 dt = 0.002 ps，ntslim = 2500000）。
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
  5. 通过检查温度、压力、密度和能量数值，确认体系是否已达到平衡状态。
    $AMBERHOME/bin/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out
    xmgrace summary.TEMP/DENSITY/ETOT/EPTOT/EKTOT
  6. 执行 100 ns 的生产模拟（在 prod.in 中设置 dt = 0.002 ps，ntslim = 50000000），并每 10 ps 保存一次构象（ntwx = 5000）。
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst

4. 分析

  1. 目视检查
    1. 通过在 VMD36 中打开 X.prmtop AMBER 拓扑文件和相应的 prod.mdcrd 轨迹文件，可视化野生型和突变型 EGFR 激酶模拟过程中采样的构象。使用合适的二级结构表示方式，分析轨迹记录中蛋白质的整体结构动力学。观察特定原子/残基之间的相互作用，例如催化必需的 K745 与 E762 之间的盐桥。
    2. 或者，将模拟过程中采样的多个构象以 PDB 格式保存，并使用 Chimera 程序打开。使用 MatchMaker 选项将这些结构与初始或中位结构叠加。将初始/中位结构以实心显示，其余对齐的结构以半透明白色显示。该方法可更清晰地展示记录的结构变化。
      注意：有关从分子动力学模拟（MDS）中有效表示和处理构象集合的建议，可参见 Melvin 等人37 的研究。
  2. RMSD 与 RMSF 分析
    1. 使用 Cpptraj 程序38 计算均方根偏差（RMSD）和均方根涨落（RMSF），以分析蛋白质的整体稳定性并考察不同结构单元的柔性。在 rmsd.in 和 rmsf.in 输入文件中，分别指定初始结构的主链原子（用于 RMSD）和 Cα 原子（用于 RMSF）作为 RMS 拟合的参考结构。在 rmsd/rmsf.in 文件中导入 AMBER 拓扑文件（parm X.prmtop）和相应的轨迹文件（trajin prod.mdcrd）。然后运行命令 Cpptraj -i rmsd/rmsf.in，并绘制输出数据以进行分析。
    2. 或者，对构象集合进行对齐，并根据各残基 Cα 原子的 RMSD 值进行着色。具体操作为：在 Chimera 中打开构象，并使用 Matchmaker 选项进行对齐。
      1. 进入 Tools → Depiction → Render by attribute。选择构象集合中的 Residues，并将属性设为 Cα RMSD，点击 OK。构象的链轨迹将按蓝色 → 白色 → 红色着色，分别反映结构稳定性高、中、低的区域。
  3. 氢键分析
    1. 分析 ATP 与野生型及 ΔELREA 突变型 EGFR 之间的氢键相互作用。编写 Cpptraj 脚本 hbond.in 以完成此任务。定义氢键的条件为：供体-受体距离小于或等于 3.5 Å，键角大于或等于 135°。仅分析分子间氢键（即 ATP 与 EGFR 之间的氢键），使用 nointramol 变量（例如：hbond All nointramol dist 3.5 out nhb.agr avgout avghb.dat）。运行脚本命令为：Cpptraj -i hbond.in。
    2. 使用该脚本评估分子内相互作用，例如关键残基 K745 与 E762 之间的相互作用。为此，在 hbond.in 中指定 K745 为氢键供体，E762 为氢键受体，并相应运行脚本。
  4. 监测原子间距离
    1. 通过在 VMD 中打开野生型和 ΔELREA 型无配体 EGFR 的轨迹，测量 K745 与 E762 之间的距离。点击 Mouse → label → bond，选择 Glu762 的 Cδ 原子和 Lys745 的 Nz 原子。通过 graphics → labels → bond → graph 绘制图表，监测模拟过程中的距离变化。
  5. 自由能计算
    1. 为计算 ATP 与野生型/ΔELREA EGFR 之间的估计结合自由能，以及野生型/A702V EGFR 中激活激酶与受体激酶之间的结合自由能，使用 AMBER 软件包中提供的分子力学广义玻恩表面积（MM-GBSA）模块39。在 ΔELREA 研究中，将 ATP 设为配体，EGFR 设为受体；在 A702V 研究中，将受体激酶设为配体，激活激酶设为受体。
    2. 首先在 leap 程序中分别准备配体、受体及配体-受体复合物的 PDB 文件，并将 PBRadii 参数设为 mbondi2。对每个 PDB 文件，保存其气相 AMBER 拓扑文件（.prmtop）和坐标文件（.inpcrd）。
    3. 然后，在 mmgbsa 输入文件 mmgbsa.in 中设置 igb = 2、saltcon = 0.1。使用模拟轨迹、已准备的受体/配体 AMBER 文件以及 mmgbsa.in 中的参数，通过 Amber 提供的 MMPBSA.py 脚本执行结合能计算，命令如下：
      $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv
    4. 通过绘制图表分析输出数据文件 output.csv。

结果

本研究采用所述方案，探究ΔELREA和A702V突变对EGFR激酶结构的构效影响。该方案的一个应用是通过分子动力学（MD）模拟计算均方根偏差（RMSD）和均方根涨落（RMSF）值，分析这些突变对局部结构/构象稳定性的影响。由于A702V突变位于近膜区B段，因此分别计算了野生型和A702V型EGFR中受体激酶该区段相对于初始结构的RMSD。结果（图4A）显示，在100 ns的模拟过程中，突变体的近膜区B段构象稳定性较野生型EGFR激酶结构域更高（突变体平均RMSD为0.7 Å，95%置信区间（CI）为0.009；野生型平均RMSD为1.1 Å，95% CI为0.01）。这一现象极有可能是由于702位点的丙氨酸（侧链为甲基）被体积更大的疏水性缬氨酸（侧链为异丙基）取代，增强了二聚体界面处的疏水相互作用，从而使受体激酶结构域中的V702与激活剂激酶结构域中的异亮氨酸941之间的疏水作用增强所致。

ΔELREA 突变位于 β3-αC 环区，紧邻功能上至关重要的 αC 螺旋；αC 螺旋的构象对于 EGFR 激酶在活性与非活性状态之间的转换至关重要。通过分子动力学模拟中分析该螺旋区域内残基的 Cα 原子的 RMSF，评估了活性状态下 αC 螺旋的构象稳定性（图 4B）：总体而言，与野生型（平均 RMSF 为 1.5 Å - 95% 置信区间 0.57）相比，突变体的波动更小（平均 RMSF 为 1.1 Å - 95% 置信区间 0.4），其中 N 末端残基的波动差异最为显著。采样的构象分别与野生型激酶结构域和 ΔELREA 激酶结构域的中位结构叠加的结果也支持上述结论（图 4C）：野生型和 ΔELREA 激酶结构域在叠加构象的整体稳定性上相似，但 β3-αC 环区和 αC 螺旋在 ΔELREA EGFR 中明显更稳定。这些结果表明，ELREA 序列的缺失限制了活性状态 αC 螺旋的运动，从而限制并稳定了其活性构象。此外，由于 αC 螺旋构成了不对称二聚体界面的一部分，突变体中对 αC 螺旋的限制极有可能稳定不对称二聚体，延长激活状态的持续时间。

该方案的另一个应用是研究模拟过程中发生的关键分子内和分子间相互作用的行为。因此，针对在EGFR酶活性中起关键作用的K745与E762之间的相互作用，通过测量分子动力学模拟过程中这两个残基侧链极性原子之间形成的氢键的占据百分比，对活性状态的野生型和ΔELREA突变型EGFR激酶进行了分析（图5A）：由于更稳定的αC螺旋有利于E762的定位，该关键的静电相互作用在ΔELREA激酶结构域中比在野生型激酶结构域中更频繁地形成。此外，还评估了Mg2+-ATP与野生型及ΔELREA EGFR激酶结构域在模拟过程中的相互作用（图5B）（图5C）：ΔELREA突变型的氢键数量（平均值4.0 - 95%置信区间0.03）高于野生型EGFR（平均值3.2 - 95%置信区间0.04）。进一步的氢键分析显示，在ΔELREA EGFR中，K745与ATP的磷酸基团之间的相互作用更为频繁，这与ΔELREA突变型EGFR激酶结构域模拟中观察到的更稳定的K745-E762相互作用相关。

如本方案所述，分子动力学（MD）模拟还可用于评估蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体相互作用的相对结合自由能。通过分子力学广义玻恩表面积（MMGBSA）计算，获得了野生型和A702V突变型EGFR中激活域与接收域激酶之间的结合能，以及ATP与野生型和ΔELREA突变型EGFR激酶域之间的结合能（图6A）：A702V突变型的平均ΔGbind值更低（平均ΔGbind = -76 kcal/mol - 95% CI 0.47），表明其二聚体相互作用更有利，而野生型EGFR结构域的平均ΔGbind为-61 kcal/mol - 95% CI 0.61。该结果与A702V突变型EGFR激酶结构域中更稳定的近膜B段及更紧密的二聚体界面一致，这是由于疏水相互作用增强所致。在ATP与野生型及ΔELREA突变型EGFR激酶结构域结合的情况下（图6B），MMGBSA计算预测ΔELREA突变型对ATP的结合更强（平均ΔGbind -57 kcal/mol - 95% CI 0.43），相较于野生型EGFR（平均ΔGbind -48 kcal/mol - 95% CI 0.33）。这一结果与ΔELREA突变型EGFR与ATP之间形成的氢键数量多于野生型结构域的现象相符（图5C）。

该方案还可用于研究模拟过程中观察到的构象变化。在本研究中，通过目视检查和叠加模拟中采样的构象，分析了ΔELREA突变对无活性EGFR构象的影响。分析发现，ΔELREA突变型EGFR激酶结构域中的αC螺旋出现向内移动（图7A），这一结构变化符合向激活状态转变过程中的预期。相比之下，野生型无活性EGFR的αC螺旋则保持其初始构象（图7B）。因此，分子动力学模拟支持如下观点：该缺失突变可促进激酶结构从无活性状态向活性状态发生构象转变，此前实验已证实该突变可增强激酶活性40,41。

EGFR蛋白动力学；RMSD、RMSF图谱；结构分析；蛋白质建模；稳定性比较
图4：MD模拟过程中野生型与突变型活性EGFR激酶结构域的构象稳定性。 (A) 野生型（蓝色）和A702V突变型（红色）受体激酶结构域近膜B段主链原子的RMSD。B) αC 螺旋残基的 RMSF（Cα 原子）：野生型（蓝色）和 ΔELREA（金色）。(C野生型（左）和ΔELREA突变型（右）EGFR激酶结构域的叠加采样构象；链轨迹根据每个残基相对于中位结构的Cα原子RMSD进行着色。颜色从蓝色经白色到红色，代表构象稳定性由高到低的区域。需要注意的是，在完整EGFR结构中，被着色为红色的孤立激酶结构域的“游离”N端区域不会表现出如此高的灵活性。图示改编自Chakroborty等人的研究。9 (图 4A 经版权所有者许可复制 生物化学杂志）以及 Tamirat 等人12. 请点击此处以查看此图的放大版本。

EGFR 相互作用分析：占有率柱状图、分子结构图、蛋白质研究中的氢键图
图 5：在分子动力学模拟中观察到的活性受体激酶的关键特征：K745-E762 盐桥、αC 螺旋以及与 ATP 的相互作用。（A）在野生型（蓝色）和 ΔELREA（金色）EGFR 激酶结构域的模拟过程中，K745-E762 相互作用的占有率百分比。（B）与 ATP（棍状表示）相互作用的野生型和 ΔELREA 突变体残基。Mg2+（绿色）与 ATP 和 D855 配位。（C）在分子动力学模拟过程中，ATP 与野生型及 ΔELREA EGFR 激酶结构域之间形成的氢键数量。图源自 Tamirat 等人12。请点击此处查看该图的放大版本。

EGFR结合自由能图，ΔG_bind 与时间关系，野生型/变体比较，kcal/mol，ns。
图6：在模拟过程中，突变型激酶结构域表现出较低的相对结合自由能。 (A) 计算得到的野生型（蓝色）和A702V突变型（红色）EGFR激活域与接收域激酶之间相互作用的结合能。B) ΔG结合 ATP与野生型（蓝色）和ΔELREA（金色）EGFR激酶结构域的结合。图示改编自Chakroborty等人的研究。9 (图 6A 经版权所有者许可复制 生物化学杂志）以及 Tamirat 等人12. 请点击此处以查看此图的放大版本。

EGFR 螺旋结构示意图；野生型与 ΔELREA 突变型；蛋白质折叠分析。
图 7：野生型与 ΔELREA 突变型非活性 EGFR 激酶结构域的叠加构象。 αC 螺旋和 A 环螺旋的构象，分别为（A）野生型（蓝色表示中位结构）和（B）ΔELREA EGFR（金色）。其他采样构象以浅白色显示；MD 模拟前的初始结构为粉色。图源自 Tamirat 等12。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究中描述的实验方案侧重于利用分子动力学模拟，研究由EGFR激酶结构域激活型体细胞突变引起的局部和全局结构变化。尽管野生型和突变型EGFR的X射线晶体结构提供了宝贵的结构信息，但它们仅呈现了一种或少数几种静态构象。然而，ErbB家族生物学功能的本质在于其必须在酶失活态与活性酪氨酸激酶态之间发生转变，这一过程伴随着激酶单体结构及分子内相互作用的动态变化。因此，我们开展了分子动力学（MD）模拟，以探究EGFR酪氨酸激酶结构域的动态特性，包括野生型结构、引入的ΔELREA缺失突变以及A702V突变。这些模拟成功揭示了这些突变在结构中可能发挥的作用，以及它们对酪氨酸激酶结构域构象的影响如何导致实验中观察到的EGFR激酶活性升高。

本方案中的一个关键步骤是使用相关结构来评估突变的影响。选择合适模拟输入结构的一种方法是，在静态三维结构中可视化突变的位置，并结合邻近的氨基酸和结构单元，分析其可能产生的影响。例如，在本研究中，由于A702V EGFR突变位于形成不对称二聚体界面的近膜B区段，因此使用二聚体结构而非单体结构进行模拟至关重要。若使用单体结构，受体激酶的近膜B区段将暴露于溶剂中，从而失去由突变带来的稳定化作用——即突变为更大的疏水性残基，并与激活激酶C叶结构域中的异亮氨酸941（isoleucine 941）发生相互作用。此外值得注意的是，PDB文件中的坐标所表示的三维结构并不一定对应于适合研究的生物学相关结构。例如，ErbB4的结构（PDB编号3BCE）在PDB中呈现为三聚体，但这实际上是晶体堆积所致（可视化该结构时可观察到单体之间仅有少量接触）。可利用PDB文件中的矩阵信息（例如在Chimera中）重建晶体学相关的结构，进而通过可视化判断哪些链对应于原始文献中报道的生物学相关三维结构42。本方案的另一个关键步骤是正确准备模拟所需的输入结构，例如在不同环状区域中构建缺失的氨基酸，尤其是位于突变位点附近的区域。尽管PDB中存在大量野生型EGFR结构，但可用的突变型EGFR结构却十分有限。因此，突变体结构也需要建模；对于A702V这类单残基突变，使用Chimera进行残基突变；而对于ΔELREA缺失突变，则采用Modeller进行建模。

模拟输入文件中使用的各种参数——例如最小化循环次数、将体系一次性加热至目标温度还是通过多个中间温度逐步缓慢加热、平衡阶段和生产模拟阶段的时间长度——均可根据所研究的分子、研究目的以及个人偏好进行调整。在进行分子动力学（MD）模拟过程中，常常会遇到由输入文件引起的问题、与所用模拟软件相关的问题，甚至用户操作错误。因此，通过仔细检查错误信息以理解错误来源至关重要。大多数模拟程序都设有邮件列表，用户可通过该平台向软件开发者及其他用户提问，从而解决大部分问题。此外，用户手册在理解模拟方案的细节（包括其假设和局限性）方面提供了重要帮助。尽管MD模拟是研究分子动态性质的重要工具，但需谨记：计算结果必须结合其他信息来源进行审慎评估，以判断其有效性。在条件允许的情况下，应与所研究蛋白质领域的专家研究人员合作，尤其是在有相关湿实验研究的情况下，这些实验不仅有助于结构解析，还可基于结构观察提出新的实验设计，用于验证假设。

本研究中，该方案在探究ΔELREA和A702V突变对EGFR激酶结构动态影响方面具有有效性。模拟结果显示，ΔELREA可限制功能上至关重要的αC螺旋，并促进激酶从非活性构象向稳定活性构象的转变。该模拟结果得到了药物反应数据的独立支持：在携带ΔELREA缺失突变和野生型EGFR的肺癌细胞系中，针对识别活性激酶构象的酪氨酸激酶抑制剂表现出更强的抑制作用，且ΔELREA突变体的抑制效果强于野生型EGFR。12A702V突变的分子动力学模拟显示，与野生型相比，该突变可增强激酶激活域与接收域之间的界面稳定性，并提高两者间的相互亲和力，共同支持EGFR激酶维持在激活构象状态。位于接收激酶近膜B区段的A702V突变可通过增强与激活激酶之间的疏水相互作用，延长激酶激活状态的持续时间。A702V突变可支持细胞存活 缺失 生长因子的筛选，并通过体外EGFR突变筛选实验被鉴定9.

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由芬兰科学院（308317，320005）向 M.S.J. 提供的资助、西格丽德·尤塞柳斯基金会以及托尔、乔和彭蒂·博格纪念基金，以及由芬兰科学院（274728，316796）、芬兰癌症基金会和图尔库大学中心医院向 K.E. 提供的资助支持。M.Z.T. 由 Å感谢奥博学术大学信息与结构生物学博士网络。我们感谢芬兰科学计算中心（CSC IT Center for Science）提供的计算资源，以及在芬兰生物信息学网络（Biocenter Finland bioinformatics network）框架下，尤卡·莱赫托宁博士（Dr. Jukka Lehtonen）提供的信息技术支持；同时感谢芬兰生物中心（Biocenter Finland）结构生物学基础设施网络。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Amber 软件加利福尼亚大学旧金山分校版本 2018可执行程序
Chimera 程序加利福尼亚大学旧金山分校生物计算、可视化与信息学资源中心版本 1.13.1可执行程序
EGFR 结构文件蛋白质数据库（The Protein Data Bank）EGFR 结构的三维坐标
MaestroSchrödinger LLC版本 2018-3可执行程序
Modeller 程序加利福尼亚大学旧金山分校生物制药科学与药物化学系，Andrej Šali 实验室包含在 Chimera 程序中
VMD 软件伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校理论与计算生物物理学组版本 1.9.3可执行程序

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