本方案描述了一种动态培养系统，用于在化学成分明确且无饲养层的条件下，利用一次性生物反应器生成尺寸可控的人多能干细胞聚集体，并进一步诱导其向小脑类器官分化。
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本文内容
摘要
摘要
小脑在维持平衡和运动协调方面发挥着关键作用，不同小脑神经元的功能缺陷可引发小脑功能障碍。目前关于疾病相关神经元表型的大多数知识均基于死后组织样本，这使得对疾病进展和发展过程的理解变得困难。动物模型和永生化细胞系也已被用作神经退行性疾病的模型，但它们并不能完全模拟人类疾病。人诱导性多能干细胞（iPSCs）在疾病建模方面具有巨大潜力，并为再生医学策略提供了宝贵的细胞来源。近年来，利用患者来源的iPSCs生成脑类器官的技术改善了神经退行性疾病建模的前景。然而，目前仍缺乏能够在三维培养系统中高效生成大量类器官和高产量成熟神经元的实验方案。本文介绍的方案是一种在化学成分明确的条件下，利用可放大的一次性生物反应器，可重复且可规模化地生成具有小脑特征的人iPSC来源类器官的新方法。所生成的类器官在mRNA和蛋白质水平均表达特定的标志物。通过对特定蛋白群组的分析，可识别出不同的小脑细胞群体，其定位对于评估类器官结构至关重要。通过类器官冷冻切片及后续对切片进行免疫染色，用于评估特定小脑细胞群体的存在及其空间组织结构。
引言
人类多能干细胞（PSCs）的出现为再生医学和疾病建模提供了极佳的工具，因为这些细胞可以分化为人体大多数细胞谱系1,2。自发现以来，已有多种方法被用于诱导PSC分化，以模拟包括神经退行性疾病在内的多种疾病3,4,5,6。
最近有研究报告称，由多能干细胞（PSCs）衍生的三维培养物可模拟人类脑部结构，这类结构被称为脑类器官3,7,8。利用健康个体及患者特异性PSCs生成这些结构，为研究人类发育过程及神经发育障碍提供了宝贵的机会。然而，目前用于生成这些高度有序脑结构的方法难以实现大规模生产。为了获得足够大且内部不发生坏死、能够模拟组织形态发生的类器官，现有方案通常依赖于在静态条件下启动神经定向分化，随后将细胞包埋于水凝胶中，并在动态培养系统中继续培养3。然而，此类方法可能限制了类器....
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方案
1. 人iPSC在单层培养中的传代与维持
- 培养板的制备
- 在 4 °C 下解冻基底膜基质（见材料表）原液，并分装为每份 60 μL。将分装样品在 -20 °C 冻存。
- 为包被 6 孔板的孔，将一份基底膜基质在冰上解冻。解冻后，将 60 µL 基质加入 6 mL DMEM-F12 培养基中，通过上下轻柔吹打使其充分重悬。
- 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 稀释后的基底膜基质溶液，在传代前于室温（RT）孵育至少 1 小时，或在 4 °C 保存最多 1 周。
- 使用 EDTA 传代 iPSC 克隆
- 将 iPSC 细胞在 6 孔板中以单层培养方式维持于 37 °C、95% 湿度、5% CO2 的培养箱中。
注意：本实验方案中使用了三种不同的人源 iPSC 细胞系：F002.1A.1321、人源表观遗传 iPSC 细胞系（iPSC6.2）22，以及商业获取的 iPS-DF6-9-9T.B（见材料表）。 - 传代前，将已储存的包被板（步骤 1.1）在室温（RT）放置 15 分钟，并准备 mTeSR1 培养基（表 1）。 <....
- 将 iPSC 细胞在 6 孔板中以单层培养方式维持于 37 °C、95% 湿度、5% CO2 的培养箱中。
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结果
通过使用0.1 L生物反应器促进细胞聚集来启动该实验方案（图1A）。以单细胞接种方式将iPSCs接种，接种密度为250,000个细胞/mL，培养体积为60 mL，搅拌速度为27 rpm。此时间点定义为第0天。24小时后，细胞高效地形成了球状聚集体（第1天，图1B），聚集体形态在第5天之前保持良好，并随着时间推移逐渐增大，表现出聚集体形态和大小的高度均一性（图1B）。显微镜下的定量分析也显示，第1天时聚集体大小呈正态分布（图1C）。聚集体大小是一个重要的物理参数，能够促使细胞向不同谱系分化29,30。因此，基于既往研究中报道的可有效诱导神经31,32和小脑分化
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讨论
为了满足药物筛选和再生医学应用中对特定细胞类型的大规模细胞数量及明确培养条件的需求，可扩展的培养系统开发正不断推进。近年来，多个研究团队已报道了可扩展地生成神经前体细胞和功能性神经元32,33,34，这为神经退行性疾病新模型的建立带来了显著进展。然而，胚胎发育过程中某些关键事件的重现仍未能实现，且在悬浮培养条件下长期维持所获得的功能性神经元也尚未实现34。本文介绍了一种动态三维培养系统，可在化学成分明确且无饲养层的动态培养条件下，生成具有小脑特征的诱导多能干细胞（iPSC）来源神经类器官，并进一步促进其成熟为功能性小脑神经元。
在开始小脑分化之前，维持人iPSCs的质量至关重要。因此，为避免影响分化效果，从解冻到生物反应器接种期间，iPSCs的传代次数不应超过三次。分化方案中的一个重要步骤是评估细胞聚集体的大小。聚集体大小在诱导向特定细胞谱系分化过程.......
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披露
作者YH和SJ是PBS Biotech的员工。作者BL是PBS Biotech, Inc.的首席执行官兼联合创始人。这些合作作者参与了本论文所用生物反应器的开发。这并不影响作者遵守期刊在数据和材料共享方面的所有政策。其他所有作者均声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT）资助（通过里斯本2020运营计划，项目编号：UIDB/04565/2020，授予T.P.S.的项目PD/BD/105773/2014及授予D.E.S.N.的项目PD/BD/128376/2017），以及由欧洲区域发展基金（FEDER）和FCT共同资助的项目（POR Lisboa 2020—里斯本区域运营计划 葡萄牙2020），包括资助号PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394和CEREBEX小脑类器官生成用于共济失调研究项目LISBOA-01-0145-FEDER-029298。此外，还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的支持，资助协议号为739572——再生与精准医学发现中心H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3MM 滤纸 | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | 细胞解离液 |
| 抗 BARHL1 抗体 | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| 抗 Calbindin D-28k 抗体 | CB28 | Millipore | |
| 抗 MAP2 抗体 | M4403 | Sigma | |
| 抗 N-钙黏蛋白抗体 | 610921 | BD Transduction | |
| 抗 NESTIN 抗体 | MAB1259-SP | R&D | |
| 抗 OLIG2 抗体 | MABN50 | Millipore | |
| 抗 PAX6 抗体 | PRB-278P | Covance | |
| 抗 SOX2 抗体 | MAB2018 | R&D | |
| 抗 TBR1 抗体 | AB2261 | Millipore | |
| 抗 TBR2 抗体 | ab183991 | Abcam | |
| 抗 TUJ1 抗体 | 801213 | Biolegend | |
| 无转铁蛋白 | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys 神经元培养基 N2-A & SM1 试剂盒 | 5793 - 500mL | Stem cell technologies | |
| 化学成分明确的脂质浓缩液 | 11905031 | ThermoFisher | |
| 盖玻片 24×60 mm | 631-1575 | VWR | |
| 结晶纯化牛血清白蛋白 | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| 二丁酰环磷酸腺苷 | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| 胎牛血清 | A3840001 | ThermoFisher | |
| 牛皮来源明胶 | G9391 | Sigma | |
| 玻璃染色缸 | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| 甘氨酸 | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| 人表观遗传重编程诱导多能干细胞系 | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| 胰岛素 | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| 异戊烷 | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-抗坏血酸 | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | 基底膜基质 |
| 巯基甘油 | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | 封片剂 |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 添加剂 | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal 培养基 | 12348017 | ThermoFisher | |
| 多聚甲醛 | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 一次性使用反应器 | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive 基础单元 | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| 重组人 BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| 重组人 bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| 重组人 FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| 重组人 GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| 重组人 SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK 抑制剂 Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| 蔗糖 | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost 显微镜载玻片 | 12372098 | ThermoFisher | 防脱显微镜载玻片 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | 25608-930 | VWR | |
| 1M Tris-HCl | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
参考文献
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
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