初级纤毛是与中心粒相关的胞外结构。通过免疫荧光染色检测初级纤毛是一种相对简单的实验方法，可获得极高分辨率的图像。本实验方案中，表达初级纤毛的成纤维细胞经固定、免疫染色后，使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行成像。
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摘要
摘要
初级纤毛在细胞周期进程中受到动态调控，特别是在细胞周期的G0/G1期形成，并在有丝分裂前被吸收。初级纤毛可通过高精度方法进行观察，包括透射电子显微镜、三维成像，或使用软件对初级纤毛进行自动检测。然而，这些方法的实施需要对初级纤毛进行免疫荧光染色。本文介绍了一种通过染色乙酰化α微管蛋白（轴丝）和γ微管蛋白（基体）来简便检测体外初级纤毛的实验方案。该免疫荧光染色方案相对简单，且可获得高质量的图像。本方案详细描述了四种表达初级纤毛的细胞系（C2C12、MEF、NHLF和皮肤成纤维细胞）的固定、免疫染色及荧光显微镜或共聚焦显微镜成像过程。
引言
初级纤毛是与细胞母中心粒相关的、感觉性的、单根的、膜包裹的、非运动性结构。除红细胞、脂肪细胞1和肝细胞2外，大多数脊椎动物细胞上均存在初级纤毛。初级纤毛由微管构成的细长轴丝组成，其主要成分为α-微管蛋白。轴丝从基体延伸而出，基体则由γ-微管蛋白构成。初级纤毛的长度通常为2–10 µm；然而，在糖基化、饥饿、缺氧、细胞毒性应激或暴露于电离辐射后，其尺寸可能发生改变3,4,5,6,7。通常情况下，每个细胞仅具有一根初级纤毛，该结构参与形态发生以及对细胞增殖和分化至关重要的细胞信号通路8,9。
初级纤毛在细胞周期进程中受到动态调控，特别是在G0/G1期，并在进入有丝分裂前被吸收，该过程与HDAC6（组蛋白去乙酰化酶6）介导的微管蛋白去乙酰化相关10。初级纤毛吸收的具体时间取决于细胞类型以及直接参与该过程的基因表达，例如 Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13。根据不同细胞类型，初级纤毛表达不同类型的受体、离子通道以及活性信号通路。其中包括影响细胞增殖和存活的最重要信号受体EGFR、PDGFR和FGFR。此外还包括可能影响一个或多个器官功能的信号通路，如Hedgehog、Notch和Wnt通路。由于这些受体和信号通路的存在，初级纤毛还具有化学感受功能。该功能使初级纤毛能够检测Notch的特异性配体、激素以及5-羟色胺或生长抑素等生物活性物质。不同长度的初级纤毛还表现出其他特定功能，包括对温度、重力和渗透压变化的反应14。
初级纤毛可通过多种方法进行观察，例如活细胞成像、透射电子显微镜、三维成像，或使用软件对初级纤毛进行自动检测5,15,16,17。然而，这些方法技术要求较高，而当前持续的研究需要在各个研究阶段都具备基础、快速且简便的初级纤毛染色方法。本文介绍了一种在培养细胞中检测初级纤毛的简便且实用的方法。
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方案
1. 培养基、溶液和培养皿的准备
- 将盖玻片（22 × 22 mm）进行高压灭菌。准备6孔板。解冻胎牛血清（FBS）和抗生素青霉素/链霉素，将培养基平衡至室温（RT）。使用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和1× PBS（含钙和镁的磷酸盐缓冲液）传代细胞。
- 用去离子水（dH2O）新鲜配制4%多聚甲醛（PFA）溶液（800 mg PFA溶于20 mL dH2O中）。每次实验均需新鲜配制PFA溶液。在通风橱内于55 °C下搅拌并加热溶液30分钟。冷却至室温。逐滴加入1 M氢氧化钠，直至溶液变澄清（pH = 7.2–7.4）。4 °C保存，最多可保存1周。
注意：PFA具有毒性，操作时务必穿戴适当的个人防护装备，并在化学通风橱中配制。 - 配制500 mL含10% FBS、1%青霉素/链霉素和2%谷氨酰胺的DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）。
- 在无菌去离子水（dH2O）中配制13 mL 1%明胶溶液（130 mg明胶溶于13 mL dH2O中）。每孔6孔板使用2 mL 1%明胶溶液。保持无菌状态。
- 使用70%乙醇清洁超净工作台。实验开始前，将所需材料放入超净工作台内。
2. 免疫细胞化学染色的细胞培养
- 使用标准技术复苏细胞（本研究中为 C2C12、MEF、NHLF 和皮肤成纤维细胞），并将细胞接种于含有约 10–12 mL 预配培养基的 T75 培养瓶中。在 37 °C、5% CO2、90% 相对湿度（RH）条件下培养，直至细胞融合度达到 70%。
- 将培养瓶从培养箱中取出，置于超净工作台内。吸去培养基，用 1× PBS 轻柔冲洗细胞 2 次。向 T75 培养瓶中加入约 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育约 5 分钟。定期在倒置显微镜下观察，以监测细胞脱落情况。
注意：孵育时间取决于细胞系，需通过实验经验确定。 - 用 10 mL 培养基轻柔重悬细胞，小心吹打以形成单细胞悬液。如有必要，再次冲洗培养瓶。
- 将细胞悬液转移至 50 mL 圆底离心管中，在约 200 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，加入 10 mL 培养基，轻柔重悬细胞沉淀。取 20 µL 细胞悬液，与台盼蓝按 1:1 比例混合，按照标准方法在细胞计数仪中进行计数。
- 用镊子将盖玻片放入 6 孔板的每个孔中。向孔内加入约 2 mL 明胶溶液以包被盖玻片，有助于细胞贴附。随后吸去明胶溶液，室温下静置数分钟使其自然干燥。此时盖玻片已准备好用于细胞培养，请立即开始接种。
- 每孔接种 100,000 个成纤维细胞，并加入 2 mL 培养基。在 37 °C、5% CO2、90% RH 条件下培养 24 小时。此后可根据实验需求对细胞进行相应处理。诱导纤毛形成的处理方法已有文献报道4,5。
注意：初始接种数量应根据细胞的倍增时间确定，需相应调整。
3. 体外原代纤毛的免疫荧光染色
- 将4%多聚甲醛预热至室温。准备巴斯德吸管、1× PBS（室温）、废液容器、15 mL锥形管、微量移液器（0.5–10 µL、20–200 µL 和 100–1,000 µL）及吸头。从培养箱中取出细胞，置于实验台面上。
注意：染色过程无需无菌条件。所有溶液必须处于室温。 - 吸去每孔中的培养基，将盖玻片保留在孔内。用2 mL 1× PBS 轻柔洗涤细胞3次。使用巴斯德吸管向每孔加入2 mL 4% PFA以固定细胞，在室温下孵育10分钟。吸去PFA后，用1× PBS 洗涤3次。
注意：在孵育期间，始终使用足量液体完全覆盖盖玻片。切勿让细胞干燥。切勿将任何溶液直接倾倒于盖玻片上。 - 在使用前10分钟，用13 mL 1× PBS 配制0.5% Triton X-100。向每孔加入2 mL，孵育15分钟，然后用1× PBS 轻柔洗涤4次。
注意：Triton X-100在室温PBS中不溶。需将0.5% Triton X-100溶液置于37 °C水浴中加热以使其溶解。 - 在使用前5分钟解冻山羊血清。按1:20比例将山羊血清稀释于1× PBS中作为封闭液。每张盖玻片加入150 µL，室温孵育20分钟。
注意：如有需要，可将封闭时间延长至60分钟。用山羊血清封闭后无需洗涤细胞。 - 在使用前5分钟解冻一抗（如抗乙酰化α微管蛋白抗体和抗γ微管蛋白抗体）。将抗体分别按以下比例稀释于1× PBS中：小鼠抗乙酰化α微管蛋白抗体按1:800稀释，兔抗γ微管蛋白抗体按1:300稀释。吸去封闭液，不进行洗涤，向每张盖玻片加入150 µL两种抗体稀释液，室温孵育60分钟。
注意：若需过夜孵育，使用500–1,000 µL一抗溶液，用封口膜密封6孔板，并于4 °C保存。或者，使用150 µL抗体，在湿盒中孵育。 - 吸去一抗溶液，用2 mL 1× PBS 轻柔洗涤盖玻片3次。将二抗分别按1:300比例稀释于1× PBS中，包括Cy3标记的羊抗小鼠抗体和Alexa Fluor488标记的羊抗兔抗体。向每张盖玻片加入150 µL两种二抗稀释液，在避光条件下室温孵育45分钟。
注意：需避光孵育以防止荧光淬灭。可根据需要使用其他组合的二抗。 - 根据制造商说明配制DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液。多余分装液储存于-20 °C。取10 µL 储存液（1:5,000）稀释于50 mL 1× PBS中。向盖玻片加入2 mL该稀释液，在避光条件下室温孵育5分钟。
注意：为防止荧光淬灭，细胞必须避光孵育。DAPI稀释液可在4 °C保存最多1个月。 - 准备两根细针、载玻片、镊子和封片剂。对载玻片进行标记。
- 吸去各孔中的DAPI溶液，用1× PBS 洗涤3次。在每张载玻片上滴加一滴封片剂。用细针轻柔地将盖玻片从孔底抬起，用镊子将其翻转后轻轻置于封片剂液滴上，小心去除气泡。
- 将载玻片避光保存，在4 °C过夜。
- 使用高倍荧光显微镜或共聚焦显微镜观察初级纤毛。
注意：载玻片可在避光条件下于4 °C保存最多2个月。
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结果
初级纤毛的免疫荧光染色是一种相对简单的实验方法，可获得高质量的图像。在这些实验中，表达初级纤毛的成纤维细胞按照上述方案进行固定、免疫染色，并在荧光显微镜或共聚焦显微镜下成像。初级纤毛通过乙酰化α-微管蛋白和γ-微管蛋白进行检测。初级纤毛的评估可在多个层面上进行，任何相关变化均可与电离辐射暴露、细胞代谢（例如饥饿）或化学处理（例如细胞抑制剂）相关联5,18。
已研究电离辐射对多种细胞系（例如成肌细胞系 C2C12）中初级纤毛的影响，这些细胞系接受了不同剂量的辐射（2、6、10 和 20 Gy），并分析了初级纤毛发生率的变化。根据 Filipova 等人4的研究，低剂量辐射不会改变 C2C12 细胞中单个初级纤毛的出现频率。然而，较高剂量的电离辐射（即 20 Gy）会诱导多个初级纤毛的形成（图 1A,B,C）。类似地，当 NHLF...
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讨论
多位作者已描述了检测初级纤毛的各种方法，有时还介绍了可能影响其检测效果的不同固定方法6,20,21,22。然而，目前仍难以找到一套完整且简便的检测方案。若能便捷地获得此类方法，无疑将极大促进初级纤毛的研究，尤其在研究初期，或需要快速简便地验证特定细胞系中是否存在初级纤毛时尤为有用。因此，本方案尽可能详细地描述了在不同处理条件下体外检测初级纤毛的实验流程。
本方案已修改为可日常使用20,23,24。例如，用4%多聚甲醛（PFA）替代了10%福尔马林，由于PFA保存时间较短，建议新鲜配制。PFA在保持细胞形态方面效果良好，尤其适用于膜结合蛋白的可视...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由捷克共和国国防部—— 国防大学军事卫生科学学院大规模杀伤性武器医学问题长期机构发展计划、捷克共和国教育、青年与体育部（特定研究项目编号：SV/FVZ201703）以及PROGRES Q40/06资助。同时感谢Daniel Diaz在英文语言修订方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔板 | TPP | 92406 | 尺寸 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | 杰克逊免疫研究实验室 | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? 片段山羊抗兔 IgG |
| 抗微管蛋白 γ | Sigma-Aldrich | T5192 | 多克隆兔抗小鼠IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | 成肌细胞（小鼠） |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | 抗小鼠IgG（全分子）F(ab′)2 片段–Cy3 抗体（产自绵羊） |
| DAPI（4′6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 杜尔贝科´s 改良伊格尔´s 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11960044 | 高葡萄糖，无谷氨酰胺，Gibco |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D8662 | 含 MgCl2 和 CaCl2，经无菌过滤，适用于细胞培养 |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 16000044 | 无菌过滤，Gibco |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | ATCC | SCRC-1039 | 小鼠胚胎成纤维细胞 |
| 单克隆抗乙酰化微管蛋白 | Sigma-Aldrich | T7451 | 小鼠源单克隆抗乙酰化微管蛋白抗体 |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | 原代肺成纤维细胞（人） |
| 正常山羊血清 | 杰克逊免疫研究实验室 | 005-000-121 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127-500G | 粉末 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P0781 | 每毫升含10,000单位青霉素和10毫克链霉素的0.9% NaCl溶液，经无菌过滤 |
| ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | 赛默飞世尔科技 | P36961 | |
| 皮肤成纤维细胞 | 由赫拉德茨-克拉洛韦查理大学医学院惠赠á爱é. | ||
| 方形盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | 22X22-1.5 | 硼硅酸盐玻璃，22x22 mm，方形 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | 赛默飞世尔科技 | 25200072 | 无菌过滤，Gibco |
参考文献
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