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斑马鱼幼虫感染 曲霉属 用于宿主-病原体相互作用分析的孢子

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DOI：

10.3791/61165

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2020年5月16日

 , 
1Department of Biological Sciences, Clemson University

本文内容

摘要

本方案描述了一种在斑马鱼幼鱼中建立Aspergillus感染的模型。Aspergillus孢子被显微注射至幼鱼的后脑，通过化学处理诱导免疫抑制。利用每日成像系统监测感染进展，以观察真菌生长和免疫反应，并通过菌落形成单位平板法对存活孢子进行计数。

摘要

侵袭性曲霉病（IA）是免疫功能低下个体中最常见的真菌感染之一 。尽管已有抗真菌药物可用，IA 在感染的免疫功能低下患者中仍可导致超过 >50% 的死亡率。为了开发新的治疗方法，必须明确导致感染易感性和患者低存活率的宿主与病原体因素。先天免疫反应在识别和清除Aspergillus孢子过程中发挥关键作用，但目前对具体的细胞和分子机制了解甚少。因此，需要可靠的模型来深入研究宿主与病原体之间的机制性相互作用。斑马鱼幼鱼具有光学通透性和良好的遗传可操作性，是研究多种人类细菌和真菌感染在活体完整宿主中宿主-病原体相互作用的极具吸引力的模型 。本实验方案描述了一种斑马鱼幼鱼Aspergillus感染模型。首先，将Aspergillus孢子分离后通过显微注射注入斑马鱼后脑室。随后，将化学抑制剂（如免疫抑制药物）直接加入幼鱼培养水中。文中介绍了两种监测注射后幼鱼感染情况的方法：1）将幼鱼匀浆后进行菌落形成单位（CFU）计数；2）重复性的每日活体成像检测。总体而言，这些技术可用于在体内机制性地分析Aspergillus感染的进展过程，并可应用于不同宿主遗传背景和不同Aspergillus菌株，以探究宿主与病原体之间的相互作用。

引言

Aspergillus fumigatus 是一种普遍存在的腐生性真菌，其空气传播的孢子在室内和室外均可发现1。所有人都会吸入这些孢子，但在免疫功能正常个体中，孢子可被有效清除出肺部1,2。然而，患有肺部状况异常（如囊性纤维化）的人群可能因真菌在肺内萌发而发展为支气管肺曲霉病3。该感染最严重的形式为侵袭性曲霉病（IA），主要影响免疫功能低下个体，并涉及真菌向其他器官的侵入性生长2,3。尽管已有抗真菌治疗手段，IA 仍导致超过 >50% 的感染患者死亡4。在免疫功能正常个体中，先天免疫反应在清除吸入孢子过程中起主要作用1。然而，介导这种先天免疫清除作用的具体机制尚不明确。深入了解主要先天免疫细胞（即巨噬细胞和中性粒细胞）在清除Aspergillus过程中的细胞与分子机制，对于开发针对IA的新型治疗策略至关重要。

尽管哺乳动物模型在鉴定真菌毒力因子和宿主免疫反应方面发挥了重要作用5,6，但在细胞水平上观察宿主-病原体相互作用的可视性仍受限。组织培养实验无法完全重现整个动物体内复杂的多细胞环境及其相互作用7。因此，斑马鱼作为一种替代模式生物日益受到关注，可填补这一空白，有助于在活体完整宿主中研究跨多日感染过程的宿主-病原体相互作用8,9。斑马鱼的先天免疫系统在受精后24小时（hpf）即已开始发育10，而适应性免疫系统则需4–6周才能发育完成11，这一时间窗口使得先天免疫反应可在无适应性免疫干扰的情况下被独立评估。人类与斑马鱼之间的先天免疫反应具有高度保守性11。斑马鱼具备多种有利于研究这些免疫反应的特性，包括良好的光学通透性（可实现对完整宿主的高分辨率活体成像）和易于进行遗传操作（有利于开展分子机制研究）。

本文所述的幼年斑马鱼Aspergillus感染模型最初由Knox等人建立12。近年来，本课题组及其他研究团队已将其拓展用于研究宿主免疫机制12,13、宿主-病原体相互作用13,14,15、免疫抑制机制13,16,17、真菌毒力机制18以及抗真菌药物疗效19,20。该模型可再现人类曲霉病的多个方面特征。免疫功能健全的幼鱼对感染具有抵抗力，而免疫功能受损的幼鱼则可能死于感染12,13,16,17。

在此模型中，通过将孢子注射到幼鱼后脑室（该区域吞噬细胞较少）来建立局部感染，从而可评估吞噬细胞的募集和行为12,13。研究表明，巨噬细胞在人体1和哺乳动物模型6,21中是抵御Aspergillus孢子的第一道防线。类似地，在斑马鱼模型中，巨噬细胞首先被募集至注射的Aspergillus孢子处，而中性粒细胞则在菌丝生长后继发性地被募集12,13,22。通过该模型还发现，Aspergillus可在野生型免疫功能健全的幼鱼体内持续存在超过7天。此外，可通过每日共聚焦成像在同一批活体动物中连续观察整个感染过程。

本方案描述了通过显微注射将孢子注入受精后2天（2 dpf）幼鱼后脑室的技术。感染过程可监测长达7天，因为斑马鱼幼鱼在不喂食的情况下可存活至10 dpf。可通过药物处理诱导免疫抑制，并在文中描述了向幼鱼施用药物的方法。最后，介绍了两种监测感染进展的方法，包括从单个幼鱼中定量菌落形成单位（CFU）以及每日活体成像系统。

方案

研究人员应获得相应动物护理与使用委员会对所有动物实验的批准。本文所示的代表性数据来自经克莱姆森大学机构动物护理与使用委员会批准的实验方案（AUP2018-070，AUP2019-012）下开展的实验。

1. 注射用Aspergillus孢子的制备

  1. 从 Aspergillus 孢子悬液中计算获得 1 × 106 个孢子所需的体积。该体积应为 20–100 μL；若不符合，则用 0.01% (v/v) 无菌 Tween-20（Tween-水；材料表）进行 10 倍稀释。例如，若计算出的体积为 5 µL，则制备 10 倍稀释液，并取 50 µL 稀释后的溶液使用。
    注意：可为每种菌株制备两个平板，以收集更多孢子，或作为污染情况下的备用。
  2. 在生物安全柜中，使用无菌一次性 L 形涂布棒将 1 × 106 个 Aspergillus 孢子均匀涂布于一个葡萄糖基本培养基（GMM）平板（材料表）上。避免将孢子涂布至平板边缘。将平板倒置，在 37 °C 下孵育 3–4 天。
  3. 在收集当天，将无菌 miracloth 和 50 mL 锥形管（每种菌株各两个）、新鲜的无菌 Tween-水瓶（每种菌株各一瓶）以及无菌一次性 L 形涂布棒带入生物安全柜。
    注意：miracloth 可裁剪成约 8 英寸 × 6 英寸的片状，用铝箔包裹后高压灭菌以实现灭菌。
  4. 将一片 miracloth 放入每个已标记的 50 mL 锥形管中，盖上盖子。将剩余的 miracloth 包装从操作台中取出。
  5. 将平板带入生物安全柜。打开一个平板，然后倒入 Tween-水，使其覆盖约四分之三的平板表面。
  6. 使用一次性 L 形涂布棒，以左右往复的方式轻轻刮擦真菌培养物表面，同时用另一只手旋转平板。持续刮擦，直至几乎所有孢子均被均匀分散到 Tween-水中。
    注意：由于孢子具有高度疏水性，在加入 Tween-水或刮擦过程中可能形成“团块”。应格外小心，避免污染附近的试管或平板。建议在提取不同菌株之间更换手套，并用 70% 乙醇擦拭操作台表面。
  7. 取一个 50 mL 锥形管，取出其中的 miracloth 片。将其对折，制成过滤器并插入 50 mL 锥形管顶部。
  8. 将平板中的真菌匀浆液通过 miracloth 过滤至锥形管中。
    注意：若为同一种菌株准备了两个平板，应将两个平板的刮取物 合并倒入同一个锥形管中。
  9. 加入 Tween-水，使锥形管中的总体积达到 50 mL。
  10. 在离心机中以 900 × g 离心 10 分钟。确保使用防气溶胶盖的离心管。
  11. 将上清液倒入约 10% 的次氯酸钠溶液中以进行去污处理。向锥形管中加入 50 mL 无菌 1× PBS，然后涡旋或振荡以重悬沉淀。
  12. 再次以 900 × g 离心 10 分钟。倒去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 无菌 1× PBS 中，并通过一片新的 miracloth 过滤至一个新的 50 mL 锥形管中。
  13. 在 1.7 mL 离心管中对真菌匀浆液进行 10 倍系列稀释（10 倍、100 倍、1000 倍）（例如，对于 10 倍稀释液，将 100 µL 真菌匀浆液与 900 µL Tween-水混合）。
  14. 选择在将稀释液滴入 Tween-水后孢子不可见的第一个稀释度，并使用该稀释度通过血细胞计数板计数孢子数量。
  15. 使用以下公式计算所制备的真菌匀浆液（水悬液）中的孢子浓度：

    浓度（孢子/mL）= 中央 25 个计数方格内的孢子数 × 稀释倍数 × 104
  16. 在 1.7 mL 微量离心管中，用无菌 1× PBS 制备 1 mL 含 1.5 × 108 个孢子/mL 的孢子储备液。该孢子悬液可在 4 °C 下保存约 4 周。
  17. 在用于注射前，于 1.7 mL 离心管中将 20 µL 孢子悬液与 10 µL 1% 无菌酚红混合，使最终孢子浓度达到 1 × 108 个孢子/mL。注射前充分涡旋混匀。
    注意：1% 酚红溶液应经过滤灭菌，并分装保存。
  18. 对于模拟注射，将 20 µL 1× PBS 与 10 µL 1% 无菌酚红混合。

2. 注射用琼脂平板的制备

  1. 在微波炉中融化含有2%琼脂糖的E3培养基。
  2. 将融化的琼脂糖溶液倒入100 mm × 15 mm的培养皿中（每皿约25 mL），轻轻旋转使溶液均匀覆盖皿底，静置冷却。
  3. 用封口膜包裹培养皿，并倒置于4 °C保存。
  4. 注射前，将培养皿恢复至室温（RT）。
  5. 向培养皿中加入约1 mL过滤除菌的2%牛血清白蛋白（BSA）溶液，倾斜培养皿使液体均匀铺展并覆盖整个底部，随后用E3培养基冲洗。
    注意：2% BSA溶液可过滤除菌后分装为1 mL等份，于-20 °C保存。预先使用2% BSA处理可防止幼鱼黏附在琼脂糖表面。
  6. 向培养皿中加入含缓冲三卡因的E3培养基，静置直至进行注射。

3. 斑马鱼幼体后脑室微注射

  1. 在2 dpf时，于培养皿中用镊子手动去除幼鱼的卵膜。
    注意：去膜操作可在1.5 dpf至注射时间之间的任何时段进行。
  2. 尽可能移除培养皿中的E3培养基，并加入含缓冲液的300 µg/mL三卡因（tricaine）E3溶液以麻醉幼鱼。
    注意：可预先配制含缓冲液的4 mg/mL三卡因E3储备液，并于4 ˚C保存。工作液可通过将4 mL储备液用E3定容至50 mL稀释获得。
  3. 使用配备压力注射仪、背压装置、脚踏开关、微移液管夹持器、显微操作器以及磁性支架和注射板的微注射装置（详见材料表），并将其全部连接至压缩空气源。
  4. 打开压缩空气阀门并启动显微注射仪。将压力设为约25 PSI，脉冲持续时间设为60 ms，背压装置设为1 PSI。
  5. 使用微量移液器吸头（详见材料表）向微注射针中加载约3–5 µL预先配制的含酚红PBS缓冲液或孢子悬液。将注射针安装至显微操作器上。
    注意：微注射针的制备方法可参考先前文献23。用于微注射的体视显微镜应配备目镜测微尺以校准注射针。需使用台式显微尺对测微尺进行校准，确定测微尺刻度的长度（µm）。根据测微尺刻度线与喷出液滴重叠的数量，测量从针尖喷出的孢子悬液滴的直径。
  6. 调节显微操作器，使针尖在体视显微镜最低放大倍数下可见。将放大倍数调至4倍，保持针尖在视野中。
  7. 使用尖头镊子剪断针尖。踩下注射踏板以观察喷出液滴的大小。持续剪短针尖直至每次注射量约为3 nL的孢子悬液（此处对应为5个刻度）。
  8. 将显微操作器和注射针移开，避免在排列幼鱼时意外触碰针尖。
  9. 倾去注射板上的E3-三卡因溶液，然后使用转移移液管将约24条麻醉后的幼鱼转移至注射板，尽量减少携带的E3液体量。
  10. 使用操作斑马鱼幼鱼的小工具（如毛发环工具或睫毛工具），根据幼鱼朝向进行排列：将所有朝向右侧的幼鱼排成一行，所有朝向左侧的排在下方另一行。
    注意：若板上液体过多，幼鱼易“漂浮”移位，导致排列困难；但若液体过少，且注射耗时较长，幼鱼可能脱水或麻醉效果消退。因此，在整个微注射过程中应持续关注板上液体量。
  11. 将显微镜放大倍数调至最低。将显微操作器移回，调整位置使针尖接近幼鱼，与视野中心呈约30˚–60˚角。
  12. 放大至最高倍数，使用微调旋钮进一步调整针尖位置。通过将孢子悬液注射到幼鱼旁的液体中，观察是否有约30–70个孢子喷出，以确认注射量。必要时调整注射装置的时间和压力参数。
    注意：每注射5至6条幼鱼后应重复此测试，因随时间推移，针尖喷出的孢子数量可能发生变化。
  13. 从幼鱼朝向针尖的一行开始，移动注射板，使针尖正对并靠近第一条幼鱼。
  14. 使用显微操作器移动针尖，将其插入耳囊周围的组织，穿透至后脑室。必要时用另一只手移动注射板，以调整幼鱼体位与针尖角度的相对方向。
  15. 目视确认针尖位于后脑室中央，踩下脚踏开关注入孢子，随后轻柔回撤针尖。
    注意：酚红染料应主要停留在后脑室内。少量可进入中脑，但不应到达前脑或脑外区域。若出现上述情况，说明注射体积过大，应相应降低压力和时间参数，或重新校准新针头。
  16. 沿注射板依次完成该行所有幼鱼的注射。随后翻转注射板，完成另一行所有幼鱼的注射。
    注意：对于注射失败或意外损伤的幼鱼，可通过以下方式标记：1）向卵黄内多次注射以形成红色标记；或2）用针尖将幼鱼从排列中拖出。
  17. 再次将针尖上提并移开。将显微镜倍数调低。每条幼鱼后脑中的酚红染料应仍清晰可见。
  18. 首先使用毛发环工具和移液管移除所有注射失败的幼鱼。用新鲜无菌E3培养基冲洗剩余幼鱼，将其转移至新的培养皿中。
  19. 根据最终实验所需的样本数量，重复上述操作。
  20. 用E3培养基至少冲洗幼鱼两次，并确保其从麻醉状态中恢复。
  21. 如需在不进行额外处理的情况下量化存活率，使用转移移液管将幼鱼转移至96孔板（每孔1条幼鱼），加入E3培养基。

4. 注射孢子数量与可存活孢子数量的确定

  1. 注射后立即使用移液管随机挑选约八只已注射的幼虫，分别转移至1.7 mL离心管中（每管一只幼虫）。
  2. 使用三卡因（tricaine）或将幼虫置于4 °C环境中0.5–2.0小时，以实施安乐死。
  3. 在无菌1x PBS中配制1 mL浓度为1 mg/mL的氨苄青霉素和0.5 mg/mL的卡那霉素抗生素溶液。剩余溶液可于4 °C保存，后续使用。
    注意：可预先配制100 mg/mL氨苄青霉素和50 mg/mL卡那霉素的储存液，经滤膜除菌后分装，于-20 °C保存。使用时用1x PBS稀释100倍，获得工作浓度溶液。
  4. 用移液器尽可能吸除离心管中的液体，保留幼虫，并加入90 µL含抗生素的1x PBS。
    注意：使用抗生素可防止GMM平板中细菌生长，避免干扰Aspergillus菌落的计数。
  5. 在组织研磨仪中以1,800次振荡/分钟（30 Hz）均质化幼虫6分钟，随后以17,000 x g离心30秒。
  6. 标记GMM平板（每只均质化幼虫对应一个平板）。在本生灯火焰附近建立无菌环境，将一根离心管中的均质化悬液移至GMM平板中央，使用一次性L型涂布棒均匀涂布。避免将匀浆液涂至平板边缘。
  7. 将平板倒置于37 °C培养2–3天，计数形成的菌落数量（CFU）。
  8. 为测定感染期间存活孢子的数量，可在注射后1–7天（dpi）从96孔板中取出幼虫，转移至离心管中，按步骤4.1–4.5所述进行安乐死、均质化并涂布于GMM平板上。

5. 注射后幼虫的药物处理

  1. 在第4步之后，将剩余的注射幼鱼分成两份，分别放入两个3.5 mm的培养皿中：一份用于药物处理，另一份作为对照。每种条件下使用约24条感染幼鱼。
    注意：3.5 mm培养皿可预先用含2%脱脂奶粉的水处理，随后冲洗、晾干并在室温下储存。用奶粉包被可防止幼鱼粘附在塑料表面。
  2. 根据所需终浓度，在锥形管中用不含亚甲蓝的E3培养基配制目标药物溶液及其溶剂对照，并充分混匀。例如，若需监测暴露于地塞米松的幼鱼存活情况，则应设置地塞米松组（24条幼鱼）和溶剂对照组（如DMSO，24条幼鱼）。配制5 mL所需浓度的药物溶液。此处使用了5 mL含0.1% DMSO和10 µM地塞米松的溶液，并将每组24条幼鱼转移至约200 µL的溶剂/药物溶液中。
  3. 用移液器尽可能吸除其中一个培养皿中的液体，加入预先混合好的含溶剂对照的E3培养基；对另一个培养皿重复此操作，加入含有目标处理药物的预混E3培养基。
  4. 使用移液器将幼鱼转移至96孔板中（每孔一条幼鱼）。持续监测暴露于溶剂或药物的注射幼鱼在7天内的存活情况。
    注意：药物可在感染当天一次性加入，并在整个实验期间持续保留在体系中，也可每日更换一次。

6. 使用斑马鱼伤口与捕获成像生长装置（zWEDGI）对感染幼鱼进行每日成像

  1. 在24 hpf时用100 µM N-苯基硫脲（PTU）处理幼鱼，以抑制色素形成，并在整个实验过程中持续保留PTU。
    注意：75–100 µM的PTU可在不引起明显发育异常的情况下有效抑制幼鱼色素沉着24。然而，PTU可能干扰某些生物学过程25，研究人员应预先确认该药物是否会影响所研究的特定生物学过程。
  2. 在2 dpf时，按照第3节所述方法，用表达荧光蛋白的工程化Aspergillus孢子感染携带标记细胞群体的转基因幼鱼。随后，将感染后的幼鱼转移至48孔板中，每孔约500 µL不含亚甲蓝的E3培养基。
    注意：此处使用48孔板，因其在每日重复成像过程中更便于幼鱼的转移操作。
  3. 在成像当天，准备两个3.5 mm培养皿：一个加入含100 µM PTU的E3培养基，另一个加入含三卡因（tricaine）的E3培养基（E3-tricaine）。
  4. 将E3-tricaine加入zWEDGI装置26,27的腔室中。在体视显微镜下，使用P100微量移液器去除腔室及限制通道中的气泡。清除所有多余的E3-tricaine，确保液体仅保留在腔室内。
  5. 使用转移移液器从孔板中吸取一条幼鱼。若转移时带入较多液体，先将其移入盛有E3-PTU的3.5 mm培养皿中。然后再次吸取，尽量减少液体体积，并转移至E3-tricaine中。
  6. 等待约30秒以实现麻醉，随后将幼鱼转移至损伤与固定装置（如zWEDGI）的加载腔室中。
  7. 在体视显微镜下调整幼鱼位置。使用P100微量移液器从损伤腔室中吸除E3-tricaine，并释放至加载腔室，推动幼鱼尾部进入限制通道。确保幼鱼侧卧、背朝上或背外侧朝上，以便使用倒置物镜对后脑进行成像。
  8. 使用共聚焦显微镜对幼鱼进行成像。
  9. 成像完成后，使用P100移液器将E3-tricaine重新注入损伤腔室，推动幼鱼从限制通道返回至加载腔室。
  10. 使用转移移液器拾取幼鱼，先将其转移回含E3-tricaine的培养皿，再用尽可能少的液体转移至含E3-PTU的培养皿中。在PTU中冲洗后，将幼鱼放回48孔板中。

结果

将曲霉菌（Aspergillus）孢子显微注射至斑马鱼幼鱼的后脑后，可通过多种检测方法监测感染结果，包括存活率、菌落形成单位（CFU）和活体成像。在存活率实验中，监测了感染后1–7天内存活的幼鱼数量。若野生型幼鱼未接受任何处理，死亡率极低，约80%–100%的幼鱼在整个实验期间存活（图1）。若幼鱼处于免疫抑制状态，例如暴露于皮质类固醇药物地塞米松（10 µM），则观察到存活率显著下降（图1）。

在为期7天的实验过程中，对感染了A. fumigatus孢子的野生型幼虫进行CFU定量，观察到孢子持续存在，并随时间推移缓慢被清除（图2A）。将1、2、3、5和7 dpi时存活的孢子数量标准化为0 dpi时注射的孢子数量，以比较不同重复组间的孢子持续性与清除情况（图2B）。

表达荧光蛋白的转基因鱼类品系与表达荧光蛋白的Aspergillus孢子联用，可用于同时观察白细胞的募集和行为以及真菌的萌发与生长13。当巨噬细胞被标记时（例如Tg(mpeg1:H2B-GFP)），通常在约50%的幼鱼中观察到巨噬细胞聚集，起始于感染后2–3天（图3A）。中性粒细胞（Tg(lyz:BFP)）的募集通常延迟，主要发生在真菌萌发之后（图3A）。尽管大多数幼鱼在整个实验过程中持续存在真菌负荷（图3A），但也观察到了真菌清除现象（图3B）。在部分幼鱼中，由于真菌扩散（可能通过巨噬细胞介导），感染后期在后脑以外区域也观察到了真菌负荷。

在耳泡周围区域可观察到这种播散现象的一个可能位置（图3C）。在整个实验过程中，对多个独立的幼鱼个体进行了定量分析（图4）。通常情况下，在感染后5天（5 dpi）约有60%的幼鱼中可观察到萌发现象（图4A）。吞噬细胞簇面积、巨噬细胞募集和中性粒细胞募集在不同时间点及不同幼鱼之间均存在差异，部分指标在整个实验过程中呈上升趋势，而另一些则随时间逐渐消退（图4B,C,D）。

生存分析图；DMSO 与 Dex 处理；宿主存活率随时间变化（%）；统计学显著性。
图1：感染幼虫的代表性生存分析。Aspergillus 感染的幼虫接受载体对照（DMSO）或地塞米松（Dex）处理，并监测其存活情况。数据代表三次合并的重复实验。平均注射菌落形成单位（CFU）：DMSO = 30，Dex = 29（p值和风险比通过Cox比例风险回归分析计算，****p < 0.0001）。请点击此处查看该图的放大版本。

CFU 测量图表；孢子负荷减少图；注射后天数；微生物学实验。
图 2：感染后立即（0 dpi）及感染过程中（2、3、5 和 7 dpi）单个感染幼虫的代表性 CFU 计数。每个时间点和重复实验中，取八只感染幼虫进行匀浆并涂布培养以计数 CFU。(A) 一个重复实验的示例数据。每个点代表一只幼虫，条形表示每个时间点的平均值。(B) 将各重复实验中每个时间点的 CFU 计数相对于 0 dpi 的 CFU 计数进行归一化处理，并合并三个重复实验的数据。采用方差分析比较不同实验条件之间的数据，并以估计的边缘均值和标准误进行总结。星号表示与 0 dpi 的 CFU 相比具有统计学显著性（*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001）。请点击此处查看该图的放大版本。

感染后不同天数幼鱼中烟曲霉、巨噬细胞和中性粒细胞的显微镜图像。
图3：感染实验的代表性图像。经PTU处理的幼鱼表达荧光巨噬细胞（mpeg1:H2B-GFP）和中性粒细胞（lyz:BFP），并注射表达RFP的A. fumigatus。在感染后第2、3和5天，使用共聚焦显微镜对活体感染幼鱼进行连续成像。图像显示为最大强度Z投影。各图面板中的幼鱼示意图标明了成像位置。所有比例尺均为100 µm，插图中的比例尺为25 µm。（A）图像来自同一条幼鱼在2、3和5 dpi（感染后天数）采集的数据，代表典型的感染进展过程。插图显示第3天和第5天的真菌萌发情况。（B）部分幼鱼可清除感染，其在5 dpi时真菌负荷较低且炎症反应轻微，此为代表性图像。（C）部分幼鱼在后期感染从后脑扩散，此为代表性图像。在此图像中，可在耳囊周围及下方观察到真菌、巨噬细胞和中性粒细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

幼虫感染分析图；孢子萌发、吞噬细胞区域、巨噬细胞、中性粒细胞。
图4：成像实验的代表性定量结果。来自图3实验设置的图像被用于分析真菌孢子萌发及白细胞募集情况。（A）每天记录幼虫是否存在萌发的孢子，并计算具有孢子萌发的幼虫百分比。（B, C, D）每条幼虫以不同颜色的线条表示。在为期5天的实验过程中，分别追踪每条幼虫的吞噬细胞簇出现与大小（B）、巨噬细胞募集（C）以及中性粒细胞募集（D）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述的感染模型有助于分析宿主免疫反应、宿主-病原体相互作用以及真菌致病机制12,13,14,15。这些信息可通过荧光标记的病原体与宿主细胞的高分辨率成像13、幼虫存活率以及随时间推移的菌落形成单位（CFU）持续情况获得。

显微注射技术对于本实验方案的成功至关重要，在使用不同的显微注射设备和装置时，可能需要进行相应调整。其中，注射压力和注射时间是两个主要变量，可进行调节，以确保针头排出的液体体积约为 3 nL。通过镊子剪切针头来控制针头的大小，这也会调节被注入的孢子数量；然而，过大的开口可能导致幼虫组织损伤。另一方面，开口过小则无法使相对较大的孢子（>2 µm）顺利通过，可能导致针头堵塞。若发生堵塞，可重新剪切针头，使其开口略为增大。

其他细菌显微注射方案使用PVP-40以帮助维持注射混合物的均匀性，但我们发现将其用于Aspergillus孢子时并无优势。在装填针头前，可通过充分涡旋真菌悬液以打散任何团块，从而减轻针头堵塞问题。有时，也可通过暂时提高压力或注射时间，并在针头位于幼虫周围液体中时触发显微注射仪，来解除针头堵塞。随后应将压力和注射时间重新调回之前的水平。在其他情况下，若堵塞无法清除，则需更换新针头并重新校准。

本方案旨在每只幼虫中注射约30–70个孢子。已知根据孢子悬液的浓度和注射体积计算，实际注射数量相当低。然而，通过实验观察发现，在这些条件下注射的孢子数量确实如此。造成这种差异的原因尚不清楚，但可能与孢子在针头中发生聚集有关。我们尝试注射更多数量的孢子大多未获成功。

为确保每次注射约30–70个孢子，并在整个实验过程中保持注射剂量的一致性，可通过将孢子注射到幼虫周围的E3培养基中来检查孢子数量。在每注射五到六只幼虫后重复此步骤。如果发现孢子数量发生变化，可调整注射压力和/或注射时间，以确保在多只幼虫中注射的孢子数量保持一致。但需注意，注射剂量应主要集中在后脑，避免填充中脑和前脑。

为确保局部感染，孢子悬液应局限于后脑室区域内。注射后可通过酚红染色观察其位置，尽管红色会随时间逐渐扩散。注射时，以耳囊区域为穿刺点，以45°–65°的角度进入脑室。该区域无主要血管，造成的组织损伤较小，且可迅速愈合。若穿刺时穿透脑室上方的皮肤，孢子悬液可能外漏，因为用于Aspergillus孢子注射的针头比用于细菌悬液的针头更粗。对于注射失败或意外损伤的幼鱼，可通过向卵黄内多次注射以形成红色标记，或用针头将其从排列中移出，加以标记。完成一批注射后，应在将其他幼鱼从培养板上冲洗前，先移除并处理这些幼鱼。注射前用于麻醉幼鱼以及注射后维持幼鱼的培养液应使用不含亚甲蓝的E3培养液，因为亚甲蓝具有抗真菌作用。

注射时，菌落形成单位（CFU）计数代表感染宿主内存活孢子的数量。然而，如果孢子萌发为菌丝，则在匀浆过程中这些菌丝可能断裂成多个独立的存活“真菌单位”，从而形成多个菌落。或者，一条未断裂的多细胞菌丝可能仅形成一个菌落，导致对真菌负荷量的估算仅为平均值，但不够精确。通过将CFU计数与对单个幼虫进行的纵向显微观察相结合，可缓解这一问题，后者可提供有关注射孢子命运的可视化数据。

与哺乳动物系统相比，斑马鱼幼虫感染模型因其光学通透性而具有重要意义。先天免疫细胞的募集和反应可以在活体完整宿主中直接观察。该模型可结合分子靶点的遗传或化学抑制，以分析每个靶点如何影响巨噬细胞或中性粒细胞在活体动物中对Aspergillus孢子的反应。

尽管斑马鱼幼鱼Aspergillus感染模型在描述侵袭性曲霉病（IA）的多个方面持续发挥重要作用12,13,14,15,16,17,18,19,20,22，但仍存在其他可拓展的研究方向。从宿主角度而言，该模型可用于描述细胞水平的免疫应答，但通过结合靶向吗啉代寡核苷酸、CRISPR技术、稳定突变品系或化学物质暴露，可进一步扩展至在分子水平上分析免疫机制。需要注意的是，并非所有已知哺乳动物先天免疫通路组分的同源基因均已在斑马鱼中被鉴定出来。

从病原体角度来看，不同物种和菌株的毒力已有描述。未来研究的一个有前景的方向是利用突变的Aspergillus菌株，来检测特定基因或蛋白质如何作为毒力因子发挥作用。通过这种方式，可开发出靶向这些蛋白质的新型抗真菌药物。目前的抗真菌药物在人类患者中疗效较低，且真菌对这些药物的耐药性日益增强28。该体内模型可用于探究这些药物失效的原因，并作为中间模型用于评估新型抗真菌药物的疗效。总体而言，利用该模型所获得的研究发现，将有助于推动未来对Aspergillus感染患者有效治疗方案的开发。

披露

无任何利益冲突或财务关系需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所资助，资助编号为 K22AI134677。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜蒙特镊子 #5Roboz 外科器械公司RS-5045
目镜测微尺显微镜世界RETR10用于校准针头，配合体视显微镜使用
显微注射装置：背压单元应用科学仪器公司BPU
脚踏开关应用科学仪器公司FTSW
微量移液器固定装置套件应用科学仪器公司M-Pip
压力注射器应用科学仪器公司MPPI-3
显微操作装置：显微操作器Narashige（Tritech）M-152
磁力支架和底板TritechMINJ-HBMB
玻璃毛细管拉制仪Sutter InstrumentP-97
体视显微镜尼康SMZ-745
Tissuelyser IIQiagen85300用于匀浆幼虫
材料公司目录编号备注/说明
琼脂糖费舍尔BP160-500
氨苄青霉素钠盐费舍尔AAJ6380706
牛血清白蛋白，V 级VWRAAJ65855-22
硫酸卡那霉素费舍尔AAJ1792406
L 型涂布棒费舍尔14 665 230
微量毛细管针（无内丝）世界精密仪器公司（WPI）TW100-3
微量移液器加样尖VWR89009-310用于将曲霉菌悬液装入针头
MiraclothVWREM475855-1R用于过滤曲霉菌悬液
N-苯基硫脲费舍尔AAL0669009用于防止色素沉着
酚红，1% 溶液费舍尔57254
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）费舍尔AC118000500用于麻醉幼虫
吐温-20费舍尔BP337-500
培养基与溶液成分/配方
E3 培养基：60x E317.2 g NaCl，0.76 g KCl，2.9 g CaCl2，4.9 g MgSO4 · 7H2O，加 H2O 定容至 1 L
1x E316.7 ml 60x 储液，430 μl 0.05 M NaOH，加 H2O 定容至 1 L（可选：+ 3 ml 0.01% 亚甲蓝）
三卡因储备液2 g 三卡因，5 g Na2HPO4 · 7H2O，4.2 ml 60X E3，加 H2O 定容至 500 ml，用 NaOH 调 pH 至 7.0–7.5
葡萄糖基本培养基（GMM）琼脂：GMM 琼脂10 g 葡萄糖（右旋糖），50 ml 20x 硝酸盐溶液，1 ml TE，加 H2O 定容至 1 L，用 NaOH 调 pH 至 6.5，加入 16 g 琼脂，高压灭菌
20x 硝酸盐溶液120 g NaNO3，10.4 g KCl，10.4 g MgSO4 · 7H2O，30.4 g KH2PO4，加 H2O 定容至 1 L，高压灭菌
微量元素（TE）2.20 g ZnSO4 · 7H2O，1.10 g H3BO3，0.50 g MnCl2 · 4H2O，0.16 g FeSO4 · 7H2O，0.16 g CoCl2 · 6H2O，0.16 g CuSO4 · 5H2O，0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O，5.00 g Na2EDTA，加 H2O 定容至 100 ml，搅拌过夜溶解，高压灭菌

参考文献

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斑马鱼幼虫感染 曲霉属 用于宿主-病原体相互作用分析的孢子
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