从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

摘要

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（<50 mg），即可获得高产量的耐钙细胞（最多可达200个细胞/mg）。该方案适用于经历长达36小时冷缺血暴露的心肌组织。

摘要

从动物和人类心脏中分离心室心肌细胞是心脏研究中的一项基本方法。动物心肌细胞通常通过冠状动脉灌注消化酶进行分离。然而，人类心肌细胞的分离具有挑战性，因为人类心肌标本通常无法进行冠状动脉灌注，而其他替代分离方案所获得的活细胞产量较低。此外，人类心肌标本十分稀有，仅在具备现场心脏外科手术条件的机构中才能定期获得。这阻碍了从动物心肌细胞研究结果向人类心肌细胞的转化应用。本文介绍了一种可靠的实验方案，可高效地从人类和动物心肌组织中分离心室心肌细胞。为了在尽量减少细胞损伤的同时增加组织的表面积与体积比，使用振动切片机（vibratome）将心肌标本切成300 µm厚的组织切片。随后用蛋白酶和胶原酶对组织切片进行消化。本研究首先采用大鼠心肌组织建立该方案，并通过流式细胞术细胞计数法量化获得的存活且耐钙的心肌细胞产量。与常用的组织块法相比，本方法获得的杆状心肌细胞产量显著更高（41.5 ± 11.9 vs. 7.89 ± 3.6%，p < 0.05）。该方案进一步应用于衰竭和非衰竭的人类心肌组织，结果显示细胞产量与大鼠心肌组织相当，且再次显著高于组织块法（45.0 ± 15.0 vs. 6.87 ± 5.23 个细胞/mg，p < 0.05）。值得注意的是，采用本方案可从极少量组织（<50 mg）中分离出足够数量的存活人类心肌细胞（9–200 个细胞/mg）。因此，该方法适用于人类和动物心脏的健康及衰竭心肌组织。此外，即使人类心肌标本在低温停搏液中冷藏保存长达36小时，仍可从中分离出具有兴奋性和收缩功能的心肌细胞，这使得该方法对于不具备现场心脏外科手术条件的机构中的实验室尤为实用。

引言

一项开创性的技术为深入理解心肌细胞生理学铺平了道路，即从完整心脏中分离出存活的心室心肌细胞¹。分离的心肌细胞可用于研究正常细胞的结构与功能，或体内实验所导致的后果；例如，评估在心脏疾病动物模型中细胞电生理学或兴奋-收缩耦联的变化。此外，分离的心肌细胞还可用于细胞培养、药理学干预、基因转导、组织工程以及许多其他应用。因此，高效的心肌细胞分离方法对基础和转化心脏研究具有根本性的重要价值。

通常通过冠状动脉灌注含有粗制胶原酶和/或蛋白酶溶液的方法，从小型哺乳动物（如啮齿类动物）以及大型哺乳动物（如猪或狗）中分离心肌细胞。该方法被称为心肌细胞分离的“金标准”，可获得高达70%的活细胞得率²。该方法也已用于人类心脏，能够获得可接受的心肌细胞得率^3,4,5。然而，由于冠状动脉灌注仅在完整心脏或含有冠状动脉分支的大块心肌组织可获取时才可行，而大多数人类心脏标本体积较小且缺乏合适的血管结构，因此不适合采用此方法。因此，人类心肌细胞的分离具有较大挑战性。

人类心肌标本主要由大小不一的组织块（约 0.5 × 0.5 × 0.5 cm 至 2 × 2 × 2 cm）组成，通常通过心内膜心肌活检⁶、室间隔切除术⁷、心室辅助装置（VAD）植入术⁸或心脏移植术中摘除的心脏⁹获得。心肌细胞分离的常用方法首先使用剪刀或手术刀将组织剪碎。随后将组织浸入无钙或低钙缓冲液中，以破坏细胞间的连接。接着使用粗制酶提取物或纯化的酶（如蛋白酶（例如胰蛋白酶）、胶原酶、透明质酸酶或弹性蛋白酶）进行多次消化，从而降解细胞外基质并释放心肌细胞。最后的关键步骤是需谨慎恢复生理浓度的钙离子，否则可能因钙反常现象导致细胞损伤^10,11,12。该分离方法操作简便，但通常效率较低。例如，有研究发现，为获得足够数量可用于后续实验的心肌细胞，几乎需要使用近 1 g 的心肌组织¹³。产量较低的可能原因之一是组织剪碎过程相对剧烈，这可能会特别损伤位于组织块边缘的心肌细胞 ，而这些细胞恰恰最有可能通过酶消化被释放出来。

影响从人体标本中分离细胞效率和质量的另一个因素是组织缺血持续时间。大多数方案均指出，将样本快速转运至实验室是获得良好 结果的前提条件。这使得人类心室心肌细胞的研究仅限于邻近心脏外科设施的实验室开展。这些限制共同导致难以在人类心肌细胞中验证来自动物模型的重要发现。因此，亟需改进细胞分离方案，以实现仅用少量组织即可获得较高兴奋肌细胞得率，并最好能在较长转运时间后仍避免严重损伤。

本文介绍了一种基于酶消化法的分离方案，所用材料为使用振动切片机（vibratome）制备的薄层心肌组织切片^14,15。我们证明，与使用剪刀剪碎的组织块相比，从组织切片中进行细胞分离的效率显著更高。该方法不仅能够从小量心肌组织中获得高产量的活人源心肌细胞，还可适用于在低温心脏停搏液中储存或运输长达36小时的组织样本。

方案

所有涉及大鼠的实验均经德国巴伐利亚州中弗兰肯动物护理与使用委员会批准。人类心脏组织样本的采集和使用均经埃尔朗根-纽伦堡大学和鲁尔大学波鸿分校的机构审查委员会批准。研究按照《赫尔辛基宣言》指南进行。患者在组织采集前均签署书面知情同意书。

雌性Wistar大鼠（150–200 g）购自商业供应商，通过腹腔注射100 mg/kg硫喷妥钠进行麻醉，随后采用颈椎脱位法处死，并行胸廓切开术切除心脏。人的心脏组织样本取自左心室心尖部核心组织（在植入机械辅助装置期间）、室间隔切除术、法洛四联症矫正手术，或来自移植摘除心脏的左心室游离壁。以下方案描述了从人心室组织中分离细胞的过程。大鼠心肌细胞的分离操作类似，但使用不同的酶（见 材料表）。该方案的示意图流程见 图1。

1. 缓冲液、溶液和酶的制备

1. 按所列清单准备缓冲液和溶液 表1.
2. 将溶液1、2、3及改良Tyrode's溶液预热至37 °C。切割溶液于4 °C保存，临用前取出。
   注意：对于1–2片心肌组织，在一个35 mm的组织培养皿中进行分离时，溶液1、溶液2和溶液3的总用量分别约为15 mL、8 mL和5 mL。若需在多个培养皿中同时进行心肌细胞分离，应相应扩大试剂用量。切割溶液可冷冻保存于-20 ˚C，可存放数月。
3. 称取1 mg蛋白酶XXIV（参见 材料表) 加入预冷的15 mL离心管中，冰上保存备用。此为处理一个样本的用量，可根据需要按比例放大。切勿混合蛋白酶和胶原酶。
4. 称取 8 mg 胶原酶 CLSI（参见 材料表) 加入预冷的15 mL离心管中，冰上保存备用。此为处理一个样本的用量，可根据需要按比例放大。切勿混合蛋白酶和胶原酶。
   注意：佩戴口罩或在通风橱内操作，以避免吸入酶粉末。
   注意：不同批次的酶活性可能存在差异，因此最佳使用浓度可能有所不同，应在每次购入新批次酶时进行优化确定。¹⁶.

2. 心肌组织的保存与运输

1. 将人类心脏样本储存在冷却的、4 ˚C 的切割液中（表1）并以此条件运输。
2. 后续组织处理和振动切片均使用相同的溶液。
   注意：活检和手术获取的心脏样本应立即转移至4 °C的切割液中，可在4 °C下储存或运输，但在本方案应用前最长不超过36小时。

3. 组织的处理与切片

注意：组织切片方案遵循 Fischer 等人的方法¹⁵。

1. 组织块的修剪
   警告：人类心脏组织可能具有传染性。务必穿戴防护装备，并遵守所在机构的安全规定。小心处理使用过的刀片，并将其丢弃至安全容器中。
   1. 将标本放入盛有20 mL冷切割液的100 mm组织培养皿中，并置于4 °C冷却板上。
   2. 使用解剖刀去除多余的纤维化组织和心外膜脂肪。若为透壁标本，还需去除小梁及靠近心内膜的组织层。
      注：纤维化组织质地较硬，呈白色；脂肪通常较软，呈白色至黄色；小梁和心内膜组织层可通过其疏松的组织结构以及与心外膜层心肌相比不规则的纤维排列来识别。
   3. 为获得最佳振动切片效果，使用解剖刀从较大的组织标本上切取约8 mm × 8 mm × 8 mm的矩形组织块。对于较小的活检样本，可跳过此步骤，直接进行琼脂糖包埋。
2. 将心脏组织包埋于低熔点琼脂糖中
   1. 在玻璃烧杯中将400 mg低熔点琼脂糖溶于10 mL切割液中并煮沸。
      警告：佩戴手套和护目镜以防止烫伤。仅使用隔热防护装备操作高温玻璃器皿。
   2. 用10 mL注射器吸取热的溶解琼脂糖凝胶。密封注射器，并将其置于37 °C水浴中至少平衡15分钟。
   3. 使用镊子将修剪后的心脏标本或活检组织放入洁净的35 mm组织培养皿中，使心外膜朝下，并用无菌棉签吸除多余液体。
   4. 将已平衡的琼脂糖（步骤3.2.2）通过排空注射器的方式倾倒至组织上。倾倒过程中用镊子固定组织以防移动，并确保组织完全浸没于琼脂糖中。
   5. 立即将培养皿置于冰上，使琼脂糖凝固10分钟。
3. 心肌切片
   1. 将新的 刀片安装至振动切片机的刀片夹上，并在可能的情况下通过调节刀片的Z轴偏转进行校准。
      注：本方案使用配备红外辅助校准装置的振动切片机，以将刀片调整至水平位置并实现最小Z轴偏转（测量偏转<0.1 µm）。
   2. 使用解剖刀切取适合振动切片机标本夹的琼脂糖-组织块。为确保稳定性，请确保组织仍充分浸没于琼脂糖中（琼脂糖边缘≥8 mm）。
   3. 用少量氰基丙烯酸酯胶水和轻柔压力将琼脂糖块固定在标本夹上。
   4. 将带有组织的标本夹放入振动切片机的切片槽中。向槽内加入切割液，并在整个处理过程中通过在振动切片机外部冷却罐中添加碎冰维持温度在4–6 °C。
   5. 以≤0.1 mm/s的进刀速度、80 Hz的振荡频率、1.5 mm的横向振幅和15°的刀片角度，切出300 µm厚的切片。操作切片时应夹持琼脂糖部分而非组织本身，以避免组织损伤。如需保存，可将切片置于切割液中4 °C下最多保存2小时。
      注：心肌细胞平行于心外膜排列。因此，必须平行于心外膜切片，以避免心肌细胞过度损伤。建议弃去前1–3片切片，仅使用厚度均匀一致的切片用于后续分离。但对于小组织活检样本，仅需弃去第一片切片即可。
   6. 在标准光学显微镜下以40–100倍放大倍数检查心肌细胞的排列情况。

4. 组织消化

1. 将加热板放置在实验室摇床上，并升温至 37 °C。启动实验室摇床，转速设为 65 rpm。
2. 将蛋白酶（步骤 1.3 中制备）溶解于 2 mL 溶液 1（步骤 1.1 和 1.2）中，并在 37 °C 下孵育，直至使用。切勿将蛋白酶与胶原酶混合。
3. 将胶原酶（步骤 1.4 中制备）溶解于 2 mL 溶液 1（步骤 1.1 和 1.2）中，并在 37 °C 下孵育，直至使用。切勿将蛋白酶与胶原酶混合。
   警告：请佩戴护目镜和手套，因为溶解的酶可能造成皮肤和眼睛损伤。
4. 向含胶原酶的溶液（步骤 4.3 中制备）中加入氯化钙（CaCl₂），使其终浓度为 5 µM。
5. 使用镊子将振动切片机浴槽中的组织切片转移至盛有 5 mL 预冷切割液（步骤 1.1 和 1.2）的洁净 60 mm 组织培养皿中，并置于冰上保存。
6. 使用刀片或镊子小心去除心肌组织上的琼脂糖。
   注意：避免对心肌切片施加过度张力和剪切应力，以免损伤心肌细胞。
7. 进行初始洗涤时，将洁净的 35 mm 组织培养皿置于加热板上，并加入 2 mL 预热（37 °C）的溶液 1。用镊子将 1–2 片心肌切片转移至已准备好的培养皿中。使用 1 mL 移液器吸除溶液，并重复洗涤 2 次，以去除切割液残留物。
   注意：切勿吸除心脏切片。溶液和切片应始终保持在振荡加热板上 35 °C 的恒定温度。必要时可调节加热板温度。
8. 从培养皿中移除溶液 1，加入 2 mL 蛋白酶溶液（步骤 4.2）。在 65 rpm 转速下于加热板上孵育 12 分钟。
9. 使用 2 mL 预热的溶液 1（37 °C）洗涤 2 次。
10. 从培养皿中移除溶液 1，加入 2 mL 胶原酶溶液（步骤 4.3 和 4.4）。在 65 rpm 转速下于加热板上至少孵育 30 分钟。
11. 在 30、35、40 分钟等时间点，将培养皿置于光学显微镜下观察是否有游离的单个心肌细胞。操作应迅速，以避免溶液显著降温。
    注意：所需消化时间可能因组织构成和纤维化程度而异。一旦组织明显变软，并在轻柔牵拉时易于解离，即达到最佳消化时间。若有足够组织，可同时对多个切片进行不同消化时间的平行消化处理。
12. 当组织完成消化且可见单个心肌细胞（步骤 4.11）时，使用 2 mL 预热的溶液 2（37 °C）洗涤 2 次，然后再次加入 2 mL 溶液 2。

5. 组织解离

1. 用镊子小心地将消化后的组织切片中的纤维拉开，进行解离。
2. 使用一次性巴斯德吸管（开口直径 >2 mm）轻轻吹打数次。
   注意：使用镊子和吹打操作可能引起机械应力，导致心肌细胞损伤。然而，这是细胞分离的关键步骤。应使用精细镊子以尽量减少细胞损伤，并小心地将组织切片解离成更小的片段。
3. 在光学显微镜下检查是否已释放出杆状心肌细胞。

6. 生理钙浓度的重新引入

1. 在加热板上于 35 °C 条件下缓慢将钙浓度从 5 µM 提高至 1.5 mM，同时持续搅拌。使用 10 mM 和 100 mM 的 CaCl₂ 储存液。推荐步骤：20、40、80、100、150、200、400、800、1,200、1,500 µM。每步之间间隔 5 分钟孵育，使细胞逐步适应升高的钙浓度。
2. 钙浓度提升结束后，用镊子小心去除未消化的组织块，或通过孔径为 180 µm 的尼龙网筛过滤细胞悬液。

7. 去除机械去耦剂

1. 停止振荡，用1,000 µL移液器缓慢从顶部移除约三分之一的溶液（~700 µL）。避免吸出心肌细胞。
   注意：如果未消化的组织已被去除，心肌细胞将聚集在培养皿中央，便于吸取无细胞的上清液。若未发生此情况，则将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在35 °C静置沉降10分钟，然后吸除700 µL上清液并弃去，重悬细胞，再转移回35 mm组织培养皿，并继续执行步骤7.2。
2. 向细胞中加入700 µL溶液3，重新置于加热板上振荡，并孵育10分钟。
3. 重复步骤7.1和7.2。
4. 将悬液转移至15 mL离心管中，让心肌细胞在室温下静置沉降，时间不少于10分钟且不超过30分钟；或在50 × g 条件下离心1分钟。彻底移除上清液，并将细胞重悬于改良Tyrode溶液或所需的实验缓冲液中。
   注意：心肌细胞可在改良Tyrode溶液（表1）中于37 °C和5% CO₂条件下保存数小时后再使用。
5. 使用标准光学显微镜在40倍和200倍放大下检查细胞质量。
   注意：约30–50%的心肌细胞应呈杆状，表面光滑无膜泡，具有清晰的横纹结构。活细胞中仅有5–10%应出现自发性收缩。

结果

为验证分离效率，本方案应用于大鼠心肌组织，所得存活心肌细胞数量与通过冠状动脉灌流法及小块组织分离法（块状组织分离法）获得的数量进行比较。 图2）。心肌块分离和组织切片分离均来自同一心脏。然而，冠状动脉灌流分离则使用整个心脏。冠状动脉灌流主要获得杆状且具有横纹的心肌细胞。通过心肌切片分离得到的杆状细胞比例较低，但总数仍然较高。相比之下，从组织块分离后仅获得少量杆状细胞（图2A). 采用流式细胞术对结果进行定量比较。由于心肌细胞相对较大且具有横纹结构，其前向散射光和侧向散射光信号通常较强。利用这些特性，通过流式细胞分析仪并结合简单的设门策略，可对杆状心肌细胞进行计数，从而区分杆状与过度收缩或圆形的心肌细胞。补充图1。代表性散点图如图所示 图2B统计分析显示，从组织切片中分离得到的心肌细胞门CM1细胞数量显著高于从组织块中分离的结果（分别为41.5 ± 11.9% 与 7.89 ± 3.6%；n = 3次分离；p < 0.05）。 ...

讨论

尽管分离活体心肌细胞的技术已有40多年的历史，并且至今仍是心脏研究中许多实验方法的前提条件，但该技术仍然具有挑战性，结果难以预测。通过冠状动脉灌注酶溶液来分离心肌细胞的方法常用于小型动物心脏，可获得大量存活细胞。然而，该方法需要相对复杂的系统和专业技术。此外，由于人类组织样本通常体积较小或缺乏冠状动脉分支，大多不适合采用此法，因此亟需开发新的方法以分离人类心肌细胞。本文所述方案基于无创性制备薄层心脏组织切片，随后进行酶消化处理。该方法适用于动物心脏及人类心肌组织样本，例如左心室辅助装置植入术中获取的心尖组织芯、室间隔切除术中的心内膜心肌活检样本，或移植摘除的心脏（见补充表1），能够稳定地获得足量的存活且耐受钙离子的心肌细胞，可用于后续实验，如心肌细胞培养¹⁷。

与使用剪碎的组织块相比，采用振动切片机切割组织切片获得心肌细胞的得率更高，其主要原因可能是在切片过程中对心肌细胞的损伤程度较低。当无法进行冠状动脉灌注时，必须通过切片或剪碎组织样本来增加消化酶的作用接触面积。将组织切成约8 mm × 8 mm ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
2,3-丁二酮一肟	Carl Roth	3494.1	纯度>99%
牛血清白蛋白	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
肌酸一水合物	Alfa Aesar	B250009
葡萄糖	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-谷氨酸	Fluka Biochemica	49450
低熔点琼脂糖	Carl Roth	6351.5
MgCl2 × 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148
牛磺酸	Sigma Aldrich	T8691
染料
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
酶
I型胶原酶CLS	Worthington	LS004196	用于人组织，浓度为 4 mg/mL （活性：280 U/mg）
II型胶原酶CLS	Worthington	LS004176	用于大鼠组织，浓度为 1.5 mg/mL （活性：330 U/mg）
蛋白酶XIV	Sigma Aldrich	P8038	用于大鼠组织，浓度为 0.5 mg/mL （活性 ≥ 3.5 U/mg）
蛋白酶XXIV	Sigma Aldrich	P5147	用于人组织，浓度为 0.5 mg/mL （活性：7–14 U/mg）
材料
流式细胞仪（LSR Fortessa）	BD Bioscience	649225
离心管，15 mL	Corning	430790
离心管，50 mL	Corning	430829
小型摇床	Edmund Bühler	KS-15 B control	振荡方向：水平
一次性塑料巴斯德吸管	Carl Roth	EA65.1	用于细胞吹打时，仅使用尖端内径 ≥2 mm 的吸管
镊子	FST	11271-30
加热块	VWR	BARN88880030
尼龙网滤器，180 µm	Merck	NY8H04700
细胞培养皿 100，标准型	Sarstedt	83.3902
细胞培养皿 35，标准型	Sarstedt	83.3900
细胞培养皿 60，标准型	Sarstedt	83.3901
振动切片机（VT1200S）	Leica	1491200S001	配备 VibroCheck，用于红外辅助校正 z 轴偏转