从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

摘要

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（<50 mg），即可获得高产量的耐钙细胞（最多可达200个细胞/mg）。该方案适用于经历长达36小时冷缺血暴露的心肌组织。

摘要

从动物和人类心脏中分离心室心肌细胞是心脏研究中的一项基本方法。动物心肌细胞通常通过冠状动脉灌注消化酶进行分离。然而，人类心肌细胞的分离具有挑战性，因为人类心肌标本通常无法进行冠状动脉灌注，而其他替代分离方案所获得的活细胞产量较低。此外，人类心肌标本十分稀有，仅在具备现场心脏外科手术条件的机构中才能定期获得。这阻碍了从动物心肌细胞研究结果向人类心肌细胞的转化应用。本文介绍了一种可靠的实验方案，可高效地从人类和动物心肌组织中分离心室心肌细胞。为了在尽量减少细胞损伤的同时增加组织的表面积与体积比，使用振动切片机（vibratome）将心肌标本切成300 µm厚的组织切片。随后用蛋白酶和胶原酶对组织切片进行消化。本研究首先采用大鼠心肌组织建立该方案，并通过流式细胞术细胞计数法量化获得的存活且耐钙的心肌细胞产量。与常用的组织块法相比，本方法获得的杆状心肌细胞产量显著更高（41.5 ± 11.9 vs. 7.89 ± 3.6%，p < 0.05）。该方案进一步应用于衰竭和非衰竭的人类心肌组织，结果显示细胞产量与大鼠心肌组织相当，且再次显著高于组织块法（45.0 ± 15.0 vs. 6.87 ± 5.23 个细胞/mg，p < 0.05）。值得注意的是，采用本方案可从极少量组织（<50 mg）中分离出足够数量的存活人类心肌细胞（9–200 个细胞/mg）。因此，该方法适用于人类和动物心脏的健康及衰竭心肌组织。此外，即使人类心肌标本在低温停搏液中冷藏保存长达36小时，仍可从中分离出具有兴奋性和收缩功能的心肌细胞，这使得该方法对于不具备现场心脏外科手术条件的机构中的实验室尤为实用。

引言

一项开创性的技术为深入理解心肌细胞生理学铺平了道路，即从完整心脏中分离出存活的心室心肌细胞¹。分离的心肌细胞可用于研究正常细胞的结构与功能，或体内实验所导致的后果；例如，评估在心脏疾病动物模型中细胞电生理学或兴奋-收缩耦联的变化。此外，分离的心肌细胞还可用于细胞培养、药理学干预、基因转导、组织工程以及许多其他应用。因此，高效的心肌细胞分离方法对基础和转化心脏研究具有根本性的重要价值。

通常通过冠状动脉灌注含有粗制胶原酶和/或蛋白酶溶液的方法，从小型哺乳动物（如啮齿类动物）以及大型哺乳动物（如猪或狗）中分离心肌细胞。该方法被称为心肌细胞分离的“金标准”，可获得高达70%的活细胞得率²。该方法也已用于人类心脏，能够获得可接受的心肌细胞得率^3,4,5。然而，由于冠状动脉灌注仅在完整心脏或含有冠状动脉分支的大块心肌组织可获取时才可行，而大多数人类心脏标本体积较小且缺乏合适的血管结构，因此不适合采用此方法。因此，人类心肌细胞的分离具有较大挑战性。

人类心肌标本主要由大小不一的组织块（约 0.5 × 0.5 × 0.5 cm 至 2 × 2 × 2 cm....

方案

所有涉及大鼠的实验均经德国巴伐利亚州中弗兰肯动物护理与使用委员会批准。人类心脏组织样本的采集和使用均经埃尔朗根-纽伦堡大学和鲁尔大学波鸿分校的机构审查委员会批准。研究按照《赫尔辛基宣言》指南进行。患者在组织采集前均签署书面知情同意书。

雌性Wistar大鼠（150–200 g）购自商业供应商，通过腹腔注射100 mg/kg硫喷妥钠进行麻醉，随后采用颈椎脱位法处死，并行胸廓切开术切除心脏。人的心脏组织样本取自左心室心尖部核心组织（在植入机械辅助装置期间）、室间隔切除术、法洛四联症矫正手术，或来自移植摘除心脏的左心室游离壁。以下方案描述了从人心室组织中分离细胞的过程。大鼠心肌细胞的分离操作类似，但使用不同的酶（见 材料表）。该方案的示意图流程见 图1。

1. 缓冲液、溶液和酶的制备

1. 按所列清单准备缓冲液和溶液 表1.
2. 将溶液1、2、3及改良Tyrode's溶液预热至37 °C。切割溶液于4 °C保存，临用前取出。
   注意：对于1–2片心肌组织，在一个35 mm的组织培养皿中进行分离时，溶液1、溶液2和溶液3的总用量分别约为15 mL、8 mL和5 mL。若需在多个培养皿中同时....

结果

为验证分离效率，本方案应用于大鼠心肌组织，所得存活心肌细胞数量与通过冠状动脉灌流法及小块组织分离法（块状组织分离法）获得的数量进行比较。 图2）。心肌块分离和组织切片分离均来自同一心脏。然而，冠状动脉灌流分离则使用整个心脏。冠状动脉灌流主要获得杆状且具有横纹的心肌细胞。通过心肌切片分离得到的杆状细胞比例较低，但总数仍然较高。相比之下，从组织块分离后仅获得少量杆状细胞（图2A). 采用流式细胞术对结果进行定量比较。由于心肌细胞相对较大且具有横纹结构，其前向散射光和侧向散射光信号通常较强。利用这些特性，通过流式细胞分析仪并结合简单的设门策略，可对杆状心肌细胞进行计数，从而区分杆状与过度收缩或圆形的心肌细胞。补充图1。代表性散点图如图所示 图2B统计分析显示，从组织切片中分离得到的心肌细胞门CM1细胞数量显著高于从组织块中分离的结果（分别为41.5 ± 11.9% 与 7.89 ± 3.6%；n = 3次分离；p < 0.05）。 .......

讨论

尽管分离活体心肌细胞的技术已有40多年的历史，并且至今仍是心脏研究中许多实验方法的前提条件，但该技术仍然具有挑战性，结果难以预测。通过冠状动脉灌注酶溶液来分离心肌细胞的方法常用于小型动物心脏，可获得大量存活细胞。然而，该方法需要相对复杂的系统和专业技术。此外，由于人类组织样本通常体积较小或缺乏冠状动脉分支，大多不适合采用此法，因此亟需开发新的方法以分离人类心肌细胞。本文所述方案基于无创性制备薄层心脏组织切片，随后进行酶消化处理。该方法适用于动物心脏及人类心肌组织样本，例如左心室辅助装置植入术中获取的心尖组织芯、室间隔切除术中的心内膜心肌活检样本，或移植摘除的心脏（见补充表1），能够稳定地获得足量的存活且耐受钙离子的心肌细胞，可用于后续实验，如心肌细胞培养¹⁷。

与使用剪碎的组织块相比，采用振动切片机切割组织切片获得心肌细胞的得率更高，其主要原因可能是在切片过程中对心肌细胞的损伤程度较低。当无法进行冠状动脉灌注时，必须通过切片或剪碎组织样本来增加消化酶的作用接触面积。将组织切成约8 mm × 8 mm .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
2,3-丁二酮一肟	Carl Roth	3494.1	纯度>99%
牛血清白蛋白	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
肌酸一水合物	Alfa Aesar	B250009
葡萄糖	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-谷氨酸	Fluka Biochemica	49450
低熔点琼脂糖	Carl Roth	6351.5
MgCl2 × 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148
牛磺酸	Sigma Aldrich	T8691
染料
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
酶
I型胶原酶CLS	Worthington	LS004196	用于人组织，浓度为 4 mg/mL （活性：280 U/mg）
II型胶原酶CLS	Worthington	LS004176	用于大鼠组织，浓度为 1.5 mg/mL （活性：330 U/mg）
蛋白酶XIV	Sigma Aldrich	P8038	用于大鼠组织，浓度为 0.5 mg/mL （活性 ≥ 3.5 U/mg）
蛋白酶XXIV	Sigma Aldrich	P5147	用于人组织，浓度为 0.5 mg/mL （活性：7–14 U/mg）
材料
流式细胞仪（LSR Fortessa）	BD Bioscience	649225
离心管，15 mL	Corning	430790
离心管，50 mL	Corning	430829
小型摇床	Edmund Bühler	KS-15 B control	振荡方向：水平
一次性塑料巴斯德吸管	Carl Roth	EA65.1	用于细胞吹打时，仅使用尖端内径 ≥2 mm 的吸管
镊子	FST	11271-30
加热块	VWR	BARN88880030
尼龙网滤器，180 µm	Merck	NY8H04700
细胞培养皿 100，标准型	Sarstedt	83.3902
细胞培养皿 35，标准型	Sarstedt	83.3900
细胞培养皿 60，标准型	Sarstedt	83.3901
振动切片机（VT1200S）	Leica	1491200S001	配备 VibroCheck，用于红外辅助校正 z 轴偏转