在斑马鱼体内靶向移植的人类癌细胞的荧光功能化二氧化硅纳米颗粒研究

摘要

本文介绍了一种利用斑马鱼胚胎研究功能化纳米颗粒在体内靶向人类癌细胞能力的方法。该方法可用于评估和筛选出最适合在大型动物及临床试验中进一步测试的优化纳米颗粒。

摘要

开发能够检测、靶向并摧毁癌细胞的纳米颗粒在纳米医学领域备受关注。为了将纳米技术与其生物医学应用相衔接，需要借助体内动物模型。小鼠是临床前测试的传统动物模型，但其饲养成本相对较高，且由于每只母鼠产仔数量有限，实验周期较长。斑马鱼已成为发育生物学和生物医学研究（包括癌症研究）中一种强大的模型系统。特别是由于其具有光学透明性以及发育迅速的特点，斑马鱼胚胎非常适合用于实时体内监测癌细胞的行为及其与微环境的相互作用。本方法旨在依次将人源癌细胞和功能化纳米颗粒引入透明的Casper斑马鱼胚胎中，并实时监测纳米颗粒在体内的癌细胞识别与靶向过程。该优化后的实验方案表明，用叶酸基团功能化的荧光标记纳米颗粒能够特异性识别并靶向携带不同荧光染料标记的人源转移性宫颈上皮癌细胞。纳米颗粒的识别与靶向过程在注射后30分钟内即可发生。整个实验仅需饲养少数几对成年斑马鱼，且耗时不到4天即可完成。此外，斑马鱼胚胎缺乏功能性适应性免疫系统，因而可实现多种人源癌细胞的移植。因此，本文所述实验方案可用于在多种不同类型的人源癌细胞中测试纳米颗粒，有助于在特定癌症背景下筛选出最优纳米颗粒，为后续在哺乳动物及临床试验中的应用提供支持。

引言

开发能够检测、靶向并摧毁癌细胞的纳米颗粒，引起了物理学家和生物医学研究人员的广泛关注。纳米医学的兴起推动了多种纳米颗粒的发展，例如与靶向配体和/或化疗药物偶联的纳米颗粒^1,2,3。纳米颗粒所具备的附加特性使其能够与生物系统相互作用，高效且准确地感知和监测生物事件，同时兼具治疗功能。金纳米颗粒和氧化铁纳米颗粒主要分别用于计算机断层扫描和磁共振成像。而金纳米颗粒和氧化铁纳米颗粒的酶活性可通过比色法实现对癌细胞的检测，荧光纳米颗粒则非常适合体内成像应用⁴。其中，超亮荧光纳米颗粒尤为有利，因其能够在使用更少颗粒的同时实现早期癌症检测，并降低毒性⁵。

尽管具有这些优势，纳米颗粒仍需通过体内动物模型实验来筛选合适的纳米材料并优化合成工艺。此外，与药物类似，纳米颗粒也依赖动物模型进行临床前测试，以评估其有效性和毒性。目前最广泛使用的临床前模型是小鼠，作为一种哺乳动物，其饲养成本相对较高。在癌症研究中，通常使用基因工程小鼠或异种移植小鼠^6,7。这些实验周期通常持续数周至数月。特别是在癌症转移研究中....

方案

所有动物实验程序均经波士顿大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，方案编号：PROTO201800543。

1. 生成Casper斑马鱼胚胎

1. 选择成年个体 Casper 至少3月龄的鱼类用于自然繁殖以产生透明个体 Casper 斑马鱼胚胎
2. 晚上用养鱼用水填充双室交配箱，用隔板将上部水箱隔开，将一条雄鱼放入隔室的一侧，一条或两条雌鱼放入另一侧，用隔板将鱼隔开过夜。
3. 第二天早上8:00开灯后取出隔板。加入人工丰容植物，并将上层容器略微倾斜，形成浅水区域。让鱼类繁殖3-4小时。
4. 提起装有鱼类的交配箱上层腔室，并将其放回原来的鱼箱中。
5. 将底部腔室中的卵收集起来，通过滤网倾倒水以获取卵。将卵转移至无菌培养皿中，密度不超过每皿200枚卵。去除任何死亡或未受精的卵，并用新鲜的鱼水加满培养皿至三分之二容量。
   注意：受精且健康的卵应呈半透明且圆形。任何浑浊、发白或变形的卵均应去除。鱼水取自鱼类饲养设施中的鱼缸。
6. 将胚胎置于28.5 °C培养箱中过夜孵育。
7. 第二天早上按照上述标准方案漂白胚胎 斑马鱼手册¹⁶并将胚胎放回培养箱（可选步骤）。
8. 下午从培养箱中取出24 hpf的胚胎，用蛋白酶去除....

结果

图1 中的实验流程示意图展示了本研究的整体步骤。将透明的 Casper 成年雄鱼和雌鱼进行交配以获得胚胎（第1部分）。在受精后48小时（48 hpf），将表达RFP的HeLa细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊下方的血管化区域，未注射的胚胎作为对照组（第3部分）。对于具备显微注射经验的操作者而言，胚胎存活率通常较高，在35.5 °C培养箱中（该温度对斑马鱼胚胎并非最适，但为人类癌细胞存活与迁移所必需），至少有50%的移植癌细胞胚胎能够存活。HeLa细胞具有高度侵袭性，注射后8小时内即可侵入血管并扩散至胚胎尾部区域。移植后20–24小时，约50%的移植胚胎显示出HeLa细胞发生转移性扩散的迹象。选择癌细胞已转移至尾部的胚胎用于后续实验。在受精后72小时（72 hpf），对这些胚胎进行眼后注射，实验组注射蓝色荧光纳米颗粒（第4部分及图1B），对照组仅注射载体（图1

讨论

本文所述方案利用斑马鱼作为活体系统，用于检测纳米颗粒识别和靶向转移性人类癌细胞的能力。多个因素可能影响实验的成功实施。首先，胚胎必须在48小时（hpf）时完全发育。胚胎处于正确的发育阶段，才能耐受并存活人类癌细胞的移植。相比更年长且发育更成熟的胚胎，小于48 hpf的胚胎存活率显著降低。其次，应尽可能保持癌细胞的活性，确保其满足以下条件：1）处于指数生长期²¹；2）在移植前30分钟至1小时内新鲜收获；3）全程保持温暖。第三，注射针头不得堵塞。在将细胞混合物装入针头前，需将HeLa细胞上下吹打至少20次。第四，移植人类癌细胞和注射纳米颗粒应使用不同类型的针头。用于人类细胞移植的针头相对较宽，并带有一定角度以避免细胞堵塞；而用于纳米颗粒注射的针头则较尖且细。第五，注射位置不同。人类细胞的移植位置为卵周腔，而纳米颗粒注射时针头应插入眼部后方富含毛细血管的区域。最后，操作者的熟练程度至关重要。经验丰富的操作者可准确地将HeLa细胞注入卵周腔，而缺乏经验者常将肿瘤细胞注入卵黄区域，导致肿瘤细胞几乎无法在鱼体内扩散。同样，由经验丰富的操作者处理时，胚胎的存活率显著更高，至少有50%的癌细胞移植胚胎能够.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	KSE scientific	BMK-A1705
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
计算机和显示器	ThinkCentre	X000335
DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）	Corning	10-013-CV	由 Fisher 销售
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0926
鱼类培养箱	VWR	35960-056
血细胞计数板	Fishersci 品牌	02-671-51B
磁力架	World Precision Instruments	M10
微量移液器加样头	Eppendorf	E5242956003	由 Fisher 销售
显微操作仪	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
拉针仪	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 荧光显微镜	Olympus	MVX-10
P200 加样头	Fishersci 品牌	07-200-293
PBS（杜氏磷酸盐缓冲液，1X）	Corning	21-030-CV	由 Fisher 销售
培养皿	Corning	SB93102	由 Fisher 销售
塑料移液管	Fishersci 品牌	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
气动皮升注射泵	World Precision Instruments	SYSPV820
蛋白酶 K（Pronase）	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche 产品，由 Sigma 生产，Fisher 销售
刀片	Fishersci 品牌	12-640
SZ51 解剖显微镜	Olympus	SZ51
三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulfonate）	Western Chemicals	NC0872873	由 Fisher 销售
胰蛋白酶-EDTA	Corning	MT25053CI	由 Fisher 销售
镊子	Fishersci 品牌	12-000-122