方法文章

一种用于毒性测试中真实、重复吸入空气颗粒物暴露的气液界面支气管上皮模型

DOI：

10.3791/61210

⸱

2020年5月13日

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1National Institute for Public Health and the Environment (RIVM), 2Institute for Risk Assessment Sciences (IRAS)

本文内容

摘要

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本文描述了一种体外支气管模型的细胞培养及暴露方法，可用于对颗粒物进行真实、重复的吸入暴露，以开展毒性测试。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了进行空气颗粒物的毒性测试，已开发出气液界面（ALI）暴露系统，用于体外实验以模拟真实的暴露条件。这对细胞培养模型提出了特定要求。许多细胞类型在暴露于空气时会受到负面影响（例如干燥），仅能维持数天的存活率。这限制了这些模型中可采用的暴露条件：通常在短时间内以气溶胶形式（即含有颗粒的液滴，会迅速沉降）施加相对较高的浓度。此类实验条件无法反映长期暴露于低浓度颗粒物的真实情况。为克服这些局限性，研究采用了一种人支气管上皮细胞系Calu-3。该细胞可在气液界面条件下培养数周，同时保持健康的形态、稳定的单层结构以及紧密连接。此外，该支气管模型适用于利用气液界面暴露系统检测反复暴露于低浓度、真实水平空气颗粒物的影响。该系统采用持续气流，不同于其他通过单次雾化产生气溶胶的气液界面暴露系统。因此，持续气流系统适用于对空气颗粒物进行反复和长期暴露，同时持续监测颗粒特性、暴露浓度及递送剂量。综上所述，该支气管模型结合持续气流暴露系统，能够模拟可用于毒性测试的真实、反复吸入暴露条件。

引言

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肺部容易受到空气中颗粒物吸入暴露的影响。为了评估空气中颗粒物的潜在毒性，研究人员已开发出气液界面（ALI）暴露系统1,2,3,4,5。与传统的通过培养基进行的淹没式暴露相比，ALI暴露系统能够提供更相关且更接近真实的暴露模型，因为后者会改变颗粒物的特性和动力学特征6。ALI暴露系统对细胞培养模型提出了特定要求，因为在顶侧缺乏培养基，因此也缺乏营养物质。许多细胞模型在空气环境中培养和暴露时会受到不利影响（例如干燥），仅能维持数天的存活率。这限制了这些模型中可采用的暴露条件：通常只能在短时间内施加相对高浓度的颗粒云（即含有颗粒的液滴，会迅速沉降）。此类实验条件无法反映长期低浓度颗粒物暴露的真实情况，因此其结果的相关性可能受到质疑。为克服这些局限性，研究人员对由人支气管上皮细胞系Calu-3组成的支气管模型的培养与暴露方案进行了优化7。

目前用于气液界面（ALI）暴露的大多数体外肺模型均以其他细胞系（如 A549、BEAS-2B 和 16HBE14o-（16HBE））或原代细胞为基础8。这些细胞系的缺点在于，在气液界面培养时仅能维持数天的存活率。此外，部分细胞系在培养超过5天后会出现过度生长现象。最后，A549细胞缺乏功能性紧密连接，因此无法形成模拟肺组织所必需的紧密屏障9,10。原代上皮细胞可能是ALI暴露的一个较好选择，因其可在气液界面培养数周。然而，原代细胞存在批次间差异，培养难度较高，且成本高于细胞系，因此在毒性测试和高通量筛选中适用性较低。在比较不同的人支气管上皮细胞系（16HBE、Calu-3、H292 和 BEAS-2B）时，只有 Calu-3 细胞满足真实、重复进行 ALI 暴露所需的所有标准：在气液界面培养数周仍可保持活性，具有高屏障完整性，不会过度生长，且易于培养和维护。Calu-3 细胞来源于腺癌，能够分泌黏液11,12。关于这些细胞是否能够形成纤毛，目前研究结果尚不一致11,13。Calu-3 细胞也是研究呼吸道合胞病毒（RSV）感染的合适模型，该病毒可感染纤毛化的气道上皮细胞14。

除了细胞模型外，还使用自动化暴露系统（AES）进行气溶胶的气液界面暴露15,16。AES的优势在于其采用持续气流将细胞模型暴露于气溶胶中。这与其他气液暴露系统不同，后者通常在短时间内以较高浓度的气溶胶云形式（即含有颗粒的液滴迅速沉降）进行暴露17,18,19。这类气溶胶云系统无法反映长期低浓度颗粒物暴露的真实情况。通过AES施加持续气流，可使细胞模型在较长时间内暴露于低浓度颗粒物中，更接近实际暴露条件。相较于气溶胶云系统，AES的另一优势在于可连接颗粒物表征仪器，实现对颗粒物粒径、数量浓度和质量随时间变化的实时测量。AES的局限性在于其使用的气流速率相对较高，通常在10 mL/min至100 mL/min之间。

方案

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1. 准备细胞培养基（CCM）

  1. 准备一瓶 500 mL 添加了谷氨酰胺的最低必需培养基（MEM）。
  2. 加入 5 mL 青霉素-链霉素溶液（即 100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）。
  3. 加入 5 mL 非必需氨基酸（NEAA）溶液。
  4. 加入 10 mL 两性霉素 B（可选）。
  5. 加入 50 mL 胎牛血清（FBS，经热灭活处理，请参照 ATCC 的热灭活操作规程；(https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, 第 19 页)）。

2. Calu-3 细胞的传代培养

注意：Calu-3 细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养于 T75 或 T175 细胞培养瓶中。细胞每 7 天在 60–80% 汇合度时传代一次，每 2–3 天更换一次完全培养基（CCM）。弃去旧培养基，加入新鲜 CCM（T25 = 5 mL，T75 = 15 mL，T175 = 25 mL），然后将培养瓶放回培养箱。细胞在冻存或用于实验前，至少应传代 2 次，且总传代次数不应超过 25 次。

  1. 在光学显微镜下观察，确认培养瓶中细胞融合度是否达到60–80%。
  2. 将完全培养基（CCM）从培养瓶中倒出。
  3. 用5 mL不含钙和镁的1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞两次，每次洗涤后弃去HBSS。HBSS可去除抑制胰蛋白酶活性的血清成分。
  4. 向T75培养瓶中加入3 mL胰蛋白酶-EDTA（T175培养瓶加4 mL），然后将培养瓶放回37 °C、5% CO2的培养箱中孵育10–15分钟。10分钟后检查，确保细胞已从瓶壁脱离。若细胞融合度>80%，使用0.05%胰蛋白酶可能无法有效消化，可改用0.25%胰蛋白酶。
  5. 向培养瓶中加入6 mL完全培养基（CCM）（即最初加入胰蛋白酶-EDTA体积的两倍），轻轻摇动培养瓶以充分混匀。此步骤可确保CCM中的FBS中和胰蛋白酶活性，从而终止其对细胞的作用。若胰蛋白酶与细胞接触时间过长，细胞在接种至新培养瓶后将无法重新贴壁。
  6. 将培养瓶中的全部内容物转移至50 mL离心管中。
  7. 以130 × g离心5分钟，确保离心机已正确配平。
  8. 将含有细胞的离心管重新置于无菌条件下，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。可先倾倒大部分上清液，再用移液器吸除剩余液体，确保不扰动沉淀。
  9. 用移液器反复吹打，将细胞沉淀重悬于1 mL CCM中，直至细胞完全分散（即无可见沉淀或细胞团块）。可根据需要加入更多CCM以稀释细胞悬液。
  10. 使用血细胞计数板，在1 mL CCM中对活细胞和死细胞进行计数。如需便于准确计数，可将细胞悬液用3或4 mL CCM稀释后计数。
  11. 将细胞重悬于所需体积的CCM中，并将细胞悬液接种至各培养瓶。为在一周后达到约80%融合度，T75培养瓶接种2 × 106个细胞，T175培养瓶接种6 × 106个细胞。
  12. 轻轻摇动培养瓶，然后将其放回37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养。
  13. 每2–3天更换新鲜CCM，当细胞融合度达到60–80%时进行传代培养。

3. 将Calu-3细胞接种至培养小室

注意：可提供不同孔径的插入式培养小室。较小的孔径（例如 0.4 µm）具有优势，即细胞更容易生长，并且在浸没条件下培养 5 天后即可形成良好的屏障，这一点可通过跨上皮电阻（TEER）进行测定。然而，在研究颗粒物跨膜转运时，这些小孔径会截留颗粒物，因此不适用。因此，通常选择较大孔径（例如 3 µm）来测试颗粒物。当使用较大孔径时，细胞需要更长的培养时间（例如在浸没条件下培养 7–10 天）才能达到良好的 TEER 值。

  1. 按照步骤 2.1–2.10 制备已知浓度的细胞悬液。
  2. 将细胞用预热的 CCM 稀释至浓度为 5 × 105 个细胞/mL（用于 6 孔插件）或 2.5 × 105 个细胞/mL（用于 12 孔插件）。
  3. 取带有插件的细胞培养板，并置于无菌条件下。
  4. 向基底外侧加入 2 mL 预热的 CCM（用于 6 孔插件）或 1 mL（用于 12 孔插件）。添加培养基时，用镊子取出插件。
  5. 通过吹打轻轻混匀细胞悬液。 将 1.0 mL（用于 6 孔插件）或 500 µL（用于 12 孔插件）细胞悬液（相当于 100,000 个细胞/cm2）小心加入孔径为 0.4 µm 的细胞培养插件膜上表面。 对于 3.0 µm 孔径的插件，应将细胞密度增加至 128,000 个细胞/cm2。
  6. 盖好细胞培养板，于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。
  7. 每 2–3 天更换一次 CCM。
  8. 在浸没条件下继续培养细胞 7 天，直至细胞融合，然后转入气液界面（ALI）条件下继续培养。
  9. 测量跨上皮电阻（TEER）。
    1. 取一台配备 Chopstick 电极组的上皮细胞伏特计，并在前一晚对电池系统进行充电。
    2. 将伏特计从充电器上断开，并连接 Chopstick 电极。
    3. 用 70% 乙醇清洁电极。
    4. 将电极插入 CCM 中：较长电极插入外侧培养基直至接触培养皿底部，较短电极插入培养基中但不接触膜。
    5. 首先使用一个无细胞的空插件进行测量。待读数稳定后记录电阻值（单位为欧姆）。该值为空白插件膜本身的电阻（即空白电阻）。
    6. 对每个插件重复测量，并从总电阻中减去空白电阻，以获得真实电阻值。
    7. 数据分析时，将电阻值乘以插件的表面积，转换为 Ω × cm2。对于 6 孔插件，表面积为 4.67 cm2。例如，若测得电阻为 600 欧姆，背景空白为 120 欧姆，则净电阻为 480 欧姆，再乘以 4.67 cm2，得到总电阻为 2,241.6 Ω × cm2。为继续实验，TEER 值应 >1,000 Ω × cm2。
  10. 移除插件顶端（即腔面上侧）的 CCM。
  11. 向培养孔的基底外侧（即细胞培养插件下方）加入 2 mL 预热的 CCM（用于 6 孔插件）或 1 mL（用于 12 孔插件）。CCM 应从底部接触膜，但不得渗漏至插件顶部。
  12. 此时，细胞顶端暴露于空气中，此状态称为在气液界面（ALI）条件下培养。
  13. 在 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中，于 ALI 条件下继续培养细胞 7 天，之后方可进行暴露处理。
  14. 每 2–3 天更换一次基底外侧的 CCM。细胞在 ALI 条件下可使用长达 6 周。

4. 准备暴露装置

注意：第5–7节描述了使用自动暴露系统（AES，参见材料表）进行颗粒物暴露的准备工作。颗粒物雾化与表征的装置也适用于其他厂商的气液界面（ALI）暴露系统。以下以颗粒物暴露为例进行说明。此类系统也可用于其他类型的暴露，如致敏剂、香烟烟雾和柴油机尾气暴露。图1展示了AES及暴露模块。图2展示了包含所有其他仪器在内的暴露装置示意图。

  1. 使用 AES 开始暴露实验之前，需将系统连接至多种仪器以测量气溶胶特性；这些参数在气溶胶进入暴露柜前的旁路气流中进行测量。
    注意：使用分流器将旁路气流连接至暴露表征设备。通常使用以下设备：扫描电迁移粒径谱仪（SMPS）、光学粒径谱仪（OPS）、冷凝粒子计数器（CPC）和锥形元件振荡微天平（TEOM）。SMPS 和 OPS 每小时测量一次，共用来自分流器的同一根管路。CPC 和 TEOM 进行连续测量，数据均记录在 Squirrel 2020 型数据记录仪上。此外，在受控的相对湿度（40–70%）和温度（21–23 °C）条件下，使用微量天平测定重量法质量浓度。每次暴露前后均对聚四氟乙烯（Teflon）滤膜进行称重，以确认暴露浓度。为捕集排出气体，使用高效颗粒空气（HEPA）过滤器。包含工程纳米材料（ENM）悬浮液和雾化器的整个装置均置于通风柜内，以防止人员暴露。AES 可用于测试多种不同类型的 ENM，包括金属和金属氧化物。
  2. 在暴露前短时间内配制纳米材料悬浮液。通常先配制 1% 的储备溶液。例如，将 100 mg 纳米材料悬浮于 10 mL 纯水中。
    注意：对于 DQ12 暴露，使用 300 mg 可达到约 2 µg/cm2 的沉积量。该剂量可用于单次暴露，或分多次重复暴露使用（例如，300 mg 悬浮于 30 mL 中用于单次暴露；或在连续三周内每天新鲜配制 2.15 mL 悬浮液，其中含 21.5 mg 纳米材料）。每次暴露当天需新鲜配制悬浮液，并使用探头式超声仪超声处理 16 分钟。随后通过加入纯水，将 1% 储备液调整至总体积 100 mL。
  3. 将 ENM 悬浮液置于带盖的小瓶中，并放入磁力搅拌子以防止颗粒沉降。通过细管将小瓶连接至蠕动泵，并调节流速至 25 mL/h。
  4. 将蠕动泵连接至喷嘴，并调节参数以实现持续气溶胶化。
  5. 喷嘴安装在一根长 60 cm 的铝管（混合室，直径 15 cm，加热至 60 °C）上。该装置通过一根长 1.5 米、直径 15 cm 的铜管与 AES 相连。AES 顶部装有撞击器，用于去除所有粒径大于 2.5 µm 的气溶胶颗粒。
  6. 通过两个质量流量控制器（MFC）将喷嘴连接至 3 bar 的压缩空气，以实现悬浮液的雾化。其中一路气流为 14 L/min，用于驱动喷嘴；另一路 MFC 控制管内空气的混合。
  7. 在暴露开始前一天开启 AES，使暴露柜温度升至 37 °C。
  8. 在暴露开始前 2 小时开启柜内的气流和湿度控制，使湿度达到 85%。同时开启细胞插入物所在暴露腔室的加热装置。
  9. 开启石英微天平（QCM），并通过软件将其初始值设为 0，随后开始数据记录。每 10 秒测量一次质量，结果以 ng/cm2 表示。
  10. 将细胞培养基置于水浴中加热至 37 °C（约需 20–30 分钟）。

5. 准备Calu-3细胞以进行暴露

注意：使用 AES 进行典型的 ALI 暴露时，需要 15–20 个具有融合细胞层的插件。其中包括 3 个洁净空气对照组、3 个培养箱对照组（处理方式与其他插件相同，但不在 AES 中进行暴露）、6–8 个用于气溶胶暴露的插件（具体数量取决于使用 0、1 或 2 个微量天平的情况）、1–3 个用于对照测量的插件（如最大 LDH 释放量），以及 3 个备用插件，以防部分插件的 TEER 值不足。细胞的 TEER 值应高于 >1,000 Ω × cm2 才可继续实验。

  1. 暴露第一天，用 CCM 洗涤细胞一次，检查细胞形态，并使用伏特欧姆计测量细胞模型的跨上皮电阻（TEER）。细胞应形成无间隙的紧密单层。
  2. 向 6 孔板/12 孔板的基底侧加入 2 mL/1 mL 无 FCS 的 HEPES 缓冲 CCM，将带有细胞的培养插件转移至新板中。
    注意：暴露期间，AES 中无 CO2。因此，在运输和暴露过程中使用 HEPES 缓冲培养基（25 mM HEPES）。该培养基适用于 AES 中暴露的细胞以及培养箱对照组细胞。
  3. 若将细胞培养物运送至 AES 所需时间超过 5 分钟，运输过程中应将细胞置于 37 °C 的便携式培养箱中。

6. 曝光过程中 AES 的操作

  1. 在AES中，使用不含胎牛血清（FCS）的HEPES缓冲CCM填充暴露模块。CCM的用量取决于所使用的设备型号和细胞培养插件类型。需注意，为维持细胞在气液界面（ALI）状态，培养基应达到膜的底部，但不应渗漏至膜的顶部。当使用6孔插件时，向暴露模块中加入6 mL HEPES缓冲CCM。
  2. 使用无菌镊子将带有细胞的插件从培养板转移至暴露模块中。检查细胞基底侧是否存在气泡，并清除插件顶端侧的任何CCM。若基底侧存在气泡，可轻轻转动插件直至气泡排出。将含有CCM的培养板保留在培养箱中，用于暴露后的转移。
  3. 使用触摸屏设置暴露时间、气流速率以及静电沉积增强参数。该显示屏还可用于监测湿度和温度。通常选择4小时的暴露时间，插件处气流速率为50 mL/min，温度为37 °C，湿度为85%。
    注意：第一层的模块（图1）用于洁净空气暴露；该层中的插件作为洁净空气暴露对照。第二层和第三层的其他模块可用于气溶胶暴露，其中包括两个用于石英晶体微天平（QCM）的模块，以实现在线沉积量测量。
  4. 在开始暴露前应进行泄漏测试。泄漏量必须低于5 mL/min。请遵循AES显示屏上的操作说明。当泄漏测试完成后，即可开始暴露实验。若发现泄漏，应检查管路连接。
  5. 暴露结束后，打开AES模块门，打开暴露模块，将细胞培养插件放回细胞培养板中，并将培养板转移至便携式培养箱。
  6. 收集来自暴露模块（即暴露样本）和培养板（即培养箱对照）中的培养基，用于后续分析，如乳酸脱氢酶（LDH）测定。
  7. 返回细胞培养实验室后，将细胞培养插件转移至含有新鲜标准CCM的培养板中。将培养板放入培养箱中，直至下一次暴露或分析前。
  8. 在最后一次暴露日结束后，将插件继续置于培养箱中过夜。
  9. 在最后一次暴露的次日，向顶端侧加入CCM，使用伏特计测量跨上皮电阻（TEER）。分别收集顶端侧和基底侧的CCM，用于细胞因子分析。
  10. 移除所有CCM，并通过向顶端侧添加增殖试剂等方法进行细胞活力检测。

7. 清洁 AES

  1. 用水填充暴露模块，静置1分钟，然后移除水。接着用70%乙醇填充模块，静置10分钟，然后移除乙醇。同样使用70%乙醇清洁暴露喇叭口。
  2. 停止85%湿度控制，但将柜内温度保持在37 °C，以用于下一次实验。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提供了一种在气液界面（ALI）培养和暴露人支气管上皮细胞的方法，该方法模拟了现实条件下重复吸入暴露的情况，可用于毒性测试。细胞模型和暴露系统的特性对于建立可用于重复暴露的现实吸入暴露模型至关重要。以下展示了这些特性的结果。

细胞模型的要求与选择

在选择合适的细胞模型时，必须考虑以下特征：

  1. 细胞模型应能够形成具有功能性紧密连接的融合单层，以模拟肺屏障。
  2. 细胞模型在反复暴露于经调节（温度和湿度）的空气时，应表现出最佳性能。
  3. 细胞模型应对暴露产生响应。

本研究始于四种不同的人支气管上皮细胞系：16HBE、Calu-3、H292 和 BEAS-2B。这些细胞系均被广泛用于纳米材料和化学品的毒性测试。在上述四种细胞系中，仅有 Calu-3 细胞满足所有前述要求。Calu-3 细胞可形成具有紧密连接的单层结构（图3），其屏障功能在培养期间通过跨上皮电阻（TEER）测定显示稳定；而其他细胞系则未能形成有效屏障，或在气液界面（ALI）培养时屏障功能下降（图4）。此外，H292 和 BEAS-2B 细胞在长期培养时倾向于过度生长，形成多层细胞结构。传统的浸没式细胞培养与气液界面培养存在显著差异，因为在气液界面条件下，营养物质仅从基底侧供给，而细胞顶侧则暴露于干燥环境中。这些条件可能对细胞模型造成应激，可通过随时间测定细胞活力来观察。16HBE、H292 和 BEAS-2B 细胞在气液界面培养时均表现出乳酸脱氢酶（LDH）释放增加，而 Calu-3 细胞仅表现出轻微的 LDH 释放（图5）。

接下来，测试了Calu-3模型对物质的反应。作为阳性对照物质，通过雾化方式将LPS施加至模型的顶侧，沉积剂量为0.25 µg/cm2。Calu-3细胞对脂多糖（LPS）产生反应，表现为乳酸脱氢酶（LDH）释放量和肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放量增加（图6）。

最后，将 Calu-3 单层细胞暴露于石英二氧化硅（DQ12）纳米材料（IOM，爱丁堡）。结晶型二氧化硅可引发矽肺病，还可能引起肺部肿瘤。因此，国际癌症研究机构（IARC）已将结晶型二氧化硅归类为第 I 类人类致癌物20。结晶型二氧化硅的作用机制被认为与其活性表面引发的持续性炎症有关21,22,23。多项针对大鼠和小鼠的体内研究报道，在吸入暴露于结晶型二氧化硅后，可诱导产生炎症及组织病理学改变，包括肿瘤和纤维化24,25,26,27,28,29。这些效应均在重复暴露和/或长期随访后被观察到。本研究采用 Calu-3 模型，以探究是否可利用可在气液界面（ALI）进行重复暴露的体外模型模拟体内研究中的观察结果。

Calu-3 细胞每周暴露 5 天、每天 4 小时，连续 3 周暴露于 DQ12。沉积剂量使用石英晶体微天平（QCM）进行测定。平均每日沉积剂量为 120 ng/cm2，累积剂量为 1.6 µg/cm2，与体内实验中可诱导效应的剂量相似。其他颗粒物特性见表 1。暴露 3 周后，与洁净空气对照组相比，DQ12 对跨上皮电阻（TEER）、细胞活力以及单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1）的释放均未引起显著影响（图 7）。鉴于根据体内实验数据预期 DQ12 具有更高的毒性，因此采用欧盟项目 GRACIOUS（交付成果 5.3）优化的无细胞检测方案检测了该颗粒物的反应活性。结果显示，DQ12 批次的反应活性低于预期（图 8），与阳性对照颗粒炭黑（CB）相比，其活性低几个数量级。这种反应活性的缺乏可能解释了在 Calu-3 模型中未观察到毒性反应的原因。

用于药物分析和质量控制的自动化溶出度测试系统示意图。
图1：自动化暴露系统（AES）。
左侧图为带触摸面板的机柜外部结构。AES分为三层，均配有暴露模块：顶层用于洁净空气暴露，中层和底层用于气溶胶暴露。右侧图为暴露模块，其中放置带有细胞的插件。请点击此处查看该图的放大版本。

Vitrocell气液界面系统示意图，用于颗粒暴露实验的气溶胶装置。
图2：暴露装置的示意图。
从左至右：1）通过蠕动泵将纳米材料悬浮液连接至喷雾喷嘴；2）利用压缩空气，喷雾喷嘴将纳米材料悬浮液雾化，并通过混合室将气溶胶导入气溶胶暴露系统（AES）；3）在进入AES之前，连接气溶胶表征仪器：扫描电迁移粒径谱仪（SMPS）、光学粒子计数器（OPS）、凝聚粒径增长计数器（CPC）和振荡微量天平（TEOM）。请点击此处查看此图的放大版本。

细胞单层的荧光显微镜图像，显示细胞骨架排列，标尺为 50 µm。
图3：Calu-3细胞在气液界面（ALI）培养10天后的代表性图像。
Calu-3细胞在气液界面（ALI）培养10天后的荧光显微镜图像。紧密连接蛋白ZO-1呈绿色染色，细胞核呈蓝色染色。请点击此处查看该图的放大版本。

随时间变化的支气管细胞系TEER测量图，显示气液界面培养的影响。
图4：四种不同细胞系在21天培养期间的跨上皮电阻（TEER）。
16HBE、Calu-3、H292和BEAS-2B细胞系在培养21天期间的TEER值：前7天为浸没培养，随后14天为气液界面（ALI）培养。TEER值已校正插入物的背景电阻，并乘以插入物的表面积。符号和误差线代表六个插入物的平均值和标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

显示16HBE、Calu-3、H292和BEAS-2B细胞系随时间相对LDH释放量的柱状图。
图5：四种不同细胞系在21天培养期间的LDH释放情况。
16HBE、Calu-3、H292和BEAS-2B细胞在培养21天期间的LDH释放量：前7天为浸没培养，随后14天在气液界面（ALI）培养。所示LDH值相对于每种细胞类型的LDH最大释放量进行归一化。符号和误差线代表五个重复培养插件的平均值和标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

WST、LDH 和 TNF-α 释放的柱状图；LPS 暴露效应；实验结果。
图6：暴露于LPS的Calu-3细胞的细胞效应。
通过气溶胶雾化方式将Calu-3细胞暴露于0.25 µg/cm2的LPS中。（A）WST-1转化率。（B）LDH释放量。（C）LPS暴露后TNF-α的释放量。符号和误差线表示三个重复样本的平均值和标准差。请点击此处查看该图的高清版本。

暴露于DQ12后的TEER、LDH和MCP-1释放；柱状图比较；细胞反应分析。
图7：暴露于DQ12纳米材料后Calu-3细胞的细胞效应。
Calu-3细胞每日暴露4小时，每周5天，持续3周，每日剂量约为120 ng/cm2，累积剂量为1.6 µg/cm2。(A) TEER值。(B) LDH释放量。(C) 暴露于DQ12后的MCP-1释放量。所有符号和误差线表示对照组三个插入物及DQ12暴露组六个插入物的平均值和标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

DQ12 与炭黑的反应活性-强度图，浓度对反应活性的影响，数据图表。
图 8：DQ12 的无细胞反应活性。
将 DQ12 与 2ʹ,7ʹ-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针共同孵育，以检测其表面反应活性。以炭黑（CB）颗粒作为阳性对照。与 CB 相比，DQ12 的表面反应活性非常低。请点击此处查看该图的放大版本。

颗粒物质量 (µg/m3)颗粒物数量 (#/cm3)迁移率粒径 (nm)几何标准偏差光学粒径 (µm)
2969 (418)83983 (10215)66.62.51.1 (1.3)

表1：DQ12暴露特征。 数值以平均值±标准差（括号内）表示。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种在气液界面（ALI）条件下培养人支气管上皮细胞，并将该支气管模型暴露于气溶胶或气体中的方法。使用Calu-3细胞的优势在于其能够形成紧密连接，保持单层结构，耐受气流冲击，并可在ALI条件下持续培养数周，而许多其他细胞类型（如16HBE、H292和BEAS-2B）则无法做到。采用VITROCELL®自动暴露系统（AES）的优势在于，可在连续气流条件下以低浓度施加暴露，从而实现更接近真实且具有相关性的暴露条件。

与使用单次雾化悬浮液的云式系统相比，持续流动系统（如 AES）具有优势3,32。持续流动更接近真实情况，且可控制流速、湿度和温度等多种变量。此外，可通过施加电场来增强颗粒沉积。最后，气溶胶的粒径、数量浓度和质量等特性可实现在线监测。其缺点是持续流动系统比云式系统更复杂。因此，开展聚焦于气溶胶颗粒特性及插入物上递送剂量的预实验非常重要。随后可调整颗粒的初始起始浓度和 AES 设置，以实现在细胞上达到目标剂量33。根据所测试颗粒类型的差异，气溶胶生成方法也可能不同。静电沉积的适用性取决于颗粒类型，对金属颗粒效果最佳。对于表面带正电荷的颗粒，应施加负静电场，反之亦然。

对于任何气液暴露实验而言，暴露浓度的选择都可能具有挑战性。在DQ12的暴露实验中，目标是在每周暴露5天、每天4小时、持续3周的条件下，实现累计总剂量达到1 µg/cm2。该剂量与体内实验中引发效应的剂量相似21,25,27,32,33。在实际进行暴露时，不同暴露日之间存在一定的差异。尽管实际沉积剂量为1.6 µg/cm2，高于预期的1 µg/cm2，但该剂量可能仍不足以在Calu-3模型中观察到显著效应。在洁净空气暴露组与DQ12暴露组之间，仅观察到跨上皮电阻（TEER）、细胞活力和细胞因子反应方面的微小差异，且这些差异无统计学意义。DQ12暴露3周未在Calu-3细胞中诱导出显著效应的一个可能解释是，Calu-3模型中缺乏巨噬细胞。在DQ12被摄取后，巨噬细胞可能产生促炎性细胞因子，从而影响Calu-3细胞。另一个可能的解释是，实验所用的DQ12批次反应性低于预期。当使用LPS作为阳性对照物质时，Calu-3细胞表现出响应，表现为乳酸脱氢酶（LDH）释放量和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）释放量的增加。这表明该模型具备检测毒性的能力。

Calu-3 细胞 模型具有诸多优势，已在结果部分进行了讨论。此外，当在气液界面（ALI）长期培养时，Calu-3 细胞可生长出纤毛或纤毛样结构13，并产生黏液11,12,13。尽管具有这些优势，该模型在生理相关性方面仍存在局限性。Calu-3 细胞系来源于腺癌组织，而 16HBE 和 BEAS-2B 细胞系则来源于健康组织。遗憾的是，后两者不适合反复进行气液界面暴露，因为它们无法在长时间培养中维持稳定的单层结构。Calu-3 模型的另一局限性在于其仅代表单一细胞类型。在人类肺部，存在多种相互作用且对暴露刺激反应各异的细胞类型。吸入的颗粒物会因其空气动力学粒径不同而在肺部不同区域沉积，这些颗粒物即在此处接触由 Calu-3 模型所模拟的上皮细胞屏障。在人体肺部，肺泡巨噬细胞会被吸引至颗粒物周围，将其吞噬并清除出肺部。巨噬细胞还在颗粒物暴露引发的炎症反应中发挥关键作用。因此，目前正致力于通过添加原代巨噬细胞来扩展 Calu-3 模型，以更真实地模拟肺屏障。然而，巨噬细胞的缺点是在气液界面共培养于 Calu-3 细胞上层时，其存活时间仅约为 7 天。因此，需每周重新添加巨噬细胞，以将现有的 Calu-3 模型转变为共培养模型。目前，共培养方案的优化工作正在进行中。

综上所述，Calu-3 支气管模型适用于对香烟烟雾化学物质和脂多糖（LPS）等部分可溶性物质的气溶胶进行重复暴露研究。这些可溶性物质可显著诱导 Calu-3 细胞产生细胞因子反应。而对于柴油机尾气颗粒和 DQ12 等不溶性颗粒的检测，则需要采用共培养模型，因为巨噬细胞在颗粒物暴露诱导效应的过程中发挥着关键作用。

对于所述的暴露实验，使用了带有3.0 µm孔径的插入式培养膜。选择此类插入膜的主要原因是能够检测纳米材料的跨膜转运。当使用更小的0.4 µm孔径时，颗粒聚集体将无法穿过插入膜。使用较大孔径的缺点是细胞需要更长时间才能生长至融合，且通过光学显微镜观察细胞形态更为困难。为确认细胞是否形成融合的单层，实验开始前经上皮电阻（TEER）应>1,000 Ω × cm2。

综上所述，本文介绍的Calu-3支气管模型适用于对气溶胶进行重复暴露，至少可持续3周。该模型能够在持续气流条件下培养和暴露，且可检测支气管上皮的毒性反应。

披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作由欧盟项目PATROLS（基于生理学的纳米材料危害真实评估工具）和荷兰卫生、福利与体育部（项目编号：V/050012）资助。我们谨向Yvonne Staal博士和Jan van Benthem博士致以诚挚感谢，感谢他们对本文稿的审阅与建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01 M NaOHSigma AldrichS5881
0.1 M（10倍浓缩）PBSGibco14200-059
2’,7’二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH）2-DASigma AldrichD6883
3-吗啉代苯并恶嗪亚胺盐酸盐（SIN-1盐酸盐）Abcamab141525
两性霉素B赛默飞世尔科技公司15290
自动暴露装置Vitrocell
细胞增殖试剂 WST-1罗氏11644807001
离心Eppendorf
CPCTSI公司，美国明尼苏达州圣保罗市3022
细胞毒性检测试剂盒 LDH罗氏11644793001
DQ12IOM纳米材料
ELISA Ready-SET-GoFischer Scientific88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2美国佛罗里达州世界精密仪器公司EVOM2-STX2
FBSGreiner bio-one758093
分流器TSI公司，美国明尼苏达州圣保罗市model 3708
荧光素二乙酸酯（F-DA）Sigma AldrichF7378
HBSS赛默飞世尔科技公司14175
光学显微镜OlympusCKX41
质量流量控制器MFC，Bronkhorst，荷兰
甲醇（分析纯）Sigma Aldrich34860
微量天平萨托瑞斯，哥廷根，德国ME-5
最低必需培养基（MEM）+ GlutaMAX赛默飞世尔科技公司41090
非必需氨基酸（NEAA）赛默飞世尔科技公司11140
OPSTSI公司，美国明尼苏达州圣保罗市3339
青霉素/链霉素赛默飞世尔科技公司15140
无酚红 MEMGibco10500-064
纯水默克MilliQ
SMPSTSI公司，美国明尼苏达州圣保罗市3936
喷雾喷嘴Schlick，科堡，德国
聚四氟乙烯滤膜帕尔R2PJ46
TEOMRupprecht &帕塔什尼克 纽约州，美国系列 1400
组织培养瓶赛默飞世尔科技公司690175, 658175, 660175
Transwell 小室康宁3460, 3462
胰蛋白酶-EDTA赛默飞世尔科技公司25300
台盼蓝Sigma AldrichT8154

参考文献

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Calu 3

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