通过股动脉入路将人用尺寸冠状动脉支架植入大鼠腹主动脉

摘要

本方案描述了通过股动脉入路，将人冠状动脉支架植入载脂蛋白E基因敲除（apoE^-/-）背景大鼠腹主动脉的方法。与其他动物模型相比，小鼠模型具有通量高、可重复性强、操作和饲养简便，以及分子标志物资源广泛等优势。

摘要

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）联合冠状动脉支架植入是冠心病介入治疗的金标准。支架内再狭窄（ISR）由支架内新生内膜组织过度增殖引起，限制了支架的长期疗效。已有多种动物模型被用于阐明支架内再狭窄（ISR）的病理生理机制，其中猪冠状动脉模型和兔髂动脉模型应用最为广泛。小鼠模型具有通量高、操作与饲养简便、可重复性强以及分子标志物资源丰富等优势。载脂蛋白E缺陷（apoE^-/-）小鼠模型已被广泛用于心血管疾病的研究。然而，由于需将支架微型化后方可植入小鼠体内，这会显著改变其机械性能和（潜在的）生物学特性。采用apoE^-/-大鼠模型可克服上述局限，因为apoE^-/-大鼠既能允许植入临床规格的人用冠状动脉支架，同时又具备致动脉粥样硬化的表型，因此是研究支架植入后支架内再狭窄（ISR）的理想且可靠的模型。本文详细描述了通过股动脉入路，将市售的人用冠状动脉支架植入具有apoE^-/-遗传背景大鼠腹主动脉的技术方法。

引言

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）联合冠状动脉支架植入是冠状动脉疾病介入治疗的金标准¹。然而，支架的长期疗效可能受到支架内再狭窄（ISR）的限制，其主要由支架内新生内膜组织过度增殖所致^2,3。ISR可能需要再次干预，包括冠状动脉旁路移植术或再次PCI。已有多种动物模型被用于ISR的研究，每种模型均有其优缺点。目前最常用的猪冠状动脉和兔髂动脉模型虽然在支架植入后可形成与人类高度相似的病变^4,5，但其主要缺点在于大型动物饲养成本高，尤其在长期研究中带来诸多后勤困难，同时在操作和设备方面也存在局限性。此外，可用于猪和兔细胞蛋白的抗体种类有限。相比之下，小鼠模型具有通量高、可重复性好、操作简便、饲养成本低等显著优势。同时，针对小鼠的抗体种类也更为丰富。然而，尽管载脂蛋白E缺陷型（apoE^-/-）小鼠已被广泛用于动脉粥样硬化研究^6,7,8，但其并不适用于ISR研究，因为植入小鼠体内的支架必须微型化，这可能改变支架的力学性能。此外，小鼠主动脉壁厚度在幼年小鼠中约....

方案

实验均依照德国动物福利法（TSchG）以及关于用于科学目的动物保护的欧盟指令2010/63/EU进行。本研究已获得德国北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局（Recklinghausen，德国）政府动物护理与使用委员会的正式批准（方案编号：AZ 87-51.04.2010.A065）。研究方案符合《实验动物护理与使用指南》的要求。术后镇痛治疗依据德国实验动物科学学会（GV-SOLAS）以及兽医疼痛治疗倡议组织的建议执行。

1. 基本技术与常见操作步骤

1. 使用纯合子 apoE^-/- Sprague-Dawley 大鼠。采用标准方法¹⁷确定每只动物的基因型。
2. 将动物饲养在相同条件下（21 °C ± 2 °C，60% ± 5% 湿度，12 小时光照/12 小时黑暗循环），并确保自由饮水和进食。
3. 所有操作均在清洁但非无菌条件下进行。
4. 大鼠麻醉后，在手术显微镜下以 16 倍放大倍数进行所有操作。
5. 使用棉签进行压迫止血。用乳酸林格液浸湿的纱布块（5 cm × 5 cm）有助于保持腹股沟区域湿润。
6. 按照废弃物处理规定处置使用过的材料。

2. 手术前准备

1. 在开始手术前准备好兽用药物。所有溶液均应保持在室温....

结果

本方案描述了通过股动脉入路在大鼠腹主动脉中植入支架的方法（图1）。该动物模型的第一个核心要点是，它能够实现人用尺寸冠状动脉支架的植入。 commercially available 的压握式球囊支架可成功置入大鼠腹主动脉中。因此，支架释放的基本原理与人类临床应用完全相同。使用大鼠的另一优势在于可获得多种基因修饰品系，例如 commercially available 的apoE^-/-大鼠。

我们最近采用该方法评估了载脂蛋白E缺陷型大鼠是否比野生型大鼠更容易发生支架内再狭窄（ISR）²¹。在总共42只接受支架植入的雄性大鼠中，有36只大鼠在术后28天完成了研究方案（存活率=85.71%）。其中各有2只大鼠分别因血管闭塞失败、内出血和支架血栓形成而死亡。另有3只动物的支架无法进行分析，原因是组织在处理过程中严重受损或破坏，最可能发生在锯切操作期间。我们建议在研究开始前对该技术进行多次练习训练。

在其余3.......

讨论

本方案描述了将人用尺寸的冠状动脉支架植入apoE^-/-大鼠腹主动脉的操作步骤。有几个技术要点值得强调。首先，应避免支架尺寸与主动脉尺寸不匹配。植入过小的支架可能导致支架贴壁不良，而植入过大的支架则可能引起血管过度扩张、撕裂和损伤。因此，我们建议使用直径在2.0至2.5 mm之间的支架，并将植入压力控制在推荐范围内，避免过度扩张支架。最合适的植入压力通常由支架制造商提供。应尽量避免对股静脉以及随后的下腔静脉造成过度损伤，因为这些血管壁极薄，极易受损，可能导致难以控制的出血。股动脉可通过其搏动与股静脉相区分，操作时应仔细观察。另一个需要注意的问题是在导入导丝和/或球囊导管时可能发生动脉损伤或夹层。在导入球囊导管时，可通过丝线吊带远端牵拉并固定股动脉，从而最大限度减少动脉夹层的发生。当遇到阻力时，必须立即停止推进器械。此时，通过拇指与食指之间的轻微移动可帮助调整器械方向。根据我们的经验，这种情况最常发生在腹股沟韧带稍下方，以及当髂总动脉接近分叉处并进一步深入腹膜后间隙时。操作者在达到稳定的存活率之前必然需要经历一定的学习曲线，但积累一定经验后，平均手术时间约为20分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
饮食
SNIFF 高脂饮食 + 氯吡格雷 (15 mg/kg)	SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest	定制制备	西方饮食
药物与麻醉剂
布托啡诺	Essex Pharma	997.00.00
ISOFLO（异氟烷蒸汽）蒸发器	Eickemeyer	4802885
异氟烷	Forene Abbott	B 506
等渗 (0.9%) NaCl 溶液	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
乳酸林格液	Baxter Deutschland GmbH	3775380
(S)-氯胺酮	CEVA Germany
赛拉嗪	Medistar Germany
耗材
10 mL 注射器	BD Plastipak	4606108V
2 mL 注射器	BD Plastipak	4606027V
6-0 普罗lene 缝线	ETHICON	N-2719K
4-0 丝线缝线	Seraflex	IC 158000
Bepanthen 眼鼻软膏	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
棉纱布拭子	Fuhrmann GmbH	32014
Durapore 丝质胶带	3M	1538-1
聚醇皮肤消毒液	Antiseptica GmbH	72PAH200
Sterican 针头 18 G	B. Braun	304622
Sterican 针头 27 3/4 G	B.Braun	4657705
纸巾	市售
手术器械
Graefe 镊子（弯型）x1	Fine Science Tools Inc.	11151-10
Graefe 镊子（直型）	Fine Science Tools Inc.	11050-10
Mathieu 持针器	Fine Science Tools Inc.	12010-14
剪刀	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Semken 镊子	Fine Science Tools Inc.	11008-13
小型手术剪（弯型）	Fine Science Tools Inc.	14029-10
小型手术剪（直型）	Fine Science Tools Inc.	14028-10
标准齿镊	Fine Science Tools Inc.	11000-12
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools Inc.	15000-08
设备
解剖显微镜	Leica MZ9
温控加热垫	Sygonix	26857617
支架植入设备
药物洗脱支架 Xience 2.25 mm × 8 mm	Abbott Vascular USA	1009544-18
导丝 Fielder XT PTCA 导丝：0.014" × 300 cm	ASAHI INTECC CO., LTD Japan	AGP140302
充盈注射系统	Abbott 20/30 Priority Pack	1000186
组织处理与分析
30% H2O2	Roth	9681	组织学
乙醇	Roth	K928.1	组织学
吉姆萨伊红亚甲蓝染液	Merck	109204	组织学
图形绘图板	WACOM Europe GmbH	CTL-6100WLK-S
Roti Histofix，4% 缓冲甲醛	Roth	P087	组织学
Technovit 9100	Morphisto	12225.K1000	组织学