需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过股动脉入路将人用尺寸冠状动脉支架植入大鼠腹主动脉

5.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61442

⸱

2020年11月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Angiology, and Critical Care, University Hospital RWTH Aachen, 2Department for Operative Intensive Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 3Institute for Pathology "Victor Babes"

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了通过股动脉入路，将人冠状动脉支架植入载脂蛋白E基因敲除（apoE-/-）背景大鼠腹主动脉的方法。与其他动物模型相比，小鼠模型具有通量高、可重复性强、操作和饲养简便，以及分子标志物资源广泛等优势。

摘要

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）联合冠状动脉支架植入是冠心病介入治疗的金标准。支架内再狭窄（ISR）由支架内新生内膜组织过度增殖引起，限制了支架的长期疗效。已有多种动物模型被用于阐明支架内再狭窄（ISR）的病理生理机制，其中猪冠状动脉模型和兔髂动脉模型应用最为广泛。小鼠模型具有通量高、操作与饲养简便、可重复性强以及分子标志物资源丰富等优势。载脂蛋白E缺陷（apoE-/-）小鼠模型已被广泛用于心血管疾病的研究。然而，由于需将支架微型化后方可植入小鼠体内，这会显著改变其机械性能和（潜在的）生物学特性。采用apoE-/-大鼠模型可克服上述局限，因为apoE-/-大鼠既能允许植入临床规格的人用冠状动脉支架，同时又具备致动脉粥样硬化的表型，因此是研究支架植入后支架内再狭窄（ISR）的理想且可靠的模型。本文详细描述了通过股动脉入路，将市售的人用冠状动脉支架植入具有apoE-/-遗传背景大鼠腹主动脉的技术方法。

引言

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）联合冠状动脉支架植入是冠状动脉疾病介入治疗的金标准1。然而，支架的长期疗效可能受到支架内再狭窄（ISR）的限制，其主要由支架内新生内膜组织过度增殖所致2,3。ISR可能需要再次干预，包括冠状动脉旁路移植术或再次PCI。已有多种动物模型被用于ISR的研究，每种模型均有其优缺点。目前最常用的猪冠状动脉和兔髂动脉模型虽然在支架植入后可形成与人类高度相似的病变4,5，但其主要缺点在于大型动物饲养成本高，尤其在长期研究中带来诸多后勤困难，同时在操作和设备方面也存在局限性。此外，可用于猪和兔细胞蛋白的抗体种类有限。相比之下，小鼠模型具有通量高、可重复性好、操作简便、饲养成本低等显著优势。同时，针对小鼠的抗体种类也更为丰富。然而，尽管载脂蛋白E缺陷型（apoE-/-）小鼠已被广泛用于动脉粥样硬化研究6,7,8，但其并不适用于ISR研究，因为植入小鼠体内的支架必须微型化，这可能改变支架的力学性能。此外，小鼠主动脉壁厚度在幼年小鼠中约为50 µm，老年小鼠中可达85 µm9，支架植入时需使用低至2 atm的压力，可能导致支架贴壁不良10。相比之下，大鼠可植入 commercially available human coronary stents（市售人用冠状动脉支架），且在主动脉支架植入后表现出与较大动物相似的血管愈合过程，该现象最早由Langeveld等11报道。该技术最初需采用经腹入路，必须物理性缩窄主动脉以实现血流的暂时中断。为避免由此可能引起的血管损伤和炎症反应，后续研究改进为经髂动脉入路，该方法还显著提高了动物的存活率12。

由于野生型大鼠不会发生动脉粥样硬化病变13，研究人员已利用核酸酶技术（如转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）14、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）15以及锌指核酸酶（ZF）16）成功构建了apoE-/-大鼠。自2011年起，apoE-/-大鼠已实现商业化供应。由于具有促动脉粥样硬化背景，apoE-/-大鼠可用于更真实地评估人尺寸冠状动脉支架，尤其是在支架内再狭窄（ISR）方面的研究。

本文所述方法采用经股动脉入路，并使用一种 commercially available 的细支架梁钴铬合金药物洗脱支架（DES），但该方法也可用于其他类型支架的研究，例如裸金属支架（BMS）或可生物降解支架。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

实验均依照德国动物福利法（TSchG）以及关于用于科学目的动物保护的欧盟指令2010/63/EU进行。本研究已获得德国北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局（Recklinghausen，德国）政府动物护理与使用委员会的正式批准（方案编号：AZ 87-51.04.2010.A065）。研究方案符合《实验动物护理与使用指南》的要求。术后镇痛治疗依据德国实验动物科学学会（GV-SOLAS）以及兽医疼痛治疗倡议组织的建议执行。

1. 基本技术与常见操作步骤

  1. 使用纯合子 apoE-/- Sprague-Dawley 大鼠。采用标准方法17确定每只动物的基因型。
  2. 将动物饲养在相同条件下（21 °C ± 2 °C，60% ± 5% 湿度，12 小时光照/12 小时黑暗循环），并确保自由饮水和进食。
  3. 所有操作均在清洁但非无菌条件下进行。
  4. 大鼠麻醉后，在手术显微镜下以 16 倍放大倍数进行所有操作。
  5. 使用棉签进行压迫止血。用乳酸林格液浸湿的纱布块（5 cm × 5 cm）有助于保持腹股沟区域湿润。
  6. 按照废弃物处理规定处置使用过的材料。

2. 手术前准备

  1. 在开始手术前准备好兽用药物。所有溶液均应保持在室温，除非另有说明。
  2. 在手术开始前30分钟，皮下注射 0.03–0.05 mg/kg 的丁丙诺啡。
  3. 通过腹腔注射（S）-氯胺酮（100 mg/kg体重）和赛拉嗪（8 mg/kg体重）对大鼠进行麻醉。
  4. 使用电子天平测量大鼠的体重。
  5. 将大鼠置于加热垫上，并用医用胶带固定其四肢。将大鼠体位调整为左后肢充分伸展，并尽可能与脊柱成一直线，使股动脉与主动脉之间形成一条直线，以利于球囊支架顺利通过主动脉分叉处。
  6. 通过吸入1.5 vol%异氟烷（溶于97.5%氧气中，流速为2 L/min）维持麻醉。
    注意：无需插管，让大鼠自主呼吸。
  7. 涂抹眼膏以防止在无意识状态下发生眼部损伤。
  8. 剃除大鼠腹股沟及下腹部的毛发，并用聚维酮碘溶液对相应皮肤区域进行消毒。
  9. 在开始手术前，通过夹捏尾尖和趾间组织检查麻醉深度是否足够。

3. 手术

  1. 在左侧腹股沟处做一个长约 0.5‒1 cm 的正中切口，切开皮肤及下方筋膜。
  2. 钝性分离并深入探查，直至识别出搏动的左侧股动脉。
  3. 使用极细的镊子，轻柔地清除股动脉周围的结缔组织。注意避免损伤股神经及位于动脉内侧的股静脉。
  4. 游离约 1 cm 长的股动脉。将镊子尖端小心地置于血管下方，轻柔抬起血管。
  5. 将两段 4-0 丝线分别穿过动脉远端和近端下方，形成套索。将每根套索的两端夹在手术钳的钳臂之间，利用手术钳控制动脉。轻柔牵拉并提起套索，以暂时阻断血流。
    注意：操作应迅速，避免长时间使用止血带导致组织损伤。
  6. 使用锐利的显微剪刀，在股动脉中段行动脉切开术。
  7. 通过动脉切口插入导丝。当导丝到达近端丝线套索处时，移动手术钳以松解丝线张力，继续将导丝向腹主动脉方向推进。
    注意：使用导丝剪刀将导丝剪短，以便于操作。
  8. 将导丝近端置于膈肌与肾动脉之间。
    注意：导丝推进过深可能造成主动脉或心脏损伤。建议至少在最初几只动物实验中打开腹腔，以确认导丝和支架位置适当。
  9. 将一个压握在球囊上的冠状动脉支架（尺寸为 2.25 mm x 8 mm，最大不超过 2.5 mm x 8 mm）沿导丝经动脉切口送入股动脉，并推进至腹主动脉。
  10. 将支架置于主动脉分叉上方、肾动脉下方。使用注气注射器系统将球囊导管充气至 12 atm，持续 15 秒，以释放支架。
  11. 排空球囊导管，并根据所用支架制造商的建议维持负压。
  12. 缓慢撤出已排空的导管，同时保留支架在原位。
  13. 在撤出导管前，用手术钳夹紧切口上方的丝线环以产生张力，再次阻断血流。随后取出球囊导管，并立即在近端结扎血管。
  14. 结扎近端和远端的丝线环，以结扎股动脉，并确认动脉切口处止血完全。侧支动脉将保证肢体的持续灌注。
  15. 使用 10-0 不可吸收缝线缝合覆盖动脉的肌肉层及皮肤切口。

4. 支架植入后动物护理

  1. 手术后立即让大鼠在配备加温空气（30‒35 °C）和供氧装置的特殊重症监护笼中恢复 60 分钟。
  2. 密切观察动物，直至其完全恢复意识，随后将大鼠转移至普通笼具中饲养，并自由供应饮水和食物。
  3. 在临床评估下，术后 72 小时内每 6–12 小时皮下注射一次 0.03–0.05 mg/kg 的丁丙诺啡（溶于 500 µL NaCl 中）以提供镇痛。
  4. 将食物中添加氯吡格雷（15 mg/kg），以预防植入支架发生血栓。
  5. 为促进高胆固醇血症状态及斑块形成，自出生后 6–8 周开始喂食西方饮食，并持续至实施安乐死为止。如需对照，可设一组喂食普通大鼠饲料的动物作为对照组。

5. 组织采集与处理

  1. 在预定时间点开始组织外植前，根据IACUC指南对动物实施安乐死。在观察期结束时，取支架植入的主动脉进行组织学分析。
  2. 通过腹部正中切口打开腹腔，取出植入支架的主动脉节段以及相邻的非支架植入部分主动脉，每段长约0.5 cm。
  3. 将组织置于4%中性缓冲甲醛溶液中固定24小时。
  4. 将带有支架的动脉组织包埋于塑料介质中，并根据标准方案进行组织学和免疫组织化学染色18,19。

6. 组织形态计量学分析

  1. 使用连接到计算机的显微镜及配套的图像分析软件，对支架植入主动脉近端、中段和远端的连续切片进行组织形态计量学分析。
  2. 利用图形绘图板勾画外弹力板（EEL，位于外膜与中膜之间）、内弹力板（IEL，位于中膜与新生内膜之间）以及管腔的轮廓。基于上述轮廓，通过软件计算EEL面积、IEL面积和管腔面积。
  3. 计算支架内再狭窄（ISR）的横截面百分比：
    用于计算管腔与IEL面积比值的ISR公式，展示一个数学方程。
  4. 计算总新生内膜面积（Ai）：
    解剖学中的面积比方程；数学公式；IEL面积与管腔面积比值分析。
  5. 测量每根支架梁处的新生内膜厚度（NIT），即支架梁与管腔之间的距离；在支架梁之间测量NIT时，取IEL与管腔之间的距离。
    注：也可按以下公式计算NIT：
    用于计算指数的NIT方程，科学公式图像，简洁的教育资源。
    其中PL和PIEL分别为管腔和内弹力板周长20。
  6. 根据研究需求进行其他附加分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本方案描述了通过股动脉入路在大鼠腹主动脉中植入支架的方法（图1）。该动物模型的第一个核心要点是，它能够实现人用尺寸冠状动脉支架的植入。 commercially available 的压握式球囊支架可成功置入大鼠腹主动脉中。因此，支架释放的基本原理与人类临床应用完全相同。使用大鼠的另一优势在于可获得多种基因修饰品系，例如 commercially available 的apoE-/-大鼠。

我们最近采用该方法评估了载脂蛋白E缺陷型大鼠是否比野生型大鼠更容易发生支架内再狭窄（ISR）21。在总共42只接受支架植入的雄性大鼠中，有36只大鼠在术后28天完成了研究方案（存活率=85.71%）。其中各有2只大鼠分别因血管闭塞失败、内出血和支架血栓形成而死亡。另有3只动物的支架无法进行分析，原因是组织在处理过程中严重受损或破坏，最可能发生在锯切操作期间。我们建议在研究开始前对该技术进行多次练习训练。

在其余3...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案描述了将人用尺寸的冠状动脉支架植入apoE-/-大鼠腹主动脉的操作步骤。有几个技术要点值得强调。首先，应避免支架尺寸与主动脉尺寸不匹配。植入过小的支架可能导致支架贴壁不良，而植入过大的支架则可能引起血管过度扩张、撕裂和损伤。因此，我们建议使用直径在2.0至2.5 mm之间的支架，并将植入压力控制在推荐范围内，避免过度扩张支架。最合适的植入压力通常由支架制造商提供。应尽量避免对股静脉以及随后的下腔静脉造成过度损伤，因为这些血管壁极薄，极易受损，可能导致难以控制的出血。股动脉可通过其搏动与股静脉相区分，操作时应仔细观察。另一个需要注意的问题是在导入导丝和/或球囊导管时可能发生动脉损伤或夹层。在导入球囊导管时，可通过丝线吊带远端牵拉并固定股动脉，从而最大限度减少动脉夹层的发生。当遇到阻力时，必须立即停止推进器械。此时，通过拇指与食指之间的轻微移动可帮助调整器械方向。根据我们的经验，这种情况最常发生在腹股沟韧带稍下方，以及当髂总动脉接近分叉处并进一步深入腹膜后间隙时。操作者在达到稳定的存活率之前必然需要经历一定的学习曲线，但积累一定经验后，平均手术时间约为20分钟。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们谨向安吉拉·弗赖恩德女士致以诚挚感谢，感谢她在包埋和切片制备过程中提供的宝贵技术支持。我们还要感谢实验室动物科学研究所的塔德乌什·斯托平斯基先生 & 实验外科对兽医工作的深刻指导与帮助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
饮食
SNIFF 高脂饮食 + 氯吡格雷 (15 mg/kg)SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest定制制备西方饮食
药物与麻醉剂
布托啡诺Essex Pharma997.00.00
ISOFLO（异氟烷蒸汽）蒸发器Eickemeyer4802885
异氟烷Forene AbbottB 506
等渗 (0.9%) NaCl 溶液DeltaSelect GmbHPZN 00765145
乳酸林格液Baxter Deutschland GmbH3775380
(S)-氯胺酮CEVA Germany
赛拉嗪Medistar Germany
耗材
10 mL 注射器BD Plastipak4606108V
2 mL 注射器BD Plastipak4606027V
6-0 普罗lene 缝线ETHICONN-2719K
4-0 丝线缝线SeraflexIC 158000
Bepanthen 眼鼻软膏Bayer Vital GmbH6029009.00.00
棉纱布拭子Fuhrmann GmbH32014
Durapore 丝质胶带3M1538-1
聚醇皮肤消毒液Antiseptica GmbH72PAH200
Sterican 针头 18 GB. Braun304622
Sterican 针头 27 3/4 GB.Braun4657705
纸巾市售
手术器械
Graefe 镊子（弯型）x1Fine Science Tools Inc.11151-10
Graefe 镊子（直型）Fine Science Tools Inc.11050-10
Mathieu 持针器Fine Science Tools Inc.12010-14
剪刀Fine Science Tools Inc.14074-11
Semken 镊子Fine Science Tools Inc.11008-13
小型手术剪（弯型）Fine Science Tools Inc.14029-10
小型手术剪（直型）Fine Science Tools Inc.14028-10
标准齿镊Fine Science Tools Inc.11000-12
Vannas 弹簧剪Fine Science Tools Inc.15000-08
设备
解剖显微镜Leica MZ9
温控加热垫Sygonix26857617
支架植入设备
药物洗脱支架 Xience 2.25 mm × 8 mmAbbott Vascular USA1009544-18
导丝 Fielder XT PTCA 导丝：0.014" × 300 cmASAHI INTECC CO., LTD JapanAGP140302
充盈注射系统Abbott 20/30 Priority Pack1000186
组织处理与分析
30% H2O2Roth9681组织学
乙醇RothK928.1组织学
吉姆萨伊红亚甲蓝染液Merck109204组织学
图形绘图板WACOM Europe GmbHCTL-6100WLK-S
Roti Histofix，4% 缓冲甲醛RothP087组织学
Technovit 9100Morphisto12225.K1000组织学

参考文献

  1. Patel, M. R., et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for Thoracic Surgery, American Heart Association, American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Society for Cardiovasular Angiography and Interventions, Society of Cardiovascular Computed Tomography, and Society of Thoracic Surgeons. Journal of the American College of Cardiology. 69 (17), 2212-2241 (2017).
  2. Virmani, R., Farb, A. Pathology of in-stent restenosis. Current Opinion in Lipidology. 10 (6), 499-506 (1999).
  3. Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal of Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
  4. Perkins, L. E. Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drug-eluting stent systems. Veterinary Pathology. 47 (1), 58-76 (2010).
  5. Kim, W. H., et al. Histopathologic analysis of in-stent neointimal regression in a porcine coronary model. Coronary Artery Disease. 11 (3), 273-277 (2000).
  6. Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
  7. Breslow, J. L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8314-8318 (1993).
  8. Knowles, J. W., Maeda, N. Genetic modifiers of atherosclerosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (11), 2336-2345 (2000).
  9. Wheeler, J. B., Mukherjee, R., Stroud, R. E., Jones, J. A., Ikonomidis, J. S. Relation of murine thoracic aortic structural and cellular changes with aging to passive and active mechanical properties. Journal of the American Heart Association. 4 (3), 001744(2015).
  10. Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
  11. Langeveld, B., et al. Rat abdominal aorta stenting: a new and reliable small animal model for in-stent restenosis. Journal of Vascular Research. 41 (5), 377-386 (2004).
  12. Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. Journal of Surgical Research. 166 (1), 9(2011).
  13. Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
  14. Wei, S., et al. Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques in partially ligated carotid arteries. Atherosclerosis. 243 (2), 589-592 (2015).
  15. Zhao, Y., et al. Hyperlipidemia induces typical atherosclerosis development in Ldlr and Apoe deficient rats. Atherosclerosis. 271, 26-35 (2018).
  16. Ekuni, D., et al. Occlusal disharmony accelerates the initiation of atherosclerosis in apoE knockout rats. Lipids in Health and Disease. 13 (144), 13(2014).
  17. Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports. 9 (1), 39950(2019).
  18. Malik, N., et al. Intravascular stents: a new technique for tissue processing for histology, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy. Heart. 80 (5), 509-516 (1998).
  19. Kumar, A. H., McCauley, S. D., Hynes, B. G., O'Dea, J., Caplice, N. M. Improved protocol for processing stented porcine coronary arteries for immunostaining. Journal of Molecular Histology. 42 (2), 187-193 (2011).
  20. Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 18(2004).
  21. Cornelissen, A., et al. Apolipoprotein E deficient rats generated via zinc-finger nucleases exhibit pronounced in-stent restenosis. Scientific Reports. 9 (1), 54541(2019).
  22. Ritskes-Hoitinga, M. G. T., Jensen, T. L., Mikkelsen, L. F. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Elsevier Academic Press. Chapter 4.3 567-599 (2012).
  23. Rune, I., et al. Long-term Western diet fed apolipoprotein E-deficient rats exhibit only modest early atherosclerotic characteristics. Scientific Reports. 8 (1), 23835(2018).
  24. Daemen, J., et al. Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxel-eluting stents in routine clinical practice: data from a large two-institutional cohort study. Lancet. 369 (9562), 667-678 (2007).
  25. Cornelissen, A., Vogt, F. J. The effects of stenting on coronary endothelium from a molecular biological view: Time for improvement. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (1), 39-46 (2019).
  26. Mori, H., et al. Pathological mechanisms of left main stent failure. International Journal of Cardiology. 263, 9-16 (2018).
  27. Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circulation Research. 25 (6), 677-686 (1969).
  28. Lowe, H. C., James, B., Khachigian, L. M. A novel model of in-stent restenosis: rat aortic stenting. Heart. 91 (3), 393-395 (2005).
  29. Unthank, J. L., Nixon, J. C., Lash, J. M. Early adaptations in collateral and microvascular resistances after ligation of the rat femoral artery. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 73-82 (1985).
  30. Nevzati, E., et al. Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique. Journal of Visualized Experiments. (128), e56359(2017).
  31. Aquarius, R., Smits, D., Gounis, M. J., Leenders, W. P. J., de Vries, J. Flow diverter implantation in a rat model of sidewall aneurysm: a feasibility study. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (1), 88-92 (2018).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

人类冠状动脉支架ApoE基因敲除大鼠支架植入术支架内再狭窄光学相干断层扫描组织学分析股动脉入路球囊扩张
通过股动脉入路将人用尺寸冠状动脉支架植入大鼠腹主动脉
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。