方法文章

准备可调细胞外基质微环境，以评估施万细胞表型规范

DOI：

10.3791/61496

⸱

2020年6月2日

 ,  , 
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

本文内容

摘要

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这种方法旨在说明细胞外基质线索（如基板刚度、蛋白质成分和细胞形态）调节Schwann细胞（SC）表型的机制。

摘要

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创伤性外周神经系统 （PNS） 损伤目前缺乏适当的治疗方法，无法恢复完全功能恢复。施万细胞（SCs）作为PNS的主要胶质细胞，在损伤后分化成再生细胞表型，在促进PNS再生方面发挥着至关重要的作用。但是，SC 的去分化状态很难在再生所需的时间段内保持，并且受到周围细胞外基质 （ECM） 变化的影响。因此，确定SC和不同 ECM 之间的复杂相互作用，以提供 SC 再生潜力的线索至关重要。为了解决这个问题，制定了一种策略，将不同的ECM蛋白吸附到可调调的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基材上，为可调节刚度和蛋白质成分提供了一个平台。SC被播种到可调基材上，测量了代表SC表型动力学的关键细胞功能。为了说明SC蛋白表达与细胞形态之间的相互作用，利用除单个微联系印刷细胞模式外，其他SC的种子密度，并具有免疫荧光染色和西印的特点。结果表明，传播面积较小、细胞伸长程度较高的细胞可促进SC再生表型标记的较高水平。该方法不仅开始解开SC的ECM和细胞功能之间的显著关系，而且为未来在外周神经修复中优化生物材料提供了指导。

引言

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外周神经系统（PNS）损伤仍然是医疗保健领域的主要临床挑战，它损害了患者的生活质量，并通过多种社会经济因素1、2,产生了重大影响。施万细胞（SC）作为PNS中的主要胶质细胞，提供必要的分子和物理线索，以诱导PNS再生，并在短间隙损伤中帮助功能恢复。这是因为SC的非凡能力，从骨髓或雷马克表型3"修复"细胞表型去分化成"修复"细胞表型。修复SC是一个独特的细胞表型在几个方面。受伤后，SCs 通过重新进入细胞周期并开始表达多种转录因子来增加增殖率，从而促进再神经化。这些因素，如c-Jun和p75NTR，被向上调节，而骨髓SC标记物，如骨髓基本蛋白（MBP），被向下调节4,4，5。此外，SCs 改变形态，变得拉长，并相互对齐，形成邦格纳带跨伤害场6。这为轴子扩展到正确的近元目标7提供了物理指导机制。然而，尽管SCs有能力促进短间隙损伤的神经再生，但功能恢复的结果在严重伤害中仍然很差。部分原因是细胞外基质 （ECM） 制导提示的丢失，以及 SCs 无法长时间保持再生表型8。

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方案

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1. 可调细胞培养基质制备和表征

  1. 基底制备
    1. 使用移液器尖端以 10:1 和 60:1 的比例大力混合 PDMS 基质弹性体和固化剂，直到气泡在混合物中均匀分散。使用真空干燥去除气泡，直到气泡消散。
      注:在PDMS聚合过程中，固化剂与基弹性体交联，提供最终聚合物所需的机械性能。可以调整交联比率以改变 PDMS 刚度。
    2. 将一滴干燥 PDMS 混合物放在方形或圆形盖玻片上（例如 22 mm x 22 mm），以 2500 rpm 转速旋转旋转盖玻片 30 秒。
    3. 在60°C的烤箱中孵育盖玻片1-2小时或室温过夜，使PDMS凝固。
    4. 使用 UV-Ozone 清洁剂处理盖玻片 7 分钟（UV 波长:185 nm 和 254 nm），以提高表面亲水性。放入消毒的 6 孔板中。
    5. 在用于细胞培养之前，在70%乙醇中孵育基质至少30分钟。
      注意:紫外线臭氧清洁剂会产生对人类有害的臭氧。在化学烟气罩中工作或进行某种形式的通风。
    6. 在37°C的无菌培养箱中浸入蛋白质溶液（10μg/mL胶原蛋白 I、纤维素或层压素）中，60分钟。
      注:经过紫外线臭氧处理后，PDMS 表面可能仍具有疏水性。旋转井板，确保每个盖玻片都覆盖在蛋白质溶液中。
    7. 吸气蛋白溶液，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）3倍清洗盖玻片。
    8. 使用市售的 EDTA 溶液....

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结果

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为了分析和量化在SC表型上基板刚度和蛋白质成分之间的相互作用，开发了可调PDMS细胞培养基质（图1A）。不同基基聚合物的压缩测试:利用固化剂比来量化基板的杨模量（E）（图1B）。生成的模量值范围表示生理相关的基底条件。在制备基材后，在可调的微环境上对SC进行培养和细胞特性分析。首先分析了不同蛋白质成分基质上的SC增殖率。与胶原蛋白 I 和纤维素吸附相比，层宁涂层基材的增殖率更高，全部为 10 μg/mL（图 2A，B）。层压涂层和不同模态基材上的SC表明，相对柔软的基材（E=3.85kPa）可降低所有条件下的细胞增殖率（图2C，D）。然而，硬基板（E=1119kPa）和相对软基板（E=8.67kPa）之间的差异微不足道（图2D）。

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讨论

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SCs 可以促进神经再生，由于其表型转化和神经损伤后再生潜力。然而，ECM提示如何调节这种再生能力仍然大多不清楚，可能不仅阻碍生物材料的发展，旨在促进神经再生，而且理解神经再生所涉及的机制。为了开始研究这种相互作用，在 ECM 线索（如刚度、蛋白质涂层和粘合剂地形）可控制时，创建了细胞培养基板。利用微触觉打印的常用方法，微模式胶粘剂地形能力是协议中的一个关键特征。但是，这种基板与玻璃不同，因为应用于 PDMS 图章的压缩力必须处于适当的水平，才能达到细胞培养基板上所需的细胞粘合区域形状。利用荧光牛血清白蛋白 （fBSA） 作为模型蛋白来可视化细胞粘合区域并调整 PDMS 邮票上的压缩力，可以最终缓解此问题。与玻璃的另一个关键区别是去除多余的普鲁尼克F-127，用于使基材的其余部分非粘合。经过这种处理，细胞培养基质具有高度疏水性，使得在整个洗涤过程中保持湿细胞培养基质具有挑战性，这对微模式蛋白37的结构完整性非常重要。因此，建议使用多个移液器几乎同时吸气和注射溶液，以防止基材完全脱水。

虽然微模式可以精确控制细胞形状，不需要复杂的合成程.......

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披露

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提交人没有报告潜在的利益冲突。

致谢

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作者感谢辛辛那提大学的资助支持。作者还感谢辛辛那提大学先进材料特性实验室的罗恩·弗伦尼肯的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
来自牛血清 （BSA） 的白蛋白、德克萨斯红偶联物Thermo Fisher ScientificA23017BSA 染色显示微观模式
抗小鼠 IgG、HRP 偶联抗体Cell Signaling Technology7076S抗体用于蛋白质印迹分析
抗兔 IgG、HRP 偶联抗体Cell Signaling Technology7074S抗体用于蛋白质印迹分析
BrdUThermo Fisher ScientificB23151试剂，用于测量细胞增殖
BrdU 一抗与 Alexa Fluor 488 偶联Thermo Fisher ScientificB35130用于在细胞增殖测定中可视化 BrdU
IThermo Fisher ScientificA10483-01用于包被盖玻片的蛋白质
压缩力试验机测试资源定量聚合物机械性能的仪器
Dulbecco 改良 Eagle 培养基Thermo Fisher Scientific11965092细胞培养基
胎牛血清Thermo Fisher Scientific16000044细胞培养基补充剂
纤连蛋白Thermo Fisher Scientific33010-018用于包被盖玻片的蛋白质
荧光显微镜NikonEclipse Ti2荧光显微镜
终止蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 （100X）Thermo Fisher Scientific78440蛋白酶和磷酸酶抑制剂
层粘连蛋白Thermo Fisher Scientific23017015蛋白 用于包被盖玻片的
DAPI 的封固剂Thermo Fisher ScientificP36971盖玻片封固剂和细胞核染色
小鼠 c-Jun 一抗Thermo Fisher Scientific711202用于可视化 c-Jun 蛋白的一抗
小鼠 &β;-肌动蛋白一抗Cell Signaling Technology3700S用于蛋白质印迹实验的上样对照
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122细胞培养基补充剂
光刻胶 SU 2010KAYAKUSU8-2010光刻胶
Pluronic F-127Sigma AldrichP-2443阻断非特异性蛋白结合
c-Jun 一抗Cell Signaling Technology9165S用于 c-Jun 蛋白可视化的一抗
兔髓鞘碱性蛋白一抗Abcamab40390用于可视化的一抗MBP
兔 p75NTR 一抗Cell Signaling Technology8238S用于 p75NTR
罗丹明鬼笔环肽Thermo Fisher ScientificR415细胞骨架
RIPA 缓冲液Abcamab156034细胞裂解缓冲液
RT4-D6P2T 雪旺细胞系ATCCCRL-2768实验
SYLGARD 184 PDMS 碱和固化剂Sigma Aldrich761036用于涂覆盖玻片的可调聚合物
胰蛋白酶Thermo Fisher Scientific15090-046细胞解离试剂
UV-Ozone 清洁剂Novascan增加 PDMS 的水性
Versene （1x）Thermo Fisher Scientific15040066细胞解离试剂
胶原蛋白 蛋白质 含 兔可视化的一抗 可视化 用于

参考文献

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  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R.

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

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标签

Schwann Cell PhenotypeExtracellular Matrix MicroenvironmentsTunable PDMS SubstrateMicrocontact Printing TechniqueCellular Spreading AreaCellular Elongation AnalysisImmunofluorescent StainingWestern Blot AnalysisLaminin Coated Substratesc Jun Expression

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