可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化

摘要

该方法旨在阐明细胞外基质信号（如基质刚度、蛋白质组成和细胞形态）调控施万细胞（SC）表型的机制。

摘要

目前，创伤性周围神经系统（PNS）损伤尚缺乏能够实现完全功能恢复的有效治疗方法。施万细胞（SCs）作为周围神经系统的主要胶质细胞，在损伤后通过去分化为具有再生能力的细胞表型，在促进周围神经再生过程中发挥关键作用。然而，去分化状态的施万细胞难以在神经再生所需的时间内维持，且易受到周围细胞外基质（ECM）变化的影响。因此，明确施万细胞与不同细胞外基质之间的复杂相互作用，以提供反映施万细胞再生潜能的信号线索，具有重要意义。为解决这一问题，本研究建立了一种策略：将不同的ECM蛋白吸附到可调节的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上，从而构建一个可调控刚度和蛋白成分的实验平台。将施万细胞接种于这些可调基底上，并检测代表施万细胞表型动态变化的关键细胞功能。为阐明施万细胞蛋白表达与细胞形态之间的相互关系，采用了不同接种密度的施万细胞，并结合微接触印刷的单细胞图案，通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法进行表征。结果表明，细胞铺展面积较小、细胞伸长程度较高的施万细胞表现出更高水平的再生表型标志物。该方法不仅初步揭示了细胞外基质与施万细胞功能之间的显著关联，也为未来周围神经修复中生物材料的优化提供了指导依据。

引言

周围神经系统（PNS）损伤在临床上仍是医疗领域的一大挑战，不仅影响患者的生活质量，还通过多种社会经济因素造成显著影响^1,2。施万细胞（SC）作为PNS中的主要胶质细胞，能够提供必要的分子和物理信号，促进PNS再生，并在短距离神经缺损损伤中帮助实现功能恢复。这得益于施万细胞从髓鞘形成表型或Remak表型去分化为一种“修复”细胞表型的显著能力³。修复型施万细胞在多个方面具有独特的细胞表型。损伤发生后，施万细胞通过重新进入细胞周期而增殖加快，并开始表达多种转录因子以促进再神经支配。这些因子（如c-Jun和p75 NTR）表达上调，而髓鞘形成施万细胞的标志物（如髓鞘碱性蛋白（MBP））则表达下调^4,5。此外，施万细胞形态发生改变，变得细长并相互排列，形成跨越损伤部位的 Büngner 带⁶。这为轴突向正确的远端靶点延伸提供了物理导向机制⁷。然而，尽管施万细胞具备促进短距离缺损神经再生的能力，但在严重损伤中，功能恢复的效果仍然不佳。部分原因在于细胞外基质（ECM）导向信号的缺失，以及施万细胞无法长期维持其再生表型⁸。

方案

1. 可调细胞培养基底的制备与表征

1. 基底制备
   1. 使用移液枪头剧烈混合PDMS基础弹性体和固化剂，比例介于10:1至60:1之间，直至气泡均匀分散在混合物中。通过真空干燥去除气泡，直至气泡完全消失。
      注意：在PDMS聚合过程中，固化剂与基础弹性体交联，赋予最终聚合物所需的机械性能。可通过调整交联比例来改变PDMS的刚度。
   2. 在方形或圆形盖玻片（例如22 mm × 22 mm）上滴加一滴（约0.2 mL）脱气后的PDMS混合物，并在匀胶机上以2500 rpm旋转30秒。
   3. 将盖玻片置于60 °C烘箱中孵育1–2小时，或在室温下过夜，使PDMS固化。
   4. 使用紫外臭氧清洗仪处理盖玻片7分钟（紫外波长：185 nm和254 nm），以提高表面亲水性。随后将其放入已灭菌的6孔板中。
   5. 用于细胞培养前，将基底在70%乙醇中孵育至少30分钟。
      警告：紫外臭氧清洗仪可能产生对人体有害的臭氧。操作时应在化学通风橱或具备通风条件的环境中进行。
   6. 将盖玻片浸入蛋白溶液（10 µg/mL I型胶原、纤连蛋白或层粘连蛋白）中，在37 °C无菌培养箱中孵育60分钟。
      注意：经紫外臭氧处理后，PDMS表面可能仍具疏水性。应旋转培养板，确保每个盖玻片均被蛋白溶液覆盖。
   7. 吸除蛋白溶液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗盖玻片3次。

结果

为分析和量化基底刚度与蛋白质组成对干细胞表型的相互影响，开发了一种可调节的PDMS细胞培养基底（图1A）。通过在不同基础组分与固化剂比例下对聚合物进行压缩测试，以量化基底的杨氏模量（E）图1B）。所得的模量值范围代表了生理上相关的基质条件。基质制备完成后，将干细胞（SCs）培养于可调控的微环境中，并分析其细胞特性。首先分析了不同蛋白质成分基质上干细胞的增殖速率。结果显示，在层粘连蛋白包被的基质上，干细胞的增殖速率高于吸附胶原Ⅰ和纤连蛋白的基质，所有条件均在 10 µg/mL (图2A，B）。在具有层粘连蛋白涂层且模量不同的基底上培养的SCs显示，相对较软的基底（E=3.85 kPa）在所有条件下均会降低细胞增殖速率图2C，D）。然而，刚性基底（E=1119kPa）与相对较软的基底（E=8.67kPa）之间的差异无统计学意义（

讨论

施万细胞（SCs）在神经损伤后可通过表型转化和再生潜能促进神经再生。然而，细胞外基质（ECM）信号如何调控这种再生能力在很大程度上仍不清楚，这可能不仅会阻碍旨在促进神经再生的生物材料的开发，也会影响对神经再生机制的理解。为了初步探究这种相互作用，研究人员构建了细胞培养基底，在其中可控制ECM信号，如刚度、蛋白包被和黏附拓扑结构。在本方案中，微图案化黏附拓扑结构的能力是一个关键特征，采用的是常见的微接触印刷技术。然而，该基底与玻璃不同之处在于，施加到聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章上的压力必须控制在适当水平，才能在细胞培养基底上获得理想形状的细胞黏附区域。利用荧光标记的牛血清白蛋白（fBSA）作为模型蛋白来可视化细胞黏附区域，并调节PDMS印章上的压力，最终可解决这一问题。另一个与玻璃基底的不同之处在于需要去除过量的Pluronic F-127，该试剂用于使基底其余部分不具备黏附性。处理后，细胞培养基底具有高度疏水性，使得在洗涤过程中维持基底湿润变得困难，而保持湿润对于微图案化蛋白结构的完整性至关重要³⁷。因此，建议使用多个移液器几乎同时进行吸液和加液操作，以防止基底完全脱水。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）Texas Red 标记物	Thermo Fisher Scientific	A23017	用于显示微图案的 BSA 染色
抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体	Cell Signaling Technology	7076S	用于 Western 印迹分析的抗体
抗兔 IgG，HRP 标记抗体	Cell Signaling Technology	7074S	用于 Western 印迹分析的抗体
BrdU	Thermo Fisher Scientific	B23151	用于测量细胞增殖的试剂
与 Alexa Fluor 488 标记的 BrdU 一抗	Thermo Fisher Scientific	B35130	用于在细胞增殖检测中可视化 BrdU
胶原蛋白 I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01	用于包被盖玻片的蛋白质
压缩力测试仪	TestResources		用于量化聚合物机械性能的仪器
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher Scientific	11965092	细胞培养基
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	16000044	细胞培养基补充物
纤连蛋白	Thermo Fisher Scientific	33010-018	用于包被盖玻片的蛋白质
荧光显微镜	Nikon	Eclipse Ti2	荧光显微镜
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（100X）	Thermo Fisher Scientific	78440	蛋白酶和磷酸酶抑制剂
层粘连蛋白	Thermo Fisher Scientific	23017015	用于包被盖玻片的蛋白质
含 DAPI 的封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36971	盖玻片封固剂及细胞核染色
小鼠 c-Jun 一抗	Thermo Fisher Scientific	711202	用于可视化 c-Jun 蛋白的一抗
小鼠 β-肌动蛋白一抗	Cell Signaling Technology	3700S	Western 印迹实验的上样对照
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	细胞培养基补充物
光刻胶 SU 2010	KAYAKU	SU8-2010	光刻胶
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	阻断非特异性蛋白结合
兔 c-Jun 一抗	Cell Signaling Technology	9165S	用于可视化 c-Jun 蛋白的一抗
兔髓鞘碱性蛋白一抗	Abcam	ab40390	用于可视化 MBP 的一抗
兔 p75NTR 一抗	Cell Signaling Technology	8238S	用于可视化 p75NTR 的一抗
罗丹明鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	R415	细胞骨架可视化
RIPA 缓冲液	Abcam	ab156034	细胞裂解缓冲液
RT4-D6P2T 施万细胞系	ATCC	CRL-2768	实验中使用的细胞系
SYLGARD 184 PDMS 基料与固化剂	Sigma Aldrich	761036	用于包被盖玻片的可调聚合物
胰蛋白酶	Thermo Fisher Scientific	15090-046	细胞解离试剂
紫外臭氧清洗仪	Novascan		提高 PDMS 的亲水性
Versene (1x)	Thermo Fisher Scientific	15040066	细胞解离试剂