本方案描述了单分子荧光原位杂交（smFISH）技术的一种应用，用于测量体内mRNA合成与降解的动力学过程。
本文内容
摘要
摘要
单分子荧光原位杂交（smFISH）可用于计数单个细胞中mRNA的绝对数量。本文介绍了一种将smFISH应用于大肠杆菌（Escherichia coli）中转录速率和mRNA降解速率测定的方法。由于smFISH基于固定细胞，因此我们在时间进程实验中的多个时间点进行smFISH检测，即在基因表达被诱导或抑制后细胞发生同步变化的过程中。在每个时间点，通过光谱区分mRNA的不同亚区域，以检测转录延伸和提前终止情况。本实验方案的结果还可用于分析mRNA在细胞内的定位以及细胞间mRNA拷贝数的异质性。使用该方案可在8小时内处理大量样本（约50个），而以往处理少量样本即需耗费相同时间。我们讨论了如何应用该方案研究细菌细胞中不同mRNA的转录与降解动力学。
引言
遗传信息从DNA流向mRNA和蛋白质是细胞中最基本的生命过程之一，其调控对细胞的适应性至关重要1。细胞中mRNA的数量由两个动态过程决定：转录和mRNA降解。然而，转录和mRNA降解在单个细胞的时间和空间上的调控机制仍不完全清楚，这主要由于缺乏能够在活体内对这些动力学过程进行定量测量的实验方法。
基于从细胞群体中提取的总mRNA的方法，例如Northern印迹、RT-PCR、RNA测序和基因表达微阵列，可用于测量mRNA水平的相对差异，并已被广泛用于分析转录延伸速率2,3,4,5或mRNA降解速率6,7。然而，这些方法无法提供每个细胞中mRNA的绝对数量，因此不适合用于研究转录起始速率8。此外，由于mRNA是从细胞群体中提取的，因此无法检测单个细胞内mRNA的空间分布以及细胞间mRNA拷贝数的变异情况。
单细胞下一代RNA测序（scRNAseq）可以在基因组水平上定量每个细胞中的mRNA数量9。然而，由于样品制备的挑战和高昂的成本，利用该技术测量转录动力学仍然存在困难。特别是，由于mRNA丰度较低，将scRNAseq应用于细菌在技术上尤为困难10,11。
单分子荧光原位杂交（smFISH）基于使用荧光标记的单链探针与目标 mRNA 序列进行杂交，这些探针的序列与所关注的目标 mRNA 互补12,13。这种序列特异性杂交的概念与 Northern 印迹或 RT-PCR 中所用的原理相似，但杂交过程在固定细胞内原位进行，以保持 mRNA 的天然定位。通过多个长约 ~20 个核苷酸（nt）的探针结合到单个 mRNA 的不同区域，从而放大单个 mRNA 的信号（图 1A）13。在这种“平铺”探针策略中，检测单个 mRNA 所需的探针数量决定了可检测 mRNA 长度的下限。另一种方法是将目标 mRNA 在转录水平上融合至一段非编码的串联 Lac 操纵子序列阵列，使得多个荧光标记的 lacO 探针可结合到 单个 mRNA 上（图 1B）14。
smFISH 已被用于定量稳态下每个细胞中的 mRNA 拷贝数（即合成与降解处于平衡状态时），并分析细菌细胞间 mRNA 的平均值及其变异性15,16,17。最近，smFISH 还被应用于非稳态条件下 mRNA 拷贝数的定量，例如在大肠杆菌（E. coli）基因表达诱导或抑制后立即进行检测18,19,20。通过绝对 mRNA 拷贝数随时间的变化，可进一步计算转录起始、延伸和终止速率，以及 mRNA 降解速率。对于此类时间序列研究，传统的 smFISH 操作流程可能较为繁琐，因为需要处理大量代表不同时间点的样本，且每个样本均需经历多次缓冲液更换步骤（如离心和洗涤）。本文介绍了一种简化的 smFISH 实验方案，通过将细胞固定在盖玻片表面，并使用真空过滤系统抽吸液体，显著简化了样品处理流程14,19。以大肠杆菌（E. coli）中 lacZ 基因的表达为例，本文展示了完整的实验流程（图 2），包括图像分析（图 3），从而获得体内转录动力学（起始、延伸和终止）和 mRNA 降解、细胞间 mRNA 表达的异质性以及 mRNA 定位信息。我们预期该方案可广泛适用于多种细菌物种中其他 mRNA 的体内动力学与定位研究。
方案
1. smFISH 探针的制备
注意：若要使用单一荧光染料标记 smFISH 探针，请遵循基于 NHS 酯化学法标记核酸寡核苷酸的标准实验方案21。
- 设计单分子FISH探针。确定使用“平铺”探针还是“阵列”探针（图1) 用于目的基因。参见 讨论 关于如何做出决策的部分
- 对于“拼接”探针（图1A），使用在线探针设计工具（例如，参见 材料表).
- 对于“array”探针（图1B），进行BLAST序列比对，以确保探针序列不与其他任何mRNA序列互补。
- 为了研究 lacZ mRNA转录与降解动力学，使用两组24个探针，每组分别覆盖转录本的前1 kb和后1 kb区域 lacZ (3,072 bp)19.
注意：以下这些探针组分别简称为“5’ mRNA 探针”和“3’ mRNA 探针”。这些探针的序列列于 材料表.
- 以5’端带有C6氨基连接臂的DNA寡核苷酸形式订购探针序列。将各探针溶于水，配制成1 mM溶液。
- 将“5’ mRNA 探针”和“3’ mRNA 探针”组的探针等摩尔量混合。例如，对于5’ mRNA探针组 lacZ，混合 20 µL 每种探针（该组探针共24种）。
- 进行乙醇沉淀22 去除混合探针中可能存在的伯胺和仲胺类污染物（如Tris、甘氨酸和铵盐），以免抑制偶联反应。最后，将DNA沉淀溶解于 100 µL 水（得到约 4.5 mM 的 DNA 探针组）。
注意：即使探针已由生产商进行标准脱盐纯化，也建议执行此步骤。可使用基于滤膜的标准纯化方法替代或结合乙醇沉淀进行纯化。 - 选择两种光谱不同的带有单功能NHS酯基团的荧光染料，以便对5’和3’ mRNA探针组进行差异化标记。例如，使用Cy5 NHS酯标记5’ mRNA探针，使用Cy3B NHS酯标记3’ mRNA探针。将每种荧光染料溶于无水DMSO中，配制成终浓度为20 mg/mL（约25 mM）的溶液。
- 每次标记反应前新鲜配制 0.1 M 碳酸氢钠（pH 8.5）。长时间暴露于空气中会降低其 pH 值，从而降低标记效率。
- 对于偶联反应，混合以下成分： 15 μL Cy5荧光染料储备液（来自步骤1.5）， 4 μL 来自第1.4步的5’ mRNA探针组 75 μL 碳酸氢钠（来自步骤 1.6），以及 7 μL 加水。用铝箔纸包裹试管，在室温下振荡3-6小时。
注意：延长孵育时间并不一定会提高标记效率。此外，只要保持各组分的浓度不变，反应体系可按比例放大或缩小。 - 对3’ mRNA探针组及相应的荧光染料（即Cy3B NHS-酯）重复上述步骤。
- 进行乙醇沉淀22 以去除未反应的染料分子。将沉淀物溶解于约 ~50 μL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，含1 mM EDTA）
- 使用紫外-可见分光光度计估算 DNA 和荧光染料的浓度。
- 在 260 nm 以及 559 nm（Cy3B）或 649 nm（Cy5）处测定吸光度。若样品浓度过高导致无法获得准确测量值，可进行稀释 1 µL 样品的 10 µL.
- 将吸光度转换为浓度：
εDNA = 0.2 μM-1 （对于20个核苷酸的单链DNA），εCy5 = 0.25 μM-1，和 εCy3B = 0.13 μM-1
注意：[DNA] 是指溶液中总探针的浓度，单个探针的浓度约为该浓度的 1/24。此后提及的“探针浓度”均指总探针浓度。若 [DNA] 与 [dye] 的比值为 1，则可省略后续的高效液相色谱（HPLC）步骤23，并将样品稀释至最终 4-5 μM 在TE缓冲液中。
- （推荐）使用高效液相色谱法（HPLC）将标记的探针与未标记的探针及游离染料分离纯化。
注意：尽管此额外纯化步骤将导致样品损失，但有利于后续应用。去除未标记的DNA探针可增强来自mRNA靶标的荧光信号，而去除未反应的染料可降低背景荧光。- 使用标准分析型C18色谱柱，以0.1 M三乙基乙酸铵（TEAA）作为流动相A，乙腈作为流动相B，准备高效液相色谱系统。
- 向样品（来自步骤 1.9）中加入 1 M TEAA，使其终浓度为 0.1 M TEAA。
- 设置梯度程序如下：0–5 分钟，0% B；5–35 分钟，B 相从 0% 线性梯度升至 30%；35–37 分钟，B 相从 30% 线性梯度升至 100%；37–40 分钟，0% B。保持流速为 0.1 mL/min，并在 260 nm 和 649 nm（适用于 Cy5 标记样品）或 260 nm 和 559 nm（适用于 Cy3B 标记样品）处记录色谱图。
- 当DNA和荧光染料通道的吸光度均升高时，收集洗脱的样品。
- 使用真空浓缩仪浓缩洗脱的样品，并将沉淀重悬于 50-100 μL TE缓冲液
- 使用紫外-可见分光光度计检测DNA和荧光染料的浓度（参见步骤1.10）。如有必要，进行稀释，使最终浓度约为4-5 µM-20°C 保存探针20 °C
2. 溶液的配制
- 准备大量经DEPC处理的水和缓冲液（表1）。这些溶液在室温下可保存一年以上。
- 配制4倍固定液和洗涤液（表1）。
- 配制预杂交液和探针杂交液（表1）。在第5.1步或第6.1步孵育期间配制探针杂交液，随后将溶液置于37 °C台式摇床上，加盖避光孵育20–40分钟。
注意：甲酰胺、SSC和探针的浓度已针对lacZ探针组进行优化，以在最大化真实信号的同时尽量减少背景荧光。有关针对不同应用调整这些浓度的详细信息，请参见讨论部分。
3. 盖玻片和载玻片的准备
- 清洗盖玻片和载玻片。
- 使用镊子将单个盖玻片和载玻片放入考普林瓶中。确保盖玻片和载玻片彼此分离，不相互接触。
- 向瓶中加入100%乙醇并盖上盖子。将瓶子放入水浴超声波清洗机中，超声处理15–20分钟。
注意：使用水浴超声波清洗机时，建议关闭加热功能。 - 倒出乙醇，并用超纯水冲洗3–4次。使用直接从水纯化系统流出的水。
- 倒出瓶中的水，加入70%乙醇。盖上盖子，超声处理15–20分钟，然后用超纯水冲洗。
- 向瓶中加入超纯水，并超声处理15–20分钟。
注意：盖玻片和载玻片可在装有超纯水的考普林瓶中过夜保存。 - 用洁净的镊子从考普林瓶中取出载玻片或盖玻片，并用N2气体吹干。对剩余的载玻片和盖玻片重复此操作。
- 将干燥的载玻片放入洁净的储存盒中，待第7.5步使用。将干燥的盖玻片放入一个空的1,000-μL移液器吸头盒中，该盒子将在后续操作中作为“反应室”使用。
- 使用疏水性标记笔，根据移液器吸头盒上的圆形孔洞在盖玻片上画圆圈。这些圆圈（直径约0.5 cm）将作为“微孔”。至少等待5–10分钟，使标记笔墨完全干燥。
注意：始终确保吸头盒的盖子处于关闭状态。 - 向每个微孔中加入20-μL的0.1%多聚赖氨酸（poly-L-lysine）液滴。在室温下孵育10–50分钟。
注意：根据微孔大小调整该体积。确保溶液完全覆盖微孔区域。若孵育时间较长，需注意避免蒸发。 - 孵育结束后，小心吸除多聚赖氨酸溶液，避免接触表面，以免刮掉涂层。然后向经多聚赖氨酸处理的微孔中加入一滴（约20 μL）DEPC处理水。关闭“反应室”的盖子，防止蒸发，直至第5.1步。
4. 时间序列实验与样品固定
- 在250 mL三角瓶中，将大肠杆菌（E. coli）细胞接种于约20 mL液体培养基中进行培养。将三角瓶置于30 °C水浴摇床中持续振荡培养，仅在取样时暂停摇动。
注意：本文所示结果均来自在M9基本培养基（添加0.2%甘油、0.1%酪蛋白氨基酸和1 mg/L硫胺素）中培养至对数生长期（OD600~0.2）的MG1655细胞。 - 在空的1.5 mL离心管中加入250 µL 4倍固定液。根据实验所需取样时间点的数量，重复操作，准备相应数量的离心管。用时间点编号标记各管，并置于室温下备用。
- 在开始时间序列实验前，取750 µL细胞培养物（OD600~0.2），加入步骤4.2中标记为“零时”的离心管中。轻轻颠倒混匀，使细胞与固定液充分混合。
注意：切勿通过反复吹打、涡旋或剧烈操作来混匀细胞。该样品代表基因抑制状态，将作为对照用于计算单个mRNA的荧光强度（见步骤9.4）。 - 向液体培养物中加入0.02–1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），以诱导lacZ基因表达。从此刻起启动计时（t = 0 min），并按预定时间间隔（例如每1分钟）取样。取样时重复步骤4.3操作。
- 在时间序列实验的某一时间点（例如t = 1.5 min），向培养物中加入5 mM邻硝基苯-β-D-呋喃半乳糖苷（ONPF）或500 mM葡萄糖24，以重新抑制lacZ基因表达。再次抑制后，继续按步骤4.3取样，以追踪mRNA的降解过程。
注意：也可使用约400 µg/mL利福平（一种转录起始抑制剂）实现抑制25。 - 进行固定：将含有取样细胞的离心管在室温下孵育15分钟，随后置于冰上孵育30分钟。
- 为去除固定剂，将离心管在室温下以4,500 x g离心4分钟，随后用移液器小心吸除上清液。
注意：必须按照安全规程将甲醛废液弃置于专用废液容器中。 - 加入1 mL DEPC处理的PBS缓冲液重悬细胞。重复离心和重悬操作共3次（包括本步）。
注意：固定后的细胞较为脆弱，需轻柔操作。重悬沉淀时应小心，避免产生气泡。 - 最后一次洗涤后，将细胞重悬于约30 µL DEPC-PBS缓冲液中。
5. 细胞膜的通透化
- 将每个时间点的样本分别加入盖玻片的不同孔中（每孔约 30 μL）。室温下静置 10–30 分钟，使细胞贴附于表面。避免各孔之间的液滴合并。
- 为洗去未结合的细胞，吸除液体，并向每孔加入约 20 μL DEPC PBS。数分钟内吸除 DEPC PBS。
- 向每孔加入 15 µL 70% 乙醇，作用 4 分钟以通透细胞膜。4 分钟后吸除乙醇，并确保各孔完全干燥。
注意：乙醇处理时间必须严格控制在 4 分钟。处理时间过长会导致过度通透。 - 向每孔加入 30 µL 洗涤液。
6. 探针杂交
- 吸去每孔中的洗涤液。向每孔中加入 30 µL 预杂交溶液。将孵育板置于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
注意：在孵育板底部加入约 50 mL 水以保持湿度。 - 吸去每孔中的预杂交溶液。向每孔中加入约 30 µL 探针杂交溶液。用铝箔包裹孵育板，置于 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。
注意：请确保探针杂交溶液在操作前已在 37 °C 恒温振荡器中预热。避免不同孔之间的液体交叉污染。如有需要，可减少每孔加样体积。
7. 杂交后洗涤及成像前准备
- 使用多通道移液器，一次性向每个孔中加入约 30 µL 洗涤液。吸去液体并重复洗涤 3–5 次。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 15–30 分钟。
- 再重复步骤 7.1 两次。
- 用 DEPC-PBS 洗涤每个孔 5 次。采用步骤 7.1 中使用的方法，但跳过孵育过程。
- 吸去盖玻片上的液体。向每个孔中加入 4 µL DEPC-PBS。
- 使用镊子将盖玻片提起并翻转，轻轻放置在玻璃载玻片（来自步骤 3.2）上。避免产生气泡。
- 用硅胶牙科胶密封盖玻片边缘。
- 等待胶体完全固化。此处可暂停操作，并将载玻片在 4 °C 下保存过夜。
注意：其他单分子荧光原位杂交（smFISH）方案建议添加氧清除试剂（例如葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶）或使用商用抗荧光淬灭封片介质14,26，以提高荧光染料的光稳定性。
8. 成像
- 使用相差成像的实时模式寻找目标区域。通过操纵载物台操纵杆，在孔内切换视野。选择一个细胞密度适宜的区域（即存在大量且多数相互分离的细胞）。调节 z 轴焦距，使相差成像中的细胞图像清晰对焦。
- 按以下顺序拍摄图像：Cy5（4 秒曝光）、Cy3（2 秒曝光）和相差成像（0.2 秒曝光）。
注意：Cy3B 染料分子在 Cy3 通道中成像，所得图像称为 Cy3 图像。 - 重复步骤 8.1–8.2，以获取孔内约 10 个不同区域的图像。
- 将物镜移至另一孔，并重复步骤 8.1–8.3。
- 将图像导出为 TIFF 文件。
- （可选）在 Cy5 和 Cy3 通道中对吸附于盖玻片表面的多色荧光微球进行成像，以确定 Cy5 与 Cy3 通道之间的空间偏移，用于图像配准。
- 取约 10 µL 多色荧光微球（直径 0.2 µm）滴加于洁净的盖玻片表面，静置 10–30 分钟。用约 50 µL PBS 洗涤后，再加入约 5 µL PBS，将盖玻片与载玻片压合形成封片，密封后安装至显微镜上。
- 在 Cy5 和 Cy3 通道中对微球进行成像。
9. 图像分析
注意：本步骤中使用的 Matlab 代码可在以下 GitHub 网站获取：https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020。GitHub 文件夹包含图像分析所需的所有内容，包括细胞分割和信号点识别的参数值。本步骤中的流程在主脚本“FISHworkflow.m”中有进一步说明。
- 打开细胞分割工具（如 microbeTracker27 或 Oufti28），加载相差图像。选择“独立帧”并点击名为“所有帧”的按钮以开始分割过程，系统将识别细胞并计算其轮廓（图3B，C）。
注意：这些软件包的详细操作协议可在线获取（例如 oufti.org）。 - 在 microbeTracker 或 Oufti 的 spotFinder 功能中加载 Cy5 荧光图像，点击“运行”按钮，基于二维高斯拟合开始荧光点的识别与定量（图3B，C）。对 Cy3 荧光图像重复此步骤，以分析 Cy3 通道中的荧光点。该步骤将生成每个细胞中荧光点的列表，包括其强度和坐标。
- （可选）根据 FISHworkflow.m 文件中的说明，使用阈值过滤掉弱荧光点（假阳性）。
注意：检查阴性对照（例如 MG1655 ΔlacZ）中的荧光点，确定用于过滤假阳性的阈值。 - 为获得单个 mRNA 的荧光点强度，使用在时间零点（添加 IPTG 前）测得的荧光点强度列表，用包含两个组分的高斯混合模型拟合荧光点强度分布。将第一个高斯群体的峰值位置（图3D，E中的黑线）作为单个 mRNA 的荧光点强度。分别对 Cy5 和 Cy3 荧光点执行此操作，以获得单个 5’ 和 3’ lacZ mRNA 的荧光点强度。
注意：每次时间序列实验均需重复此步骤，因为单个 mRNA 的荧光点强度在不同实验中可能略有变化。 - 将荧光点的荧光强度除以单个 mRNA 的强度（来自步骤 9.4），以获得该荧光点内 mRNA 的数量。将细胞内归一化的荧光点强度相加，计算每个细胞中 mRNA 的总数（图3F）。分别对 5’ 和 3’ mRNA 执行这些计算。
- 计算并绘制每个时间点的每细胞平均 mRNA 数量（例如 图4B），并通过平均 mRNA 水平随时间的变化分析体内转录和 mRNA 降解的动力学（图4B）。
- 为获得转录延伸速率，对 5’ 和 3’ mRNA 信号的初始上升阶段进行最小二乘法线性拟合，并确定与基础水平的截距（图4B）。这两个截距之间的差值表示 RNAP 从 5’ 探针区域移动到 3’ 探针区域所需的平均时间。将两个探针组之间的距离（2 kb）除以该时间，得到平均转录延伸速率。
- 为获得 mRNA 降解速率，将指数衰减函数 y = A·exp(-t/τ) 拟合到 5’ 和 3’ mRNA 信号的最终衰减区域（例如 图4B）。拟合参数 τ 即为 mRNA 的平均寿命。
- （可选）基于每个细胞中 mRNA 数量的分布（由步骤 9.5 计算得出），分析基因表达的细胞间变异（例如 图4C 所示的细胞水平对诱导的响应）。
- （可选）利用来自步骤 9.2 获得的荧光点在细胞长轴和短轴上的位置信息，分析 mRNA 的定位（图4D，E）。
- （可选）通过比较在 Cy5 和 Cy3 通道中检测到的荧光点的定位，分析 5’ 和 3’ mRNA 的共定位（图5）。
- 在 microbeTracker 的 spotFinderF 功能中加载多色微珠图像（步骤 8.6），获取 Cy5 和 Cy3 通道中微珠质心的坐标。利用质心坐标列表计算仿射变换矩阵，该矩阵描述了 Cy5 和 Cy3 通道之间的相对平移和旋转关系29。
- 将仿射变换矩阵应用于 Cy5 和 Cy3 的 FISH 图像，将 Cy3 图像转换至 Cy5 坐标系。判断一个通道中的荧光点是否与另一通道中的荧光点共定位。例如，若 Cy5 通道中某荧光点与 Cy3 通道中另一荧光点的质心距离小于 150 nm，则认为二者共定位（图5）。
- 分析在每个时间点有多少 Cy5 荧光点被归类为与 Cy3 荧光点“共定位”。同时分析共定位荧光点的强度（图5）。
结果
图3展示了本smFISH实验方案的代表性图像。在全视野（使用本文所述显微镜设置，视野大小为86.7 μm × 66.0 μm，详见材料表）中，可见约500个E. coli细胞分散在整个视野中（图3A）。如果细胞密度显著高于本图所示，则自动细胞分割将变得困难，因为当细胞相互接触时，分割算法无法可靠地识别单个细胞。为获得视野中最佳的细胞密度，需调整细胞浓度以及用于细胞贴壁的孵育时间（步骤5.1）。
为进行细胞分割，相差显微图像中细胞的形态应与活细胞保持相似（图3A-C）。如果细胞通透过度，细胞形态会发生改变（呈现“鬼影”状；补充图1）。此时，可缩短第5.3步中70%乙醇处理的时间。
诱导前，lacZ 的平均表达水平约为每细胞 0.03 个 mRNA，与先前报道一致15,30。此外，诱导前 lacZ mRNA 斑点强度的分布由于存在高强度斑点，与正态分布或泊松分布均不完全吻合（图 3D、E）。这表明在抑制状态下检测到的大多数斑点代表单个 lacZ mRNA，但有少量斑点包含多个 lacZ mRNA。为了分离出仅含单个 lacZ mRNA 的群体，我们采用具有两个混合成分的高斯混合模型（图 3D、E 中的插图）。随后，将第一个高斯分布的均值作为单个 mRNA 斑点的平均强度（例如，图 3D 中黑色曲线的峰值），并以此将时间序列实验中检测到的任何斑点强度转换为 mRNA 数量。为计算单个细胞内 mRNA 的总数，对每个细胞中的归一化斑点强度进行求和（图 3F）19。
当 lacZ mRNA 的表达水平较低时，细胞内存在一个或两个空间上分离的、衍射受限的 lacZ mRNA 斑点。因此，可通过二维高斯拟合分析这些斑点的强度和定位。
当表达水平较高，导致细胞内斑点相互重叠时，二维高斯拟合无法进行可靠的定量。在这种情况下，应通过将细胞内总荧光信号（扣除背景后）除以单个mRNA的平均荧光强度来计算mRNA水平19。
当lacZ表达被诱导时，5’端lacZ mRNA信号首先增加，随后3’端lacZ mRNA信号上升（图4B）。若lacZ表达受到抑制，则5’端和3’端lacZ mRNA信号均会下降，且两者之间存在一定的时间延迟（图4B）。为获得转录延伸速率，首先对5’端和3’端信号的上升阶段进行直线拟合（图4B），并将两条直线x轴截距的差值视为RNAP在两个探针区域之间（2,000 nt）移动所需的时间。转录延伸速率可由每次时间过程实验测得，并通过重复实验计算标准偏差。在本实验条件下，转录延伸的平均速率为15–30 nt/s19。
此外，通过用指数函数拟合衰减区域，得到了mRNA降解速率（即平均mRNA寿命的倒数）（图4B）。我们的时间过程数据包含了转录过程中及转录结束后发生的mRNA降解31。我们对3’端mRNA开始衰减后的时间点（t > 6 min）进行拟合，以探究释放后的mRNA的降解情况。结果显示，5’或3’端lacZ mRNA的平均寿命约为90秒19。
转录起始速率可通过诱导后5’端信号上升斜率（图4B，蓝色）计算，或通过稳态下的平均mRNA数量计算（即起始速率除以降解速率）。此外，可提前终止转录的概率也可进行估算，方法为3’端信号上升斜率与5’端信号上升斜率之比32，或稳态下3’端与5’端mRNA区域水平之比19。
由于smFISH是一种单细胞技术，我们可以分析细胞间转录的异质性。例如，可以分析在加入IPTG后表达lacZ mRNA的细胞所占的百分比（图4C）。还可以探究mRNA定位在诱导后是否发生变化。我们观察到5’和3’ lacZ mRNA信号略微向外移动，远离细胞中心（图4D,E），这与先前的一项报道一致33。
最后，对5’和3’ mRNA信号点之间的共定位分析具有重要意义（图5A）。例如，在抑制状态（时间零点）下，约有25%的5’ mRNA信号点与3’ mRNA信号点共定位。在t = 1分钟时，许多基因位点已开始合成5’ mRNA，但尚未开始合成3’ mRNA，因此大多数5’ mRNA信号点单独存在，无3’ mRNA信号（即共定位概率较低）。然而，当3’ mRNA出现时（即t = 2分钟），共定位的概率上升（图5A、B中的紫色箭头）。共定位变得频繁的这一时间点取决于转录延伸速率。在此时间点检测到的每个共定位信号点内5’和3’ lacZ mRNA数量的二维密度图可用于推断lacZ基因上RNAP的密度（图5C）。如先前报道19，该图中5’ mRNA的数量表明，当使用1 mM IPTG诱导lacZ表达时，大多数lacZ位点上的RNAP数量少于10个。此外，该图中3’ mRNA的数量与RNAP的聚集状态相关34。3’ mRNA数量接近于1的事实表明，大约仅有一个RNAP进入3’探针区域。这说明lacZ基因上的RNAP在空间上是分离的，而非形成簇状（或“车队”）结构。
图1：针对目标mRNA的smFISH探针设计。（A）平铺法。选择一系列短DNA寡核苷酸序列（长度约20 bp），使其能够覆盖目标mRNA。寡核苷酸探针用荧光染料分子进行标记。（B）阵列法。将一个串联重复的非编码序列阵列（例如“lacO阵列”）在转录水平上与目标mRNA融合。使用针对重复单元的荧光标记探针（例如长度为17 bp的lacO探针）来放大mRNA信号。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：单分子荧光原位杂交（smFISH）实验流程示意图及各步骤所需时间。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：smFISH图像分析。（A–C）在M9基本培养基（添加0.2%甘油、0.1%酪蛋白氨基酸和1 mg/L硫胺素）中于30 °C培养的野生型E. coli（MG1655）中5’ lacZ mRNA（红色）和3’ lacZ mRNA（绿色）的smFISH显微图像。（A）在t = 0 min时加入0.05 mM IPTG诱导、t = 1.5 min时加入500 mM葡萄糖抑制后，t = 3 min时样品的代表性图像。相位对比图像与Cy5（用于检测5’ lacZ mRNA，红色）和Cy3（用于检测3’ lacZ mRNA，绿色）的两个荧光图像经伪彩色叠加显示。图像展示了一个86.7 μm × 66.0 μm的完整视野。比例尺：5 μm。（B）（A）中黄色框区域的放大图像。细胞轮廓以白色显示，图像分析识别出的荧光点以红色圆点标示。比例尺：1 μm。（C）在高表达条件下（加入1 mM IPTG诱导后t = 4 min）细胞轮廓与荧光点的检测结果。比例尺：1 μm。（D–E）在添加IPTG前（抑制状态）测得的5’和3’ mRNA荧光点强度分布。直方图中叠加了两个高斯函数（黑色和灰色），其均值来自高斯混合模型。插图显示了由高斯混合模型生成的随机数与实验测得的mRNA荧光点强度之间的分位数-分位数图（5’ mRNA n = 1040，3’ mRNA n = 680）。（F）来自（B）图中标注单个细胞的信息。对于特定细胞（i），在Cy5和Cy3通道中识别出荧光点，并通过二维高斯拟合量化其强度（I）以及沿细胞短轴和长轴的坐标（d，l）。归一化后，将荧光点强度求和，得到该细胞中5’或3’ mRNA的总数。此外，不同通道间荧光点的共定位也可进行分析，示例见图5。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：体内转录动力学与 mRNA 降解分析。（A）通过双色单分子荧光原位杂交（smFISH）实验测量 lacZ mRNA 水平随时间变化的示意图及代表性图像。红色和绿色虚线分别表示靶向 E. coli 中 lacZ mRNA 5’端和3’端各1 kb区域的Cy5或Cy3B标记寡核苷酸探针。图中还显示了在 t = 0 min 时用 0.2 mM IPTG 诱导后指定时间点的两个荧光图像与相差图像的叠加结果。在 t = 1.5 min 时加入 500 mM 葡萄糖以抑制转录。比例尺为 1 μm。该图改编自 Kim 等人19。（B）实验（A）中每个细胞内 5’和 3’ lacZ mRNA 数量随时间的变化。误差线为自助法计算的标准误（SEM）。每个时间点至少分析了 1,200 个细胞。5’和 3’ mRNA 信号的初始上升阶段通过直线拟合（蓝色）。x 轴截距之差为 1.93 分钟，由此得出平均转录延伸速率为 17.3 nt/s。5’和 3’ mRNA 信号的最终衰减阶段通过指数衰减函数拟合（灰色）。拟合参数表明，5’ mRNA 的平均寿命为 1.52 分钟，3’ mRNA 为 1.66 分钟。（C）实验（A）过程中含有一个或多个 lacZ mRNA 斑点的细胞百分比。误差线为自助法计算的标准误。（D）斑点沿细胞短轴的定位。可通过将斑点沿短轴的位置（d）除以细胞半宽（w）来量化其与细胞膜的接近程度。（E）实验（A）过程中 5’和 3’ lacZ mRNA 斑点沿细胞短轴定位的变化。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：5’和3’ mRNA 位点共定位的分析。（A）诱导后5’和3’ mRNA 位点之间预期共定位的示意图。当3’ mRNA 生成时，5’ mRNA 位点与3’ mRNA 位点共定位的概率增加（紫色箭头）。（B）用1 mM IPTG 诱导后的共定位概率。紫色箭头指示的是根据（A）图示中首次频繁出现共定位的时间点。（C）在用1 mM IPTG 诱导后 t = 2 min 时检测到的共定位位点内 lacZ mRNA 的5’和3’数量（共841个位点）。灰色点代表单个共定位位点，红色点代表分箱数据的平均值。误差条表示标准误（SEM）。图中灰色的深浅表示特定区域内数据点的密度。虚线表示斜率为1的线。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：探针杂交条件的优化。 使用了两种样品：按照图3所述条件培养的MG1655细胞，未诱导（蓝色）或经0.5 mM IPTG处理20分钟（红色）。探针杂交溶液中含有不同浓度的探针（共72条Cy5标记的探针，覆盖整个lacZ区域）和甲酰胺。预杂交溶液和洗涤溶液中的甲酰胺浓度也相应调整。“无探针”（灰色线）表示在杂交步骤中未添加探针但添加了IPTG的细胞的荧光水平。平均荧光强度经细胞面积归一化（AU）后由300–800个细胞计算得出。误差线为自助法计算的标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图 1：因过度通透化导致的细胞形态扭曲。MG1655 细胞在用 1 mM IPTG 诱导 5 分钟后，相位对比（灰度）、5’ lacZ mRNA（Cy5，红色）和 3’ lacZ mRNA（Cy3，绿色）图像的叠加图。(A) 一个示例，显示正常细胞与失去正常形态的过度通透化细胞（以粉红色箭头指示）的混合物。(B) 一个示例，显示成团聚集的“ghosty”细胞。比例尺 = 1 µm。 请点击此处下载该文件。
| DEPC 水 | ||||
| 向超纯水中加入 0.1% DEPC，将瓶子（加盖）于 37°C 培养箱中孵育过夜，次日进行高压灭菌。 | ||||
| DEPC PBS (10X) | ||||
| 混合以下成分： | ||||
| 80 g | NaCl（终浓度 1.37 M） | |||
| 2 g | KCl（终浓度 27 mM） | |||
| 14.2 g | Na2HPO4（终浓度 100 mM） | |||
| 2.7 g | KH2PO4（终浓度 20 mM） | |||
| 加超纯水至 1 L | ||||
| 用 0.22 μm 滤膜过滤至玻璃瓶中。 | ||||
| 加入 0.1% DEPC，并按照 DEPC 水的操作说明处理。 | ||||
| 配制 1X 溶液时，用 DEPC 水稀释 10 倍。 | ||||
| 1M DEPC 磷酸钠缓冲液，pH 7.4 | ||||
| 混合以下成分： | ||||
| 115 g | Na2HPO4 | |||
| 22.8 g | NaH2PO4 | |||
| 加超纯水至 1 L | ||||
| 用 0.22 μm 滤膜过滤至玻璃瓶中。 | ||||
| 加入 0.1% DEPC，并按照 DEPC 水的操作说明处理。 | ||||
| 4X 固定液（16% 甲醛） | ||||
| 5 mL | 20% 甲醛 | |||
| 500 µL | DEPC 水 | |||
| 750 µL | 1M DEPC 磷酸钠缓冲液，pH 7.4 | |||
| 4 °C 保存，可保存 2–4 周。 | ||||
| 注意：甲醛具有毒性。配制该溶液时需佩戴手套并在通风橱中操作。 | ||||
| 洗涤液 | ||||
| 混合以下成分： | ||||
| 10 mL | 甲酰胺（终浓度 25%） | |||
| 4 mL | 20X SSC（终浓度 2X） | |||
| 用 DEPC 水定容至 40 mL | ||||
| 用 0.22 μm 滤膜过滤，4 °C 保存 | ||||
| 注意：甲酰胺具有毒性。配制该溶液时需佩戴手套并在通风橱中操作。 | ||||
| 预杂交液 | ||||
| 200 µL | 甲酰胺（终浓度 20%） | |||
| 100 µL | 20X SSC（终浓度 2X） | |||
| 10 µL | 100X VRC（终浓度 1X） | |||
| 25 µL | 4% (w/v) BSA（终浓度 0.1%） | |||
| 685 µL | DEPC 水 | |||
| 注意：取 10 µL VRC 储存液前需充分涡旋混匀。 | ||||
| 注意：甲酰胺具有毒性且为已知致畸剂。操作时需佩戴手套并在通风橱中进行。 | ||||
| 探针杂交液 | ||||
| 200 µL | 甲酰胺（终浓度 20%） | |||
| 100 µL | 20X SSC（终浓度 2X） | |||
| 10 µL | 100X VRC（终浓度 1X） | |||
| 25 µL | 4% (w/v) BSA（终浓度 0.1%） | |||
| 10 µL | 40 mg/mL 大肠杆菌 tRNA（终浓度 0.4 mg/mL） | |||
| 200 µL | 50% 硫酸葡聚糖（终浓度 10%） | |||
| x µL | 5’ mRNA 探针组（来自步骤 1.12），终浓度为 4 nM。 | |||
| y µL | 3’ mRNA 探针组（来自步骤 1.12），终浓度为 4 nM。 | |||
| - | 用 DEPC 水补足总体积至 1 mL | |||
| 注意：最后加入硫酸葡聚糖。因其黏度高，从 50% 储存液中吸取 200 μL 前应剪去移液器吸头末端。加入硫酸葡聚糖后，需反复吹打混匀溶液。 | ||||
表1：所用溶液的配制配方。
讨论
在此，我们介绍了一种用于测量mRNA动力学的smFISH实验方案 E. coli在先前发表的用于细菌的smFISH方案中23，细胞在实验全程始终保留在离心管中，直至准备成像时才进行转移。尽管该方法具有诸多优势，例如可显著减少荧光探针在盖玻片表面的非特异性结合23，当存在这些协议时，遵循它们是困难的 许多样品 来自时间过程实验。首先，取相对较大体积的细胞（>1 mL）需要在固定前进行取样甚至收获。其次，在杂交步骤之后，细胞样品需要经过多次离心以更换溶液并进行洗涤。在本方案中，使用小体积（<1 mL 培养物直接与固定液在 1.5 mL 离心管中混合，有助于在取样瞬间快速“冻结”细胞状态。此外，细胞在整个操作过程中始终保持附着在表面，通过真空过滤系统吸除液体，并使用多通道移液器一次性加入溶液液滴，可实现不同溶液的快速更换。这一差异使得本方案在需要同时处理大量样本时具有显著优势。采用本方案，可同时处理 12–48 个样本，整个 FISH 操作可在约 8 小时内完成，与处理少量样本所需时间相近图2）。尽管我们使用了表达 lacZ 在 E. coli 例如，该方案经过下文讨论的若干考虑后，可广泛适用于不同基因和细菌种类。
对于不同的基因，首先需要考虑的是smFISH探针。可以设计覆盖目标mRNA的寡核苷酸探针图1A)13在这一“平铺”探针方法中，每个探针长约20个碱基，并在5’或3’末端标记有荧光染料。该策略无需进行基因操作，使用方便。或者，可采用串联重复序列 约20 bp长度的序列，且该序列在基因组序列中不存在（例如，一段阵列） lacO 序列在 Caulobacter crescentus14），可插入目的基因的非翻译区，并使用一条与重复单元互补的单探针来标记mRNA（“阵列”方法； 图 1B在这两种情况下，多个荧光基团标记同一条mRNA，产生放大的荧光信号，可轻松将其与单个探针在细胞内的非特异性结合区分开来。
选择“拼接”（tiling）还是“阵列”（array）方法取决于阴性对照，即不含目标mRNA、用于检测探针非特异性结合的样本。对于拼接探针（图1A），缺乏目的基因的突变菌株或目的基因不转录的条件（例如，lacZ基因的抑制）可作为检测探针非特异性结合的阴性对照。对于基于阵列的单分子FISH（smFISH）（图1B），不含阵列的野生型菌株可作为阴性对照，因为其基因组中不存在探针的结合位点。
最佳杂交条件可能取决于探针序列，甚至荧光染料的选择。我们通过将杂交温度保持在 37 °C，并测试杂交溶液中不同浓度的探针组和甲酰胺，对 lacZ 探针组的杂交条件进行了优化。较高浓度的甲酰胺倾向于降低非特异性和特异性结合26,35。我们建议在保持杂交时间和温度不变的前提下，系统性地改变杂交及其洗涤条件。随着条件变得更加严格，非特异性和特异性结合均会下降（图 6）。关键是要找到一个临界点，使非特异性结合降至可接受阈值以下，同时又不进一步损害特异性结合。例如，我们将未添加任何探针时获得的信号水平（“无探针”）作为阈值（图 6）。
双色smFISH方法通过标记mRNA的两个不同区域，仅适用于较长的基因。为了 测量 转录延伸速率，我们利用了lacZ基因较长（3075 bp）且其表达可由IPTG诱导的特性。当基因较短时，难以设计两组分别靠近5’端和3’端的平铺探针，并分辨5’与3’ mRNA区域出现之间的时间延迟。在此情况下，可通过smFISH在稳态下计数新生mRNA，并使用将转录延伸速率作为拟合参数的解析模型分析其分布20。此外，当目标基因不可诱导时，可在时间零点用利福平处理细胞，并测量5’和3’ mRNA亚区域随时间的变化。随后，可根据5’ mRNA信号下降到3’ mRNA信号下降之间的延迟来计算转录延伸速率，该方法此前已有应用31。
最后，smFISH 实验方案具有良好的通用性，可与其他标记方法联用。此前，通过将 mRNA FISH 与 DNA FISH14 或荧光报告-操纵子系统20相结合，可实现 DNA 位点与 mRNA 的共可视化。通过将免疫荧光与 mRNA FISH 联用，还可 对蛋白质产物进行可视化观察14,36。此外，该方法还可与三维超分辨率显微镜技术37相结合，实现 mRNA 在三个维度上的可视化38,39。
披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
该实验方案由 S.K. 在耶鲁大学霍华德·休斯医学研究所及微生物科学研究所 Christine Jacobs-Wagner 博士实验室进行博士后研究期间开发。我们感谢 Jacobs-Wagner 博士及其实验室成员在方法开发过程中提供的各种帮助，以及 Laura Troyer 对稿件的审阅。S.K. 感谢 Searle 学者项目的支持；K.V. 感谢伊利诺伊大学 James Scholar Preble 研究奖的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌菌株 | |||
| 大肠杆菌 MG1655 | |||
| 化学品、多肽及其他 | |||
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC 缓冲液 B |
| 氯化铵 | Fisher Chemical | A661-500 | 用于配制 M9 培养基 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | B2518 | 探针杂交 |
| 氯化钙 | Acros Organics | 349610250 | 用于配制 M9 培养基 |
| 酪蛋白氨基酸 | BD Difco | 223050 | 用于配制 M9 培养基 |
| Cy3B NHS 酯 | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | FISH 探针用荧光染料 |
| Cy5 NHS 酯 | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | FISH 探针用荧光染料 |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| 硫酸葡聚糖 | Millipore | S4030 | 探针杂交 |
| 右旋葡萄糖 | Fisher Chemical | D16 | 用于抑制 lacZ 表达 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | 用于溶解荧光染料 |
| 大肠杆菌 tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | 探针杂交 |
| 乙醇 | Decon Laboratories | 2701 | 用于 DNA 纯化、裂解及盖玻片清洗 |
| FISH 探针 | Biosearch Technologies | 序列见参考文献 #16 | |
| 甲醛 | Ladd Research Industries | 20295 | 固定 |
| 甲酰胺 | American Bio | AB00600 | 探针杂交、预杂交及洗涤 |
| 甘油 | Americanbio | AB00751-01000 | 用于配制 M9 培养基 |
| 异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG） | Invitrogen | 15529019 | 诱导 lacZ 表达 |
| 硫酸镁 | Fisher Chemical | M65-500 | 用于配制 M9 培养基 |
| 2-硝基苯基 β-D-呋喃糖苷（ONPF） | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | 抑制 lacZ 表达 |
| Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | 密封剂 |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P8920 | 用于处理盖玻片表面 |
| 氯化钾 | Fisher BioReagents | BP366-500 | 用于配制 PBS |
| 磷酸二氢钾 | Fisher BioReagents | BP362-500 | 用于配制 PBS 和 M9 培养基 |
| 利福平 | Sigma-Aldrich | R3501 | 终止转录起始 |
| 氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC） | Invitrogen | AM9763 | 探针杂交、预杂交及洗涤 |
| 碳酸氢钠 | Fisher BioReagents | BP328-500 | 荧光染料-探针偶联 |
| 氯化钠 | Fisher BioReagents | BP358-1 | 用于 DNA 纯化、PBS 及 M9 培养基 |
| 磷酸氢二钠 | Fisher BioReagents | BP332-500 | 用于配制 PBS 和 M9 培养基 |
| 磷酸二氢钠 | Fisher BioReagents | BP329-500 | 用于配制磷酸钠缓冲液 |
| Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | 盖玻片用疏水标记笔 |
| TetraSpek 微球 | Invitrogen | T7280 | 多通道图像配准对照 |
| 硫胺素 | Sigma-Aldrich | T1270 | 用于配制 M9 培养基 |
| 三乙基乙酸铵 | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC 缓冲液 A |
| 钒酰核糖核苷复合物（VRC） | Sigma-Aldrich | 94742 | 探针杂交和预杂交 |
| 设备 | |||
| C18 柱 | Waters | Acquity BEH C18 柱 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5425 | |
| 台式孵育器 | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
| 孵育箱（烘箱） | Thermo Scientific | 51030514 | 重力对流式 |
| 水纯化系统 | Millipore | Milli-Q Reference | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | 2000C | |
| 氮气 | 建筑物供气 | 用于吹干盖玻片和载玻片 | |
| UPLC | Waters | Acquity UPLC 系统 | |
| 真空泵与抽滤装置 | 建筑物供气 | 抽滤装置由带侧臂的过滤瓶构成 | |
| 真空浓缩仪 | Labconco | 7810010 | Centrivap；用于干燥 UPLC 收集的样品 |
| 涡旋振荡器 | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
| 摇床水浴 | New Brunswick | Innova 3100 | 对时间进程实验至关重要 |
| 超声水浴 | VWR | 97043-960 | 用于清洗盖玻片和载玻片 |
| 工具 | |||
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 22431021 | DNA 低吸附管 |
| 1000 µL 吸头盒 | Denville Scientific | P1126 | 使用完所有吸头后的空盒 |
| 柯普林瓶 | SPI | 01240-AB | 用于清洗盖玻片和载玻片 |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
| 带滤芯吸头 | Denville Scientific | P1121, P1122, P1126 | SHARP® 精密屏障吸头 |
| 镊子 | SPI | K35a | 用于夹取洁净的盖玻片和载玻片 |
| 载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| 手套 | Microflex | MK-296-M | |
| 多通道移液器 | Eppendorf | 2231300045 | 用于洗涤步骤（#7） |
| 移液器 | Gilson | P1000, P200, P20 | |
| 试剂储液槽 | MTC Bio | P8025-1S | 用于洗涤步骤（#7） |
| 注射器滤器（0.22 µm） | Millipore | SLGS033SS | |
| 计时器 | VWR | 62344-641 | |
| 软件与算法 | |||
| MATLAB | Mathworks | R2013 及以上版本 | https://www.mathworks.com |
| MicrobeTracker 或 Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
| https://oufti.org/ | |||
| Stellaris 探针设计软件 | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
| 显微镜 | |||
| CCD 相机 | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
| Cy3 滤光片组 | Chroma | 49004 | |
| Cy5 滤光片组 | Chroma | 49006 | |
| 落射荧光显微镜 | Nikon | Eclipse Ti | 用于相差与落射荧光成像 |
| 荧光激发光源 | Lumencor | SOLA-E | |
| Nikon Elements 软件 | Nikon | 控制显微镜系统的软件 | |
| 相差 100× 物镜 | Nikon | Plan Apochromat（NA 1.45） | |
| 探针序列 | |||
| 5' 端带有 C6 氨基修饰的 DNA 寡核苷酸 | Biosearch Technologies Inc | ||
| lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
| lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
| lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
| lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
| lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
| lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
| lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
| lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
| lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
| lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
| lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
| lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
| lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
| lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
| lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
| lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
| lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
| lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
| lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
| lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
| lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
| lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
| lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
| lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
| lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
| lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
| lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
| lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
| lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
| lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
| lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
| lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
| lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
| lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
| lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
| lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
| lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
| lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
| lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
| lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
| lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
| lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
| lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
| lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
| lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
| lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
| lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
| lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
| lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
| lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
| lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
| lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
| lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
| lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
| lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
| lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
| lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
| lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
| lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
| lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
| lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
| lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
| lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
| lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
| lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
| lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |
参考文献
- Bervoets, I., Charlier, D. Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).
- Epshtein, V., Nudler, E. Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation. Science. 300 (5620), 801-805 (2003).
- Vogel, U., Jensen, K. F. The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate. Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).
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