通过脊髓圆锥横断建立大鼠逼尿肌活动低下模型

摘要

我们介绍了一种通过大鼠脊髓圆锥横断建立逼尿肌活动低下模型的方法。在这些动物中成功诱导了逼尿肌活动低下。该模型可用于泌尿系统功能的研究。

摘要

本研究方案旨在通过胸髓圆锥横断建立大鼠逼尿肌活动低下（DU）模型。对总共40只雌性Wistar大鼠（对照组：10只；实验组：30只，体重200–220 g）进行椎板切除术，并在实验组中于L4‒L5水平横断胸髓圆锥。所有大鼠均在相同的环境条件下饲养六周。实验组大鼠每日进行两次排尿，持续六周，并记录平均残余尿量。对两组大鼠均进行膀胱压力测定，记录并计算最大膀胱测压容量（MCC）、逼尿肌开启压力（DOP）以及膀胱顺应性。实验组大鼠术后表现出显著的尿潴留，无论是在脊髓休克期还是休克期之后均如此；而对照组未观察到异常。与对照组相比，实验组的MCC和膀胱顺应性显著升高（3.24 ± 2.261 mL 对比 1.04 ± 0.571 mL；0.43 ± 0.578 mL/cmH₂O 对比 0.032 ± 0.016 mL/cmH₂O），而实验组的DOP则低于对照组（20.28 ± 14.022 cmH₂O 对比 35 ± 13.258 cmH₂O）。通过胸髓圆锥横断建立DU动物模型的方法为更深入理解DU的病理生理机制提供了良好机会。

引言

逼尿肌活动低下（detrusor underactivity, DU）是一种常见的下尿路功能障碍，但迄今研究仍不充分。尽管国际尿控协会（International Continence Society, ICS）已对DU作出定义¹，目前仍使用多种不同术语来描述该疾病，例如“逼尿肌衰竭”（detrusor failure）、“无收缩性膀胱”（acontractile bladder）、“逼尿肌无反射”（detrusor areflexia”²。根据国际尿控协会（ICS）2002年的定义，DU是指逼尿肌收缩强度和持续时间减弱，导致膀胱排空时间延长，从而无法在正常时间内完成膀胱完全排空。

DU可能影响48%的男性和12%的女性（年龄 >70年³ 伴有下尿路症状。其病因似乎为多因素所致，目前尚无有效治疗方法。据报道，逼尿肌无力在神经源性膀胱功能障碍患者中普遍存在，例如多发性硬化症患者⁴糖尿病⁵，帕金森病⁶，或脑卒中⁷. DU 也可能由医源性神经损伤引起，例如腹腔镜下子宫切除术、前列腺切除术或其他盆腔手术⁸由于缺乏合适的动物模型用于研究，消化性溃疡的病理生理学变化及现有治疗方法仍不明确。

排尿反射由脊髓-脑桥-脊髓通路控制，该通路整合了脑桥排尿中枢、骶髓副交感核以及更高级的皮层中枢⁹。排尿反射的启动与维持主要依赖于感觉信号从膀胱向更高级皮层中枢的规律性传递。可以推测，感觉功能障碍可能参与了排尿无力（DU）的发生。

大多数与下尿路功能障碍相关的实验动物研究都集中在膀胱过度活动症（OAB）模型上¹⁰。这些模型有助于合理理解OAB的病理生理学机制和预后情况。然而，目前报道的排尿困难（DU）模型较少，例如上脊髓损伤（局部病灶、去大脑化和大脑中动脉闭塞）、脊髓横断或挫伤性损伤，以及全身性（如环磷酰胺）或膀胱内给予刺激性或炎性物质（如酸、丙烯醛和脂多糖）^11,12,13,14。在这些方法中，仅有脊髓横断或挫伤性损伤可用于建立DU动物模型¹³。由于创伤严重，针对脑桥排尿中枢及更高级皮层中枢的损伤尝试已被放弃。因此，目前正越来越关注在排尿反射中枢中寻找一个精确的位置，以诱导产生最小副作用的DU模型。

如前所述，诱导排尿功能障碍（DU）的机制之一是损伤脊髓，从而破坏排尿反射的信号通路。Allen’s 重物坠落法被开发用于建立脊髓损伤的实验动物模型¹⁵。然而，目前尚无关于该方法的进一步实验数据。此外，由于部分动物在脊髓损伤后恢复了脊髓功能而未出现排尿功能障碍，因此该方法不能被视为建立排尿功能障碍动物模型的理想方法¹⁶。

1987年，Bregman设计了一种横断脊髓的方法以建立DU动物模型，并获得了实验数据¹⁷。然而，该方法并未被用于成功建立DU动物模型。当时，研究人员对DU的发病机制仍存在困惑。由于脊髓中与OAB或DU发生相关的区域彼此相邻，研究者难以确定诱导DU所需的精确脊髓损伤部位¹⁷。该方法可能同时或单独引发OAB和DU。因此，尽管该方法可导致DU出现，但其操作不够精确，无法用于深入理解DU的发生机制及病理过程。

如上所述，缺乏合适的消化性溃疡动物模型是研究消化性溃疡的主要障碍之一。研究人员一直在寻找能够模拟消化性溃疡病理过程的准确且易于操作的动物模型。甚至在过去20年中，消化性溃疡的治疗方案也未取得显著进展。因此，迫切需要建立一套标准的消化性溃疡动物模型制备方案。

因此，本文描述了一种通过脊髓圆锥横断成功建立大鼠DU模型的方法。手术在L4‒L5水平进行横断，以分离脊髓圆锥。记录并分析最大膀胱测压容量（MCC）、逼尿肌开启压（DOP）和膀胱顺应性，以验证该方案的有效性。下述方案以标准化的方式结合了可行性和可靠性，用于建立DU动物模型，模拟DU的发生及病理过程。该方案可作为进一步研究DU的一种技术手段。

方案

所有大鼠的使用均遵循首都医科大学北京友谊医院动物实验伦理委员会批准的方案。

1. 手术准备、麻醉及手术技术

注意：本研究共使用40只雌性Wistar大鼠，体重为200–220 g，均从商业渠道获得。将40只大鼠中的10只随机选为对照组，其余作为实验组。所有动物均饲养于首都医科大学北京友谊医院动物实验设施的无菌环境中。

1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）实施全身麻醉。或者，诱导 使用3%-4%异氟烷进行麻醉，并以1%-3%（吸入）维持。将眼用软膏涂抹于眼部 用眼药膏保护眼睛以防止干燥。然后将大鼠置于手术台上 并提供热支持。 
   注意： 在操作开始时，皮下注射0.05 mg/kg的布托啡诺（buprenorphine）作为镇痛剂，剂量为0.1–0.2 mL。
2. 通过脚趾夹捏无反应来检查麻醉深度。使用剃刀剃除背部整个区域的毛发。
3. 用氯己定或聚维酮碘进行两步法擦洗，再使用异丙醇，至少重复3个循环，对手术部位进行消毒。用手术胶带固定四肢，使用手术剪在背部做一条约3 cm的正中切口。
4. 使用手术剪沿皮下组织加深切口 并切断附着在脊柱上的肌肉。
5. 直观识别并暴露第13个^th 肋骨（与该肋骨相连的椎间隙为T13‒L1节段）。标记第13肋^th 使用缝线缝合肋骨。
6. 确认后，仔细切除附着于脊柱的肌肉，暴露椎体。切除棘上韧带和棘间韧带，以准确定位椎体。使用手术剪暴露L4‒L5节段。 和镊子。
   注意：由于皮下组织较薄，棘上韧带很容易辨认。切除棘上韧带后，位于棘突之间的韧带为棘间韧带。
7. 使用凯利钳仔细剥离L4‒L5椎骨棘突及部分横突，以暴露脊髓（图1).
8. 在L4‒L5水平完全暴露脊髓圆锥，使用虹膜剪完全横断脊髓圆锥。置入部分组织填塞物以阻断脊髓的再生。
9. 使用4-0不可吸收缝线将表层肌肉和皮肤缝合于外层皮肤。
10. 对照组执行步骤1.1‒1.7，保留脊髓圆锥完整，按照步骤1.9关闭切口。

2. 动物恢复

1. 将大鼠置于温度控制的孵育箱（37 °C）中，术后第一小时内保持此条件，并持续监测直至其恢复意识 胸骨的或主动运动的
   注意：完全恢复大约需要半小时。
2. 将动物转移到干净的笼子中，确保提供充足的食物和水。将大鼠分别饲养在不同的笼子中。
   注意：当实验组大鼠仅能依靠前肢移动，而对照组大鼠可正常行走时，表明横断手术成功。

3. 术后管理

1. 腹腔注射青霉素G（一种抗生素，每只动物50,000 U/mL）。术后48小时内，每6-12小时皮下注射一次镇痛剂（如丁丙诺啡，0.05 mg/kg，0.1-0.2 mL ）。
2. 在耻骨上区压迫膀胱以协助排尿。每日固定时间进行两次（上午8点和晚上8点），持续六周。
   注：逼尿肌正常收缩功能的丧失是DU的标志。
3. 将所有大鼠饲养于代谢笼中，每个笼内放置尿液收集漏斗，并置于预先称重的吸水纸上，以监测排尿及尿失禁情况。
4. 分别收集并记录吸水纸的重量变化（反映排尿量，VV）以及残余尿量。

4. 尿动力学检测

1. 术后六周，使用尿动力学测量设备进行膀胱压力测定，步骤如下：
   1. 通过腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠。
   2. 按压膀胱以排空尿液，然后用胶带将大鼠固定在手术平台上。
   3. 将硬膜外导管（3F）插入膀胱，并通过三通管连接尿动力学测量设备、硬膜外导管和输液泵。
   4. 以0.2 mL/min的速度泵入生理盐水进行尿动力学测量（参见材料表）。记录膀胱最大容量（MCC）、排尿压（DOP）以及膀胱顺应性（通过逼尿肌压力变化量δ除以膀胱容积变化量δ计算得出）。

5. 统计分析

1. 使用商业软件进行统计分析。
2. 采用 Kolmogorov-Smirnov 检验对数据的正态性进行检验。
3. 正态分布的变量以均值±标准差表示。采用双尾配对 Student’s t 检验比较两组膀胱压力图参数。
   注意：p < 0.05 表示差异具有统计学意义。

结果

经验丰富的外科医生可在45分钟内完成整个脊髓圆锥横断手术过程。本实验室已成功实施超过100例脊髓圆锥横断手术，成功率超过95%（以大鼠存活并成功诱导排尿障碍为标准）。尿动力学检测证实了排尿障碍的成功诱导。

根据我们的经验，梗阻性尿路病（DU）的诱导情况可初步通过残余尿量进行评估。术后立即观察尿液潴留情况。在实验组中，尿量峰值出现在术后第二天，随后尿量逐渐减少并持续约十天。术后十天，尿量达到稳定水平图2）。观察发现，术后前10天内，平均残余尿量为2.09 ± 1.05 mL，至第10天时降至0.67 ± 0.21 mL^th 术后第二天。然而，对照组未观察到任何异常。

为了确认DU的诱导，需要进行尿动力学检测。检测组和对照组的代表性压力-容积曲线分别如图3和图4所示。与对照组相比，检测组的膀胱最大容量（MCC）和膀胱顺应性显著升高（...

讨论

排尿困难是男性和女性下尿路症状的常见病因。它是一组复杂的症状，治疗选择有限，可显著降低患者的生活质量（Qol）¹⁸。尽管认为排尿困难是多因素所致，但对其发病机制的理解仍处于初级阶段。研究表明，排尿困难的发病机制可能与肌源性和神经源性因素有关。

在肌源性假说中，观察到患有逼尿肌无力（DU）的个体可能比健康老年人经历更显著的逼尿肌收缩力下降。研究发现，逼尿肌收缩力随年龄增长而减弱，且可能受到代谢性疾病或神经源性疾病等其他因素的影响。尿动力学评估数据显示，逼尿肌无力和排尿后残余尿量增加与衰老相关¹⁹。一项研究表明，22.1%的男性和10.8%的女性（所有年龄> 60岁）报告存在膀胱排空困难³。其中，主要原因即为逼尿肌收缩力下降。糖尿病膀胱的研究显示出与逼尿肌无力相似的变化²⁰。肌肉与胶原比例的降低导致肌细胞间间隙增宽，可能是引起逼尿肌收缩力减弱的原因之一。大多数神经源性膀胱中也发现与年龄相关...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水	武汉普赛公司	EY-C1178	用于尿动力学测量的泵
10% 水合氯醛	山东玉龙有限公司	H37022673	按 3mL/kg 腹腔注射
盐酸丁丙诺啡注射液	天津药物研究院药业有限公司	H12020275	术后 24 小时和 48 小时皮下注射 0.05mg/kg
硬膜外导管	山东兴华有限公司	VABR3L	用于尿动力学测量
青霉素 G	阿尔塔科技有限公司	1ST5637	每只动物给予 50,000 单位/毫升
戊巴比妥钠	北京索莱宝科技有限公司	NK-WF0001	按 40 mg/kg 腹腔注射
缝合线（4-0）	ETHICON	VCP422H	缝合损伤部位
三通管	山东兴华有限公司	VAB3T	用于尿动力学测量
微量输液泵	浙江史密斯医疗器械有限公司	20162540335	以 0.2ml/min 的速度泵入生理盐水用于尿动力学测量
尿动力学测量设备	Medical Measurement Systems B.V.	08-0467	尿动力学测量设备不仅有助于排尿困难的诊断，还可为治疗及疗效评估提供客观依据，是临床诊治下尿路功能性疾病最常用的检查方法
Wistar 大鼠	北京华阜康生物科技股份有限公司	SCXK2012-0023	200-220g