本方案展示了利用机器人平台对脑切片中的单个神经干细胞和神经元进行显微注射的方法。该技术具有良好的通用性，可实现对组织中细胞的高空间分辨率追踪。
方法文章
利用机器人显微注射技术在脑切片中对单个神经干细胞和神经元进行操作
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
发育神经生物学中的一个核心问题是神经干细胞和前体细胞如何形成大脑。要回答这一问题，需要在时间进程中以高分辨率对脑组织中的单个细胞进行标记、操控和追踪。由于脑组织结构的复杂性，这一任务极具挑战性。我们近期开发了一种机器人系统，该系统利用显微镜获取的图像引导微注射针进入脑组织，从而将飞升级别的溶液注入单个细胞。机器人操作显著提高了效率，其总体产出比手动微注射高出一个数量级，实现了对活体组织中单细胞的精确标记和灵活操控。借助该系统，可在单个器官型脑片中完成数百个细胞的微注射。本文展示了微注射机器人在脑组织切片中对神经前体细胞和神经元进行自动化微注射的应用。更广泛地说，该系统可用于任何具有可触及表面的上皮组织。系统设置完成后，微注射机器人每分钟可完成15次或更多的微注射操作。由于其高通量和多功能性，该微注射机器人将使微注射成为生物工程、生物技术及生物物理学领域中一种简便、高效的细胞操控技术，广泛应用于器官型脑切片的单细胞分析。
引言
本方案描述了利用机器人在脑组织切片中靶向并操控单个细胞的方法，特别聚焦于单个神经干细胞和神经元。该机器人旨在解决发育神经生物学中的一个核心问题，即神经干细胞和前体细胞如何参与脑形态发生1,2,3,4,5。要回答这一问题，需要对单个神经干细胞进行标记和追踪，并随时间推移观察其谱系演化过程，从而将单细胞行为与组织形态发生相关联。这一目标可通过多种方式实现，例如在体电穿孔脑组织或使用亲脂性染料标记单个细胞。尽管这些方法功能强大，但它们缺乏精确的单细胞分辨率（如电穿孔），和/或无法操控细胞内空间（如亲脂性染料）。为克服这些局限，研究人员开发了单细胞显微注射技术6,7,8。在显微注射过程中，将移液管在压力作用下短暂插入完整组织内的单个细胞，以注入飞升级体积的试剂9。我们此前已描述过一种用于器官型组织中单个神经干细胞显微注射的手动操作流程（图1A）10,11。对神经干细胞的显微注射依赖于使用微移液管插入单个神经干细胞，注入含有荧光染料及其他目标分子的溶液。通过从侧脑室表面（或脑室，见图1A示意图）接近端脑发育区域，可实现对神经干细胞的选择性靶向，该表面由顶端前体细胞的顶膜构成（图1A示意图）。此过程需针对实验者希望注射的每一个细胞重复进行。此外，显微注射的成功与否取决于对微移液管插入组织的深度和持续时间的精确控制。因此，尽管该技术具有独特优势，手动显微注射极为繁琐，且需要大量练习才能达到合理的通量和成功率，使得该技术难以实现规模化应用。为克服这一限制，我们近期开发了一种图像引导的机器人系统——Autoinjector12（或称显微注射机器人），可自动完成对单个细胞的显微注射。
显微注射机器人利用显微成像和计算机视觉算法，精确定位组织内三维空间中的特定位置以进行显微注射（图1B）。该显微注射机器人可通过对手动显微注射系统进行相对简单的改造而构建。显微注射机器人的整体示意图如图1C所示。移液针安装在连接于三轴操纵器的移液针夹持器中。显微镜相机用于获取组织和显微注射针的图像。定制的压力调节系统用于控制移液针内部的压力，而可编程的微操纵器则用于控制显微注射移液针的位置。通过相机获取的组织和显微注射移液针的图像，确定移液针尖端的空间位置以及需要进行显微注射的位点。软件随后计算出移液针在组织内移动所需的轨迹。所有硬件均由我们先前开发的软件进行控制。全部软件使用编程语言（例如 Python 和 Arduino）编写，可从 https://github.com/bsbrl/Autoinjector 下载并附有使用说明。图形用户界面（GUI）允许用户对组织和微移液针进行成像，并自定义显微注射的轨迹。我们的系统可通过对配备明场和落射荧光滤光片的倒置显微镜进行相对简单的改装即可建立。
首先，我们提供制备脑类器官组织切片以进行显微注射的指导。接着，本方案说明了启动显微注射机器人以及在显微注射前需要完成的准备步骤，例如移液管运动校准。随后是设定注射参数。之后，用户可定义显微注射机器人所采用的注射轨迹，并启动注射程序。显微注射后的组织（本例中为脑类器官组织切片）可根据实验设计在体外培养不同时间10,11。随后可对组织进行处理，以追踪并研究被注射细胞及其子代细胞的身份与命运。 Alternatively，也可通过活细胞成像技术对显微注射的细胞进行动态观察。在本方案范围内，我们展示了利用机器人自动向小鼠E14.5背侧端脑的类器官切片中注射神经前体细胞的方法。该机器人还能够对小鼠端脑中的新生神经元以及人胎儿端脑组织进行显微注射12。
综上所述，我们描述了一种可用于追踪和操控组织中单个细胞的机器人平台。该平台利用压力进行操作，因此在待注射化合物的化学性质方面具有极高的通用性。此外，该平台还可经过调整以靶向干细胞以外的其他细胞。我们预计该系统也将易于适配于其他模式系统。
方案
所有动物实验均依照德国动物福利法规进行，并已获得德国德累斯顿地区动物实验伦理委员会（Tierversuchskommission, Landesdirektion Dresden）的必要许可。器官型脑片由 E14.5 或 E16.5 时期的 C57BL/6 小鼠胚胎端脑（Janvier Labs）制备。
1. 软件安装
- 请按照 https://github.com/bsbrl/Autoinjector 上的说明安装软件。
2. 试剂与移液器的准备
- 琼脂糖：分别取 3 g 宽范围琼脂糖和 3 g 低熔点琼脂糖，各自溶于 100 mL 细胞培养级 PBS 中，使用两个独立的 200 mL 玻璃瓶分别配制。室温保存，最长可保存 3 个月。
- 台氏液：将 1 g 碳酸氢钠和台氏盐（使用整瓶内容物）以及 13 mL 1 M HEPES 溶解于 1 L 蒸馏水中。调节 pH 至 7.4。使用 0.2 µm 瓶顶滤器过滤溶液。
- 切片培养基（SCM）：将 10 mL 大鼠血清、1 mL 2 mM 谷氨酰胺、1 mL 青霉素-链霉素（100 倍浓度）、1 mL N-2 补充剂（100 倍浓度）、2 mL B27 补充剂（50 倍浓度）和 1 mL HEPES 缓冲液（pH 7.3）加入 84 mL Neurobasal 培养基中。将 SCM 每 5 mL 分装至 15 mL 离心管中。于 -20 °C 保存。
- CO2-非依赖性显微注射培养基（CIMM）：将 DMEM 低糖改型粉末（不含酚红）溶于 200 mL 蒸馏水中，配制成 5 倍浓度溶液。使用 0.2 µm 瓶顶滤器过滤溶液（DMEM 粉末使用整瓶内容物）。为配制 100 mL CIMM，混合 20 mL 5 倍浓度 DMEM 改型溶液、1 mL HEPES 缓冲液、1 mL N2 补充剂（100 倍浓度）、2 mL B27 补充剂（50 倍浓度）、1 mL 青霉素-链霉素（100 倍浓度）、1 mL 2 mM 谷氨酰胺和 74 mL 蒸馏水。溶液于 4 °C 保存。
- 重悬缓冲液：将 262 mM NaHCO3、0.05 N NaOH 和 200 mM HEPES 溶解于蒸馏水中，配制重悬缓冲液。使用 0.22 µm 瓶顶滤器系统过滤除菌，收集至无菌玻璃瓶中。将重悬缓冲液每 500 µL 分装至密封的微量离心管中。于 4 °C 保存。
- 显微注射染料储备液：将荧光标记的葡聚糖溶于无 RNase 的蒸馏水中（终浓度为 10 µg/µL）。每 5 µL 分装，于 -20 °C 保存备用。
- 使用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.2 mm，内径 0.94 mm）中拉制显微注射移液管。避免移液管接触灰尘。移液管储存时间不得超过 2–3 天。本实验中使用的拉制参数为：HEAT（加热）：梯度温度 +1 至 +5；PULL（拉力）：100；VEL（速度）：110；DEL（延迟）：100。其中 HEAT 和 VEL 是对移液管形状和尺寸影响最大的参数。
注意：理想的显微注射移液管应具有细长且柔韧的尖端，以避免显微注射过程中对细胞造成损伤。
3. 组织切片制备
- 在脑组织解剖前，使用微波炉熔化3%宽范围琼脂糖。在包埋前，将琼脂糖置于37 °C水浴中保温，防止其凝固。确保移液器免受灰尘污染。移液器存放时间不得超过2 – 3天。
- 解冻一份SCM，并使用水浴将10 – 12 mL CIMM和20 mL Tyrode’s溶液预热至37 °C。
- 将荧光示踪剂（Dextran-3000或Alexa标记的Dextran-10000；终浓度5 – 10 μg/μL）与待注射的其他化学物质混合。将显微注射溶液在4 °C下以16,000 x g离心30分钟。收集上清液并转移至新管中。显微注射溶液使用前需置于冰上保存。
- 使用E13.5 – E16.5小鼠胚胎的头部制备端脑的器官型组织切片。用镊子沿中线剪开皮肤并打开颅骨。从打开的颅骨中取出胚胎脑组织，并从脑腹侧开始去除覆盖在脑组织表面的脑膜。将解剖得到的完整脑组织置于37 °C加热板上的Tyrode’s溶液中。
注意：3.4中描述的所有解剖步骤必须在预热的Tyrode’s溶液中进行。 - 将熔化的宽范围琼脂糖倒入一次性包埋模具中。当琼脂糖冷却至38 – 39 °C时，使用巴斯德移液器小心地将脑组织（最多4个）转移至其中。此步骤务必使用剪口吸头。
- 使用刮铲或Dumont #1镊子轻轻搅动组织周围的琼脂糖，注意不要触碰组织。在室温下静置使琼脂糖凝固。琼脂糖完全凝固后，修去组织周围多余的琼脂糖。
- 在缓冲液槽中加入PBS。将脑组织按头尾轴垂直于槽的方向摆放（以嗅球作为定位标志，代表脑的最前端）。使用振动切片机切割250 µm厚的切片。
- 在3.5 cm的培养皿中加入2 mL预热的培养基。使用塑料巴斯德移液器将10 – 15个切片转移至该培养皿中。完成后，将含有切片的培养皿放入切片培养孵育箱中。使用前，将切片维持在37 °C、湿度饱和、含40% O2 / 5% CO2 / 55% N2的环境中。
4. 显微注射
- 打开计算机、显微镜、显微镜相机、操纵器、压力装置和压力传感器。通过点击从 GitHub 下载的主文件夹中的文件“launchapp.py”来加载应用程序，并在弹出窗口中指定设备设置（安装说明见步骤 1.1）。
- 在将移液管浸入溶液之前，先施加向外的压力，以防止意外堵塞。为向移液管施加压力，请将补偿压力滑条调至 24–45%，然后点击设置值。接着，根据压力传感器显示，将机械压力阀旋钮调节至 1–2 PSI（69–138 mbar），以调节至适当的压力。
- 将脑片转移至含有 2 mL 预热 CIMM 的 3.5 cm 培养皿中。将待显微注射的脑片置于培养皿中央。将培养皿转移至预热（37 °C）的显微注射载物台上。
- 使用长尖塑料移液器将 1.4–1.6 µL 显微注射溶液（来自步骤 3.3）吸入显微注射移液管中。将显微注射移液管插入移液管固定器。
- 使用显微镜的最低放大倍数，使脑片成像清晰，并引导微移液管进入该视野（FOV），使其与脑片目标处于同一焦平面。切换显微镜输出至相机，以便在应用程序中查看视野。
- 点击界面左上角的放大倍数按钮以启动设备校准。弹出窗口将提示选择放大倍数。选择 10x 放大倍数，或选择镜头实际设定的放大倍数（例如 4x、10x、20x、40x），然后点击确定。软件默认内部物镜为 10x（最常见的物镜放大倍数）。
- 使用显微镜的微调轮重新对焦移液管尖端，并用光标点击移液管尖端。接着，按下步骤 1.1按钮，并在弹出窗口中点击确定。移液管将在 Y 方向上移动。再次点击移液管尖端，然后按下步骤 1.2按钮。最后，在移液管角度框中输入45，然后点击设置角度。
- 在自动显微注射控制面板中输入所需参数。对顶端前体细胞进行显微注射时，设置注射距离为 20–40 µm，深度为 10–15 µm。对神经元进行显微注射时，设置从基底侧起始的注射距离为 30–40 µm，深度为 10–30 µm，具体取决于靶向目标。速度始终设置为 100%。点击设置值。
注意：接近距离是指移液管在移动到下一个注射位置前从组织中退出的距离；深度是指显微注射进入组织的深度；间距是指连续注射点之间的直线距离；速度是指移液管移动的速度，单位为 µm/s。 - 点击绘制边缘按钮，在弹出窗口中沿所需轨迹拖动光标以定义注射路径。对前体干细胞进行显微注射时，靶向端脑表面的腹侧，如图 2A所示。将移液管移至轨迹起点，点击移液管尖端。点击运行轨迹以开始显微注射。对每个目标注射平面重复此步骤（通常进行 3–4 个平面，每个平面注射 40–75 次）。
5. 免疫荧光染色用组织培养与组织切片处理
- 制备胶原蛋白混合物（1.5 mg/mL）：向离心管中加入 1.25 mL 基质溶液、0.5 mL 蒸馏水、0.5 mL 5x DMEM-F12 溶液和 0.25 mL 重悬缓冲液。使用前保持在冰上。
- 从切片培养孵育室中取出含有显微注射切片的培养皿，将切片浸入胶原蛋白混合物中。
- 将切片连同 200–300 µL 胶原蛋白混合物转移至 35 mm 玻璃底培养皿的 14 mm 孔中。确保切片仅被极少量胶原蛋白覆盖。此设置可为营养物质和氧气的摄取提供最佳条件。
- 使用两对镊子调整切片方向，同时确保切片之间留有足够空间。将培养皿置于 37 °C 加热板上孵育 5 分钟，使胶原蛋白凝固。将此时间记为切片培养的 t = 0 时刻。
- 将培养皿移回切片培养孵育箱中继续孵育 40 分钟。随后加入 2 mL 预热的 SCM。切片在培养条件下保存至所需时间点。
- 从切片培养孵育箱中取出切片，吸除 SCM。用 1x PBS 清洗包埋在胶原蛋白中的切片。加入 4%（wt/vol）多聚甲醛（溶于 120 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4），室温固定 30 分钟。然后转移至 4 °C 过夜固定。
- 次日吸除多聚甲醛溶液，并用 1x PBS 洗涤。为从胶原蛋白中取出切片，使用两对镊子在体视显微镜下轻轻取出切片。
- 使用微波炉熔化 3%（wt/vol）低熔点琼脂糖，用于处理显微注射切片。将熔化的琼脂糖倒入一次性包埋模具中，冷却至约 38–39 °C。
- 使用塑料巴斯德吸管将步骤 5.7 中的组织切片转移至含有低熔点琼脂糖的模具中。确保切片的软脑膜面朝上，脑室面朝下。如有需要，适当调整方向。让琼脂糖冷却至室温凝固。
- 修去切片周围多余的琼脂糖。调整琼脂糖块方向，确保切割面与振动切片机的刀片平行。使用振动切片机切出 50 µm 厚的切片。
- 在 24 孔板中加入 1x PBS。使用细头画笔将切片转移至孔板中。按照标准实验方案进行免疫荧光染色。
结果
显微注射可用于在活体组织中追踪和操控单个神经干细胞及其子代，并在生理环境中观察其谱系发育过程。本文中，我们展示了利用显微注射机器人对小鼠端脑的器官型脑片进行靶向并自动显微注射的方法。图2展示了成功注射的前体细胞的代表性图像，图3展示了被注射的新生神经元。当使用Dextran Alexa-488（或Alexa-A555）染料进行注射时，细胞可被染料完全填充。对于顶端前体细胞（图2），共聚焦成像可高空间分辨率地重建细胞形态，判断顶端和基底连接的存在与否，并将形态学分析与标记物表达相结合。通过结合这些标准，使用者可确定被显微注射细胞及其子代的特定细胞命运。对于神经元的注射，使用者可重建神经元的形态，包括顶端树突和轴突的结构与特征。与手动显微注射相比，自动化显微注射可显著提高通量（图2B）。此外，EdU标记证实细胞活力不受自动化操作的影响（图2C）。将器官型脑片维持在体外培养中，可实现对显微注射细胞谱系发育过程的持续追踪（我们在图2D中展示了4–24小时的结果）。若显微注射溶液中含有遗传物质（DNA、mRNA、CRISPR-Cas9向导RNA）或重组蛋白，则可借此研究这些操作是否以及如何影响谱系发育进程。
在组织中对单个神经干细胞进行显微注射可实现优异的单细胞分辨率，因此已被用于解析神经干细胞进展及命运转变的细胞生物学机制（图3A）。显微注射能够递送复杂的化学物质混合物。我们此前曾利用这一特性，通过将可透过缝隙连接的荧光染料与不可透过缝隙连接的荧光染料混合，研究了神经前体细胞中的缝隙连接偶联12。在此基础上，我们进一步通过向新生神经元中注射Lucifer Yellow和Dextran-A555，拓展了相关研究（图3B）。如图3B所示，部分新生的锥体神经元通过缝隙连接与邻近神经元相偶联。该观察结果支持了未成熟神经元通过缝隙连接进行通讯的观点13,14。此外，对神经元的靶向注射表明，显微注射机器人可广泛应用于发育中哺乳动物脑内的多种细胞类型。该实验体系将有助于深入解析组织中神经元的细胞生物学特性，例如通过递送特异性寡肽来干扰蛋白质-蛋白质相互作用。
图1：自动显微注射装置与操作流程。（A）使用显微注射机器人进行组织准备和自动显微注射的整体操作流程。右上插图：本方案中靶向显微注射的小鼠端脑示意图。（B）自动显微注射步骤的流程图。（C）显微注射机器人硬件的示意图。（D）用于控制和操作显微注射机器人的图形用户界面（GUI）。该图改编自参考文献12。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：对顶端前体细胞进行机器人显微注射。 使用显微注射机器人通过顶端表面（顶面注射）靶向顶端前体细胞（APs）时的示意图与预期结果。（A）上排：左侧为操作流程示意图；右侧为顶面注射相关参数的图形用户界面（GUI）。下排：左侧为注射过程中拍摄的相差图像（V：脑室；BL：基底膜）；右侧为代表性的结果，显示被显微注射的APs。虚线表示脑室（V）。比例尺：10 µm。（B）初学者使用手动显微注射系统、经验丰富的操作者使用手动显微注射系统，以及显微注射机器人每分钟成功完成的注射次数。（C）在注射区域中，显微注射细胞与未注射细胞的EdU掺入情况。对小鼠E14.5背侧端脑的器官型脑片进行处理：（i）不注射，或（ii）使用Dextran-A488（手动和自动注射均使用）进行手动或自动显微注射（注射脑片）。脑片在含EdU的培养基中继续培养24小时，随后固定并用DAPI和EdU染色。统计注射区域内注射细胞与未注射细胞的EdU阳性率。（D）利用显微注射机器人进行谱系追踪。将一种荧光染料（Dx3-A555，品红色）注入单个神经干细胞（t = 0 h）。该荧光染料在有丝分裂过程中分配至子细胞（d1, d2），从而可追踪被注射细胞的后代（t = 4 h 和 24 h），揭示随时间推移的谱系进展。在t = 24 h时，展示了若干预期可观察到的后代示例。比例尺：10 µm。B和C中的图表引自参考文献12 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：神经元的机器人显微注射。 使用显微注射机器人通过基底面（基底注射）靶向锥体神经元（N）时的示意图及预期结果。(A) 上排：左侧为操作流程示意图；右侧为基底注射相关参数的图形用户界面（GUI）。下排：左侧为注射过程中拍摄的相差图像（V：脑室；BL：基底膜）；右侧为代表性结果，显示一个完成显微注射的神经元（N）。虚线表示基底膜（BL）。比例尺：10 µm。(B) 利用自动注射装置研究组织中缝隙连接通讯。锥体神经元被注射含有两种染料的溶液：不能通过缝隙连接的 Dx-A555（未显示）和可通过缝隙连接的荧光黄（Lucifer Yellow，绿色）。Dx-A555 仅局限于被注射的靶细胞内（星号），而 LY 则扩散至通过缝隙连接与靶细胞相连的邻近细胞（虚线所示）。左图：低曝光条件下，仅可见显微注射的细胞；右图：高曝光条件下，可同时观察到注射细胞及其耦合细胞（虚线）。比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件：解决显微注射过程中出现的几种常见错误。 请点击此处下载该文件。
讨论
对组织中的单个神经干细胞进行显微注射可实现优异的单细胞分辨率，因此该技术已被用于解析神经干细胞进展及命运转变的细胞生物学过程（图2；另见10,11,12）。自动化显微注射操作也可应用于胚胎小鼠和人类脑组织中的其他类型细胞。通过靶向端脑的基底表面实现对新生神经元的显微注射，其代表性结果如图3所示。
此处建立的原理可应用于靶向小鼠胚胎脑和人脑中的多种不同细胞类型。我们此前已证明，显微注射机器人还可用于靶向小鼠后脑和端脑中的单个前体细胞，以及小鼠和人类发育新皮层中的新生神经元12。为了获得最佳的注射效果，在开始注射前应优化所有步骤。必须仔细考虑并优化从脑组织制备活性良好且保存完好的器官型脑片的过程（图1）。在图1所示的解剖和切片过程中，操作应迅速。对于靶向放射状胶质细胞顶膜（APs）的顶膜注射，应选择顶膜表面方向理想的脑片。理想的方位是顶膜表面垂直于培养皿底部。虽然其他方向也可接受，但顶膜表面垂直于培养皿时可提供更大的注射表面积，从而提高注射成功率。而对于神经元的注射，脑片的方位影响甚小或无影响。
选定待注射的切片后，每片注射过程约需5分钟。鉴于操作对象为活体组织，建议尽量加快注射过程。为此，建议在组织准备好之前，预先通过图形用户界面（GUI）设置所有注射参数（图1D），以减少不必要的等待时间。如遇问题，请参考补充文件。
对于长期脑片培养，自动化显微注射操作后的步骤可能影响细胞的健康状态，从而影响实验结果。因此，强烈建议进行质量控制检测，并优化脑片培养条件。为了评估切片和注射操作后细胞的存活情况，我们在培养过程中进行了EdU标记，并对培养物及注射组织中的固缩核数量（凋亡细胞的替代指标）进行了定量分析12。这些定量结果未显示显微注射对组织活力产生显著影响（图2C）。我们建议在实验室建立类器官组织切片与显微注射流程时，同步开展类似的质量控制检测。
与手动显微注射相比，显微注射机器人具有多项优势。首先，用户的学习曲线更为平缓：新用户仅需经过少量操作训练（通常为1至2次）即可达到较高熟练程度。而采用手动显微注射时，达到类似熟练水平则需要数月的培训。注射过程更快速、更高效（图2B）。我们对这些参数进行了量化，发现显微注射机器人在注射成功率（成功注射数/总注射数的百分比）以及单位时间内的总注射次数方面均优于熟练的操作人员12。与熟练操作者相比，显微注射机器人的整体注射效率（每分钟成功注射的百分比）提高了300%。当与初学者操作者比较时，效率提升更为显著，可达700%。最后但同样重要的是，显微注射机器人可轻松编程以系统性地探索所有空间参数。这一特性在将显微注射机器人用于靶向新型细胞或组织，或用于需要不同空间分辨率的应用时尤为有利。
构建显微注射机器人仅需对现有的落射荧光显微镜进行少量改造12。我们此前已在 https://github.com/bsbrl/Autoinjector 提供了该改造的详细说明。硬件安装完成后，本实验方案提供了成功实施自动化显微注射的关键方法学细节。总体而言，显微注射机器人的成功注射速率为 15.52 ± 2.48 次/分钟，是新手操作者（1.09 ± 0.67 次/分钟）的 15 倍，专家操作者的 3 倍（4.95 ± 1.05 次/分钟）12。注射成功率的提升使新手和专家用户均能在更短时间内注射更多细胞，这对于维持组织活性至关重要。此外，显微注射机器人具备可定制性，用户可通过图形用户界面（GUI）调节注射轨迹、注射深度、注射次数以及注射点之间的间距。这些功能使显微注射机器人不仅可作为优化以往繁琐实验的工具，还可用于探索以往无法实现的、需要更高通量的全新实验。
我们在此描述的显微注射技术的主要局限性与组织切片的制备相关，该步骤是关键性的，需要进行大量优化。此外，显微注射依赖于存在可被玻璃移液管接近的表面。这一特性限制了当前装置下可通过显微注射靶向的组织类型及组织位置。
目前，该显微注射机器人采用明场成像，已应用于体外脑片制备。未来，该显微注射机器人可与双光子成像结合，以提高单细胞靶向的特异性 体内 用于分子或染料标记。此类工作在单细胞电生理学中已有开展15,16目前的设备需要人工观察显微注射过程。未来的版本可包含用于清理堵塞显微注射移液管的策略。17 或流体处理机器人的整合18 用于多重、完全自主的显微注射。这些设备可使显微注射的通量提升数个数量级。通过改进算法实现对多个显微注射移液管的并行控制19 可实现数十种染料和分子试剂在同一实验中对相同细胞的多重递送，有望为组织中的分子筛选开辟新途径。
微注射机器人可用于利用DNA或RNA条形码对功能已知的细胞进行标记。该技术可进一步与其他单细胞分析技术相结合，例如单细胞RNA测序（scRNAseq）和电子显微镜分析。我们的初步结果显示，通过组织解离后进行FACS分选，可回收并分离微注射标记的细胞及其子代细胞（Taverna，未发表结果）。分选后的细胞可用于单细胞RNA测序。此外，初步结果还表明，微注射机器人具备的单细胞分辨率能力可与电子显微镜分析相结合，用于在高空间分辨率下研究组织中神经干细胞的细胞生物学特性（Taverna和Wilsch-Bräuninger，未发表结果）。这些数据表明，微注射机器人可作为组织中关联光学显微镜与电子显微镜研究的工具，更广泛地应用于组织内细胞身份与行为的多模态分析。
显微注射依赖于压力的作用，能够注射具有高分子复杂性的溶液（例如完整的转录组）。过去，显微注射的这一特性已被用于配体门控受体的分离与克隆20。基于这一思路，显微注射机器人或许可用于在细胞水平上建模和研究多基因性状。结合亚文库 pooling 策略，显微注射机器人还可用作鉴定驱动特定性状或细胞行为的最小基因集合的平台。迄今为止，显微注射机器人已被用于通过递送 mRNA、DNA 或重组蛋白来操控细胞的生物化学过程10,21,22。我们预计显微注射机器人还可用于探测细胞内空间的生物物理特性，例如通过递送能够感知和/或操控细胞内空间生物物理特性的纳米材料或纳米机器。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢诺米斯基金会（ET）。SBK 感谢明尼苏达大学科学与工程学院机械工程系、MnDRIVE RSAM 计划、明尼苏达州高等教育部门以及美国国立卫生研究院（NIH）提供的资助，项目编号分别为 1R21NS103098-01、1R01NS111028、1R34NS111654、1R21NS112886 和 1R21NS111196。GS 获得美国国家科学基金会研究生研究奖学金以及 NSF IGERT 培训项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学品 | |||
| 低熔点琼脂糖 | Carl Roth | 货号 6351.2 | |
| 琼脂糖，野生型范围 | Sigma-Aldrich | 货号 A2790 | |
| Best-CA 221 胶水 | Best Klebstoffe GmbH & Co.KG | 货号 CA221-10ml | |
| B-27 补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 货号 17504044 | |
| Cellmatrix I型A（胶原蛋白，I型！） | FUJIFILM Wako Chemicals | 货号# 637-00653 | |
| 去离子水 | |||
| DMEM-F12，无CO2依赖（不含酚红） | Sigma-Aldrich | 货号 D2906 | |
| DMEM-F12，无CO2依赖（含酚红） | Sigma-Aldrich | 货号 D8900 | |
| HEPES-NaOH，pH 7.2，1 M（HEPES缓冲液） | Carl Roth | 货号 9105.3 | |
| L-谷氨酰胺，200 mM | Thermo Fisher Scientific | 货号 25030024 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 货号# 81381 | |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 货号 17502048 | |
| Neurobasal 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 货号# 21103049 | |
| 无核酸酶水 | Thermo Fisher Scientific | 货号 AM9937 | |
| O2（40%）、CO2（5%）、N2（55%）混合气，50 升 | |||
| 多聚甲醛 | 默克 | 货号 818715 | |
| PBS | |||
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 货号 15140122 | |
| 大鼠血清 | Charles River Laboratories | ||
| 日本 | |||
| 碳酸氢钠（NaHCO₃） | 默克 | 货号# 106323 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | 默克 | 货号 106482 | |
| 泰罗德液’盐 | Sigma | 货号 T2145-10x1L | |
| 设备 | |||
| 硼硅酸盐玻璃毛细管，1.2 mm 外径 × 0.94 mm 内径 | Sutter Instruments | 货号 BF-120-94-10 | |
| 瓶顶过滤系统，500 mL | 康宁 | 货号 430769 | |
| 计算机 PC | |||
| 定制压力装置 | 定制压力装置 | ||
| 电子压力调节器 | Parker Hannifin | 货号# 990-005101-002 | |
| Falcon管，15 mL | 康宁 | 货号# 430791 | |
| Falcon管，50 mL | 康宁 | 货号# 430829 | |
| 细尖画笔 | |||
| Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | 货号 P-97 | |
| Dumont 3号镊子 | Fine Science Tools | 货号 11231-30 | |
| Dumont 5号镊子 | 精细科学工具 | 货号 11255-20 | |
| 镊子，Dumont 55号 | Fine Science Tools | 货号 11252-20 | |
| 加热块 | Labtech International | 货号 Dri block Digi2 | |
| 倒置荧光显微镜 | 蔡司 | 货号 Axiovert 200 | |
| 光源 | 奥林巴斯 | 货号# Highlight 3100 | |
| 手动压力调节器 | McMaster Carr | 货号# 0-60 PSI 41795K3 | |
| Microloader吸头 | Eppendorf | 货号# 5242956.003 | |
| 微控制器 | Arduino | 货号# Arduino Due | |
| 显微镜相机 Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3 | |||
| 显微镜用电动XY载物台 | |||
| 24孔多孔板 | Nunc | 货号 142475 | |
| 巴斯德移液管，塑料 | |||
| 培养皿，60 × 15 mm | Greiner | 货号 628102 | |
| 培养皿，35 × 10 毫米 | Nunc | 货号 153066 | |
| 培养皿，34 × 14 mm，含 Microwell 1.5号盖玻片 | MatTek | 货号 P35G-1.5-14-C | |
| 移液管固定器 | Warner Instruments | 货号# 64-2354 MP-s12u | |
| 移液管和吸头 | |||
| 拉丝细丝，3.0毫米方形盒装细丝 | Sutter Instrument | 货号 FB330B | |
| 脑片培养孵育盒 | MPI-CBG | 货号# 定制制作 | |
| 电磁阀 | 货号 LHDA053321H-A | ||
| 体视显微镜 | 奥林巴斯 | 货号 SZX12 | |
| 台式离心机 | 贺利氏 | 货号# 5431622 | |
| 温度计 | |||
| 三轴操纵器 | Sensapex Inc | 货号# 树轴 uMP | |
| 振动切片机 | Leica | 货号 VT1000s | |
| 全胚胎培养系统培养箱 | Ikemoto 公司 | 货号 RKI-10-0310 | |
| 水浴 | |||
| 软件与算法 | |||
| Arduino | Arduino | ||
| Fiji | RRID: SCR_002285 | ||
| Python | Python 软件基金会 | Python 2.7.12 | |
| ZEN | RRID: SCR_013672 |
参考文献
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