本文介绍了一种利用荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）技术，在活体Pseudomonas aeruginosa中表征两种表达水平差异极大的蛋白质之间相互作用的实验方案。该方案包括细菌菌株构建、细菌固定、成像以及成像后数据分析流程。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）调控细胞内的多种关键过程。荧光寿命成像显微技术（FLIM）结合 Förster 偿能共振转移（FRET）可提供关于活细胞中蛋白质相互作用的精确信息。FLIM-FRET 技术依赖于测量 FLIM 图像每个像素点上 FRET 供体的荧光寿命衰减，从而定量且准确地揭示蛋白质相互作用及其在细胞内的空间组织特征。本文提出了一种详细的 FLIM-FRET 测量实验方案，我们已将其应用于监测活体Pseudomonas aeruginosa中的蛋白质相互作用，特别针对两种表达拷贝数差异显著的相互作用蛋白，以展示该技术在揭示蛋白质相互作用关键特征方面的高质量与稳健性。本方案详细描述了表征蛋白质相互作用所需的全部步骤——从细菌突变株的构建，到利用最新开发的分析工具对复杂 FLIM-FRET 数据进行直观可视化和最终分析的全过程。
引言
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）调控细胞内的多种关键过程1。PPI的功能取决于蛋白质的组成、亲和力、功能以及在细胞内的定位2。可通过多种技术手段研究PPI3。例如，共免疫沉淀是一种相对简单、稳健且经济的方法，常用于鉴定或验证PPI。然而，当相互作用的蛋白质表达水平较低，或其相互作用是瞬时的，或仅在特定环境中发生时，研究PPI可能具有挑战性。研究铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）中绿脓菌素合成通路不同酶之间的PPI，需要解除铁依赖性全局阻遏蛋白Fur的抑制作用，以使绿脓菌素通路的所有蛋白质在细胞内得以表达4,5,6。该通路中所有蛋白的共同调控机制可实现其在细胞内适时表达，从而促进它们之间的相互作用。由于该代谢通路中的蛋白质在大小、性质、表达水平及数量上具有高度多样性，因此在重建系统中对其进行研究较为困难6。因此，在细胞环境中研究PPI对于深入理解蛋白质在其天然背景下的生物学功能至关重要。
仅有少数方法（包括荧光技术）可用于在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）
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方案
1. 质粒构建
- 通过两次PCR（PCR1和PCR3）扩增DNA序列（使用基因组DNA） P. aeruginosa PAO1）中对应插入位点上下游700个碱基对的区域 P. aeruginosa 使用高保真DNA聚合酶对基因组进行扩增。在蓝色和绿色引物中添加限制性酶切位点，在红色引物中添加与mCherry重叠的序列（图2).
- 对于C末端用eGFP标记的PvdA，使用蓝色引物扩增终止密码子上游的700 bp区域，使用绿色引物扩增包含终止密码子的下游700 bp区域。
- 对于N端标记mCherry的PvdL，使用蓝色引物扩增PvdL基因上游700 bp区域（包含起始密码子），并使用绿色引物扩增下游700 bp区域。
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结果
不同细菌菌株的荧光寿命测得值的经验累积分布函数（ecdf）如图所示 图8如果发生FRET，ecdfs将向较短的寿命方向移动（图8A,8B）。需要注意的是，当两种蛋白质相互作用导致两个荧光基团之间距离较远时，不会发生FRET（荧光共振能量转移）图8C）。在荧光寿命成像（FLIM）中，这种情况无法与两个分子之间完全无相互作用的情形相区分。因此，当无法根据分子模型或已知的复合物结构预测染料间距离时，重要的是考虑在蛋白质的不同位点进行标记，以最大化检测相互作用的可能性。同样，由于PvdA（高表达）与非核糖体肽合成酶PvdL（每细胞仅少数拷贝）之间的蛋白表达量存在显著差异，相同的PvdA/PvdL复合物不会产生相似的FLIM-FRET数据。事实上，不平衡的化学计量比会使FLIM-FRET数据的解释变得复杂。具体而言，取决于哪种蛋白被供体染料标记，化学计量比的不平衡会导致在记录的荧光寿命分布中，游离的与结合的供体标记蛋白所占比例出现差异。.......
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讨论
与基于荧光强度的FRET成像相比，FLIM-FRET具有一些关键优势。荧光寿命是荧光团的内在参数，因此既不依赖于荧光团的局部浓度，也不依赖于激发光的强度。此外，荧光寿命受光漂白的影响也较小。在细胞内蛋白质浓度在亚细胞区室或区域间高度异质的情况下，FLIM-FRET特别适用于检测蛋白质相互作用（PPIs）。当蛋白复合物浓度较低，或两种蛋白中至少一种蛋白的表达水平较低时，FLIM-FRET在所有此类情况下均具有应用价值。
在蛋白质相互作用（PPIs）的背景下，仅通过平均寿命来推断导致寿命缩短的FRET机制以及相互作用性质的信息是困难的。事实上，平均寿命的缩短可能是由于大量以中等FRET效率发生相互作用的组分所致，也可能是相反的情况，即仅有少量供体与受体在很短的距离内发生相互作用。当形成化学计量比不平衡的复合物时，情况变得更加复杂。能够同时展示多个维度信息的图形可视化工具（例如在图示中展示tau1、alpha和<tau>）有助于提供有关所形成复合物性质的关键信息。此外，在此背景下，其他数据可视化方式也具有重要意义，例如基于相量分析的方法.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Ludovic Richert 博士在荧光寿命成像（FLIM）数据采集方面的宝贵帮助，以及对 FLIM 系统的技术维护与开发工作。本研究由法国化学研究基金会（https://icfrc.fr/）的资助项目提供经费支持。VN 由法国医学研究基金会（FRM‐SPF201809006906）资助。YM 感谢法国大学研究院（IUF）提供的支持及其为科研工作所额外给予的时间。IJS 和 JG 感谢斯特拉斯堡药物递送研究所提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 525/50 nm 带通滤光片 | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm 短通滤光片 | F75-680, AHF, Germany | ||
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 硫酸铵 (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA 聚合酶 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| 光纤耦合雪崩光电二极管 | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| 玻璃盖玻片（1.5号厚度，20×20 mm） | Knitel glass | MS0011 | |
| 高保真DNA聚合酶Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| LB培养基（Lysogeny broth） | Millipore | 1.10285 | |
| 七水合硫酸镁 (MgSO4 · 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| 显微镜载玻片（25×75 mm） | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin 凝胶和PCR产物纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin 质粒提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| 磷酸氢二钾 (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| 磷酸二氢钾 (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 琥珀酸钠（二钠盐） | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage，SPCM软件 | Becker & Hickl | ||
| 无菌接种环 | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA连接酶 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC模块 | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire激光器 | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| 50 mL离心管 | Falcon | 352070 |
参考文献
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of....
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重印与许可
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