本文介绍了一种利用荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）技术，在活体Pseudomonas aeruginosa中表征两种表达水平差异极大的蛋白质之间相互作用的实验方案。该方案包括细菌菌株构建、细菌固定、成像以及成像后数据分析流程。
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摘要
摘要
蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）调控细胞内的多种关键过程。荧光寿命成像显微技术（FLIM）结合 Förster 偿能共振转移（FRET）可提供关于活细胞中蛋白质相互作用的精确信息。FLIM-FRET 技术依赖于测量 FLIM 图像每个像素点上 FRET 供体的荧光寿命衰减，从而定量且准确地揭示蛋白质相互作用及其在细胞内的空间组织特征。本文提出了一种详细的 FLIM-FRET 测量实验方案，我们已将其应用于监测活体Pseudomonas aeruginosa中的蛋白质相互作用，特别针对两种表达拷贝数差异显著的相互作用蛋白，以展示该技术在揭示蛋白质相互作用关键特征方面的高质量与稳健性。本方案详细描述了表征蛋白质相互作用所需的全部步骤——从细菌突变株的构建，到利用最新开发的分析工具对复杂 FLIM-FRET 数据进行直观可视化和最终分析的全过程。
引言
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）调控细胞内的多种关键过程1。PPI的功能取决于蛋白质的组成、亲和力、功能以及在细胞内的定位2。可通过多种技术手段研究PPI3。例如，共免疫沉淀是一种相对简单、稳健且经济的方法，常用于鉴定或验证PPI。然而，当相互作用的蛋白质表达水平较低，或其相互作用是瞬时的，或仅在特定环境中发生时，研究PPI可能具有挑战性。研究铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）中绿脓菌素合成通路不同酶之间的PPI，需要解除铁依赖性全局阻遏蛋白Fur的抑制作用，以使绿脓菌素通路的所有蛋白质在细胞内得以表达4,5,6。该通路中所有蛋白的共同调控机制可实现其在细胞内适时表达，从而促进它们之间的相互作用。由于该代谢通路中的蛋白质在大小、性质、表达水平及数量上具有高度多样性，因此在重建系统中对其进行研究较为困难6。因此，在细胞环境中研究PPI对于深入理解蛋白质在其天然背景下的生物学功能至关重要。
仅有少数方法（包括荧光技术）可用于在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）7。在可测量的不同荧光参数中，荧光寿命（即荧光分子在发射光子前处于激发态的平均时间）可能是用于在活细胞中进行研究的最有意义的参数之一。荧光分子的荧光寿命对其所处环境高度敏感，因此荧光寿命成像显微技术（FLIM）可提供有关荧光分子周围环境的化学或物理信息8。这包括 Förster 共振能量转移（FRET）现象，当一个荧光“受体”位于荧光“供体”附近时即可发生能量转移。能量转移会导致供体荧光寿命显著缩短（图 1A），使得荧光寿命成像显微技术（FLIM）成为在活细胞中直接研究蛋白质-蛋白质相互作用的有力手段。此外，FLIM 还可提供有关相互作用在细胞内发生位置的空间信息7,8。该方法在两种相互作用蛋白均可被荧光标记的情况下，对研究蛋白质-蛋白质相互作用具有极强的应用价值。
要发生FRET，两个荧光团之间的距离必须满足关键条件8,9。两个荧光团之间的距离不得超过10 nm。因此，在设计FLIM-FRET实验时必须谨慎，以确保荧光供体和受体在相互作用的复合物中有机会彼此靠近。尽管这看似具有限制性，但实际上这是一个显著优势，因为FRET的距离依赖性可确保发生FRET的两个标记蛋白必须发生直接的物理相互作用（图1A）。因此，与共定位实验中难以明确判断蛋白质相互作用（两个共定位的蛋白质未必发生相互作用）不同，FLIM-FRET不存在此类问题。
图1：FLIM-FRET分析原理。FLIM-FRET多维图像的每个像素都包含在此特定位置记录的荧光衰减信息（#counts = 通道t中检测到的光子数）。(A) FLIM图像的经典表示通常为伪彩色编码的二维寿命图像（左图）。当发生FRET时，可观察到供体平均荧光寿命降低——表现为颜色标尺的变化——这提示该空间区域内存在蛋白质相互作用（PPIs）。(B) FRET的发生需要供体发射光谱与受体吸收光谱之间存在重叠。请点击此处查看该图的放大版本。
FRET 的第二个要求是，供体的发射光谱与受体的吸收光谱应存在重叠8（图1B）。供体的荧光激发波长应选择在对受体产生直接荧光激发贡献极小的范围内。并非所有荧光团组合都适用，我们还建议优先选用具有单指数荧光衰减特性的供体，以利于对 FLIM-FRET 结果进行解释10。已有多种荧光蛋白组合满足这些条件，其中包括常用的 eGFP-mCherry 组合11（有关可用荧光蛋白 FRET 配对的综述，参见12,13）。
荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）技术能够在FLIM图像的每个像素点上测量FRET供体的荧光寿命衰减（图1A）。目前有两种主要技术用于测定荧光寿命，它们在数据采集和分析方法上有所不同：频域法（FD）14和时域法（TD）。时域FLIM应用更为广泛，通常采用脉冲光源照射，并结合多种可能的检测配置，包括门控方法15、条纹相机16或时间相关单光子计数（TCSPC）技术8。无论是频域还是时域技术，荧光寿命并非直接测量获得，而是需要对所测数据进行分析，以估算寿命值或判断分子间相互作用的存在。对于TCSPC技术，最常用的分析方法是通过最小二乘迭代反卷积法，将衰减曲线拟合为单指数或多指数函数，从而最小化残差的加权和。
最后，荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）既可采用单光子激发，也可采用多光子激发。多光子激发具有多种优势，例如可减少焦平面外的自发荧光和光损伤。当处理较厚的三维样品时，多光子激发还能够实现更长的激发深度8。相比之下，单光子激发通常效率更高，因为荧光蛋白的双光子吸收截面有限17。
本文提出了一种在活体P. aeruginosa中进行FLIM-FRET检测蛋白质相互作用（PPIs）的实验方案，特别针对表达拷贝数差异显著的两种相互作用蛋白（PvdA与PvdL），以展示该技术在揭示PPI关键特征方面的高质量与稳健性。PvdA和PvdL蛋白参与绿脓菌素（pyoverdine）的生物合成过程。PvdA是一种L-鸟氨酸N5-加氧酶，通过羟基化（PvdA）和甲酰化（PvdF）反应将L-鸟氨酸转化为L-N5-甲酰-N5-羟基鸟氨酸18。PvdL是一种非核糖体肽合成酶（NRPS），由四个模块组成：第一模块催化肉豆蔻酸的酰化反应；第二模块催化L-谷氨酸的活化及其与肉豆蔻酰辅酶A的缩合；第三模块缩合一个L-酪氨酸残基，并将其异构化为D-酪氨酸；最后，第四模块结合一个L-Dab（二氨基丁酸）氨基酸，形成酰化的三肽L-Glu/D-Tyr/L-Dab6。因此，PvdL负责绿脓菌素前体中前三个氨基酸的合成。PvdA蛋白与PvdL之间的相互作用令人意外，因为与PvdI和PvdJ不同，PvdL并不含有专门识别L-N5-甲酰-N5-羟基鸟氨酸的模块。这一相互作用提示，所有参与绿脓菌素前体生物合成的酶可能组装成大型、短暂且动态的多酶复合物19,20。
本报告详细介绍了如何构建表达天然状态下的两种相互作用蛋白（分别标记为 eGFP 和 mCherry）的细菌菌株。我们还描述了样品制备方法以及高效进行 FLIM-FRET 细胞成像的实验条件。最后，我们提供了一步一步的图像分析教程，包括一种新近开发的工具，该工具可实现高级可视化，便于直观解读复杂的 FLIM-FRET 数据。通过本报告，我们希望不仅能够说服富有探索精神的研究者，更希望让大多数生物学家相信，FRET-FLIM 是一种可及且强大的技术，能够在天然细胞环境中直接回答有关蛋白质相互作用（PPIs）的问题。
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方案
1. 质粒构建
- 通过两次PCR（PCR1和PCR3）扩增DNA序列（使用基因组DNA） P. aeruginosa PAO1）中对应插入位点上下游700个碱基对的区域 P. aeruginosa 使用高保真DNA聚合酶对基因组进行扩增。在蓝色和绿色引物中添加限制性酶切位点，在红色引物中添加与mCherry重叠的序列（图2).
- 对于C末端用eGFP标记的PvdA，使用蓝色引物扩增终止密码子上游的700 bp区域，使用绿色引物扩增包含终止密码子的下游700 bp区域。
- 对于N端标记mCherry的PvdL，使用蓝色引物扩增PvdL基因上游700 bp区域（包含起始密码子），并使用绿色引物扩增下游700 bp区域。
图 2：用于构建 PvdA-mCherry 的 PCR 策略及质粒构建流程概览。详见正文——pvdA 编码一种参与铁载体绿脓菌素（pyoverdine）生物合成的酶，绿脓菌素是一种参与铁获取的次级代谢产物。请点击此处查看该图的放大版本。
- 使用红色引物和高保真DNA聚合酶扩增编码eGFP的DNA（不含起始密码子和终止密码子）。
- 通过PCR纯化柱对PCR产物进行纯化（材料表）。
- 将重叠的PCR产物按等摩尔比例混合，并使用在PCR 1和PCR 3中所用的限制性酶切位点对应的引物（图2中的绿色和蓝色引物）进行第二次PCR扩增。
- 将PCR产物在1×TAE（Tris-乙酸盐-EDTA，pH 8.0）琼脂糖凝胶中电泳，切下对应条带，并使用PCR纯化试剂盒提取扩增片段（Table of Materials）。
注意：此步骤可暂停。 - 使用相应的限制性内切酶对PCR扩增产物和pEXG2质粒进行双酶切21。
- 使用T4 DNA连接酶将质粒与插入片段连接，质粒用量为90 ng，摩尔比为1:1（质粒:插入片段）。
- 将连接产物与100 µL TOP10感受态细胞混合，转化至化学感受态的E. coli TOP10细胞中。将感受态细菌与质粒混合物置于冰上孵育30分钟，随后在42 °C下热激60秒，再将离心管放回冰上孵育10分钟。
- 向菌液中加入1 mL LB培养基（Lysogeny Broth），在37 °C下孵育1小时。
- 取100 µL菌液涂布于含有15 µg/mL庆大霉素的LB琼脂平板上。
- 在37 °C下过夜培养。
- 通过菌落PCR筛选插入片段的存在：从一个独立的转化子菌落中挑取少量细菌，加入PCR反应体系中，所用引物可与质粒上的序列特异性结合，使得扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中可检测到目标条带（使用DNA聚合酶）。同时，从用于PCR的同一菌落中转移少量细菌至含15 µg/mL庆大霉素的新鲜平板上，用于后续分离及质粒提取。最后，提取并纯化质粒（Table of Materials），并通过测序验证插入片段的正确性。
- 将含有质粒的TOP10菌株加入含20%甘油的LB培养基中，分装至1.5 mL离心管，于-80 °C保存；将纯化的质粒置于1.5 mL离心管中，在-20 °C保存。
注意：此步骤可暂停。
2. 将荧光标签插入铜绿假单胞菌的染色体基因组（图3）
- 培养 P. aeruginosa，TOP10 和 E. coli 辅助细菌，每种接种于5 mL无抗生素的LB培养基中 30 °C 在轨道摇床上振荡过夜22在基因组中生成荧光标签插入 P. aeruginosa 通过将质粒从大肠杆菌TOP10转移至铜绿假单胞菌PAO1菌株，并通过同源重组将质粒整合到基因组中。随后发生第二次交换事件，切除载体，从而获得相应的突变株。
- 在 600 nm 处测量光密度（OD）600 nm细菌培养物，并加入等量的 P. aeruginosa (500 µL，OD600 nm = 1.0）与 E. coli TOP10 pEXG2（500 µL，OD600 nm = 1.0）和 E. coli HB101 pRK600 辅助菌株（500 µL，OD600 nm 在1.5 mL离心管中，加入1.0）
- 离心5分钟，9,300 x g 离心收集细菌。
注意：可使用在线工具将离心力（g 力）转换为每分钟转数（rpm），以调整离心机转速。 - 保留细菌沉淀，弃去上清液。
- 将含有细菌的沉淀重悬于 50 µL LB 的
- 接种一个斑点（~50 µL) 将混合物置于预热的LB琼脂平板中央 37 °C）并在 5 h 内孵育 37 °C.
- 用无菌接种环刮取菌斑，并重悬于1 mL LB培养基中。
- 培养皿 100 µL 含LB琼脂的该细菌悬液 10 µg/mL 氯霉素以消除 E. coli (E. coli TOP10 pEXG2 和 E. coli HB101 pRK600 辅助菌对氯霉素敏感，但 P. aeruginosa 具有天然抗性）以及 30 µg/mL 庆大霉素，37°C 培养 2 天 37 °C.
- 重悬一个菌落于 1 mL LB 培养基中，于37°C振荡培养过夜 37 °C 在轨道振荡器上振荡4小时。
- 离心 3 分钟，9,300 x g 并弃去 950 µL 上清液。将沉淀重悬于 50 µL 在不含 NaCl 的 LB 琼脂中加入蔗糖，用于 LB 培养基的混合物分离。
- 4°C 过夜孵育 30 °C.
- 在LB琼脂平板和含有15 mg/mL庆大霉素的LB琼脂平板上划线分离单菌落，以检测庆大霉素敏感性。
- 通过PCR菌落（DNA聚合酶）和特异性引物测序验证eGFP或mCherry的插入。
图 3：P. aeruginosa 菌株通过荧光标记插入构建的实验方案。 详见正文。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 花青素测量
- 在30 °C、振荡条件下，于5 mL LB培养基中过夜培养细菌。
- 通过离心收集细菌，洗涤后将其重悬于5 mL SM培养基（琥珀酸盐培养基，成分：6 g∙L−1 K2HPO4、3 g∙L−1 KH2PO4、1 g∙L−1 (NH4)2SO4、0.2 g∙L−1 MgSO4·7H2O 和 4 g∙L−1 琥珀酸钠，用NaOH调节pH至7.0）中，在30 °C、振荡条件下过夜培养。SM为缺铁培养基——铁的缺乏将激活绿脓菌素合成通路相关蛋白的表达，这些蛋白在铁存在时通常受到抑制。
- 测定OD600 nm，并将细菌用新鲜SM培养基稀释至OD600 nm = 0.1，随后在30 °C、振荡条件下过夜培养。
- 测定OD600 nm以确定各样品中细菌的数量。
- 准备一个石英比色皿，加入100 µL P. aeruginosa 菌液，并用SM培养基补足至1 mL（即加入900 µL SM）。另准备一个含1 mL SM培养基的石英比色皿作为空白对照。
- 使用紫外-可见分光光度计，在吸收峰最大值处测定吸光度。在pH 7.0时，绿脓菌素的吸收峰最大值出现在约400 nm处。根据Beer-Lambert定律，利用400 nm处摩尔消光系数ε = 19 000 M-1∙cm-1计算样品中绿脓菌素（脱铁形式）的浓度。
注意：绿脓菌素可在吸光度约0.1至约1的范围内进行定量（具体范围取决于紫外-可见分光光度计），在此范围内吸光度与浓度呈线性关系。
4. 表达 PvdA、PvdL 和 PvdJ 的细菌培养及培养条件
- 第1天，从相应细菌的甘油菌种中接种5 mL LB培养基，在30 °C、200 rpm条件下于摇床培养箱中过夜培养细菌。
- 第2天，以3,000 × g 离心3分钟收集菌体，弃去上清液。
- 用10 mL SM培养基重悬菌体。
- 重复步骤4.2–4.3一次，并在30 °C、200 rpm条件下于SM培养基中过夜培养细菌。
- 第3天，将细菌培养物用新鲜SM培养基稀释1/10。
- 在相同条件下再次过夜培养稀释后的细菌。
注意：绿脓菌素的存在可通过视觉检测，因其会使培养基呈现黄绿色。这表明绿脓菌素合成通路相关蛋白已被激活，且目标酶正在细胞中表达。
5. 琼脂糖垫的制备（图4）
- 将显微镜载玻片放置在平坦的水平表面上。在初始载玻片的两侧各放置一个顶部贴有两层胶带的载玻片。
注意：保持三个对齐的载玻片之间1-2 mm的间隙，以防止熔化的琼脂糖扩散到带有胶带的载玻片上。 - 用移液器吸取并滴加70 µL的1%熔融琼脂糖至载玻片上。在顶部覆盖第四张载玻片以压平琼脂糖液滴，并轻轻按压。等待约一分钟。
- 取下上方的载玻片，用移液器将约3 µL的细菌溶液滴加到琼脂糖垫上不同位置的3至4个点。
- 用显微镜盖玻片（例如22×22 mm、#1.5厚度）覆盖样品。
注意：在进行双光子激发实验时，盖玻片的平整度和厚度至关重要。通常选择具有受控均匀平整度和低自发荧光的精密盖玻片为佳。 - 用熔化的石蜡固定盖玻片，将其密封在载玻片上。首先固定盖玻片的四个角。
图4：琼脂糖垫制备。 请点击此处查看此图的放大版本。
6. 使用双光子显微镜系统进行成像
注意：我们使用一台自制的双光子激发扫描倒置显微镜，配备60倍、1.2数值孔径（NA）的水浸物镜，工作于去扫描荧光收集模式。双光子激发波长设定为930 nm，由一台钛宝石激光器提供（重复频率80 MHz，脉冲宽度约70 fs），工作功率为10–20 mW。荧光光子依次通过680 nm短通滤光片和525/50 nm带通滤光片后，导入与时间相关单光子计数（TCSPC）模块相连的光纤耦合雪崩光电二极管进行检测。该显微镜还配备透射荧光光源。目前已有多种FLIM-FRET显微镜实现商业化，许多成像平台均配备了可进行FLIM-FRET测量的系统。
- 使用荧光灯将物镜聚焦在样品中的细菌单层上，并选择感兴趣的区域。
- 检查激发激光快门是否已关闭，并确认来自激光的红外光已被阻挡，不得进入显微镜。
警告：操作脉冲红外激光器时需格外小心并保持持续警惕，因为激光光束肉眼不可见，但任何直接暴露或瞬时反射光都可能造成严重伤害，并导致不可逆的眼部损伤。在使用显微成像系统前，请务必参考当地激光安全规程并接受相关培训。 - 将显微镜载玻片放置在载物台上，确保盖玻片朝向物镜。
- 检查荧光灯是否已开启。
- 旋转滤光片转轮，选择eGFP滤光片组，并打开荧光灯快门。
- 将荧光光路导向显微镜的目镜。
警告：确保光路中已正确放置滤光片，以滤除来自荧光灯的直接激发光，防止对眼睛造成损伤。 - 使用显微镜调焦旋钮将物镜聚焦在细菌上。
- 通过操纵控制电动载物台的操纵杆移动样品，选择感兴趣的区域。
注：对于荧光较强的样品，可直接通过目镜观察荧光信号，使聚焦更为容易。 - 切换至用于FLIM-FRET测量的双光子激发（2PE）激光器激发模式。
- 将荧光发射光路重新导向探测器。
- 将滤光片转轮回转，选择适用于930 nm激光的二向色镜滤光片组。
- 将激光功率设置为20 mW。
- 将感兴趣区域的尺寸设置为30 µm。此操作会调节驱动检流计镜的电压，从而定义其运动范围（图5）。
- 开启探测器并开始扫描样品——控制扫描的启动和停止按钮同时控制激光快门的开启与关闭，以确保操作安全并减少样品的光漂白（图5）。
图5：显微镜控制软件界面的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 如有必要，可轻微调节显微镜的细准焦螺旋以调整焦距。
- 通过计算机界面微调载物台位置来选择成像视野。此操作可在设置过程中通过移动显微镜控制软件图像中的十字标记来完成。图5) 以定义图像的新中心，并按下 移动载物台一个理想的采集视野应包含10–30个静止的细菌，且所有细菌均清晰聚焦（即所有细菌处于同一焦平面）。若需提取单个细胞的荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）数据，应确保细菌充分分离（有利于显著简化图像分割过程）。
- 打开SPCM软件（用于数据采集的商业软件），检查光子计数率是否过高，以避免可能影响荧光寿命测量的堆积效应。如有必要，降低激光强度，使光子计数率保持在较低水平（约为激光重复频率的1%）。
注意：堆积效应（Pile-Up effect）描述了在高光子计数率下，由于时间相关单光子计数（TCSPC）设备的死时间导致光子丢失所产生的影响。若发生堆积效应，测得的平均寿命会人为变短，并可能在衰减曲线中出现额外的短寿命组分，这是由于对快速发射的光子过度采样所致。 - 调整采集参数，包括采集时间（通常需要60秒至180秒以收集足够的光子）。
- 按压 开始 按钮并等待采集完成。
- 保存数据。
- 停止扫描样品并关闭检测器。
- 在样品中选择另一个视野，重复步骤6.14–6.22，或通过重复步骤6.1–6.22对新的显微镜载玻片进行成像。
注意： P. aeruginosa 可在琼脂糖垫上于室温下存活并分裂长达6-8小时（相当于至少约4个倍增时间） 20°C）。理想情况下，不要等待过长时间再进行FLIM-FRET测量，以避免观察到细菌完全覆盖的区域。
7. 数据分析
图6：SPCImage软件数据分析窗口的主面板。强度图像（蓝色框）、寿命图像（紫色框）、寿命直方图（右上角）、选定位置的衰减曲线（绿色框）以及选定位置的衰减参数（青色框），这些数据来自使用自制双光子激发-荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）系统结合bh SPC830采集卡在活体P. aeruginosa中记录的代表性PvdA-eGFP衰减。在上方图像中标记像素点的实验衰减曲线、其单指数拟合结果（红色曲线），以及从计算得到的仪器响应函数（绿色曲线）中解卷积出的衰减过程，均可在绿色面板中观察到。请点击此处查看该图的放大版本。
- 基本分析
- 运行 SPCImage 软件。
- 导入已保存的 SPCM 文件。强度图像将显示在软件的左上方面板中（图6 蓝色框）。
- 检查衰减曲线窗口（图6 绿色框），该窗口显示与强度图像中选定像素对应的衰减数据（图6 蓝色框）。每个时间通道的光子数以蓝色点表示，衰减拟合结果以红色线表示。注意，在加载数据后，软件会默认显示图像中最亮的像素。移动蓝色十字线在图像上移动，以检查强度较低的像素。每当十字线移动到新的像素位置时，衰减窗口将自动刷新。
注意：测量激光扫描系统的仪器响应函数（IRF）非常困难。可以通过 FLIM 数据中荧光衰减曲线的上升沿计算 IRF，并用于衰减去卷积。这是 SPCImage 中默认采用的方法（图6 绿色曲线）。 - 通过移动拟合框的起始和终止通道（绿色框中的 T1 和 T2）来调整拟合范围。T1 应从衰减上升沿的前几个通道开始，T2 定义衰减末尾的最后一个通道，可选择为衰减末尾光子数高于光子计数偏移量的通道之一（即衰减上升前的背景光子计数水平）。
- 通过更改 Bin 值来选择 binning。该曲线衰减将所选像素的光子计数与其周围由 bin 参数定义的 i 像素区域内的计数进行积分（增加 binning 可提高衰减曲线中的光子数，有助于满足多指数模型所需的光子计数要求）。
- 调整 Threshold 值。任何通道中光子数均未超过阈值的像素将不会被纳入拟合过程。显然，参与拟合的像素数量越多，分析所需时间越长。
注意：FLIM 数据可能包含大量像素和时间通道。软件的最新版本支持使用 GPU（图形处理器）并行处理大量像素，从而显著缩短处理时间。建议使用荧光强度最低的细菌构建体对应的图像来调整 binning 和 threshold 参数（例如，表达水平最低的菌株）。这可确保这些样本中相关衰减信号满足筛选条件并被纳入分析。确定的参数随后可用于所有图像。 - 如有必要，调整衰减参数（青色框）。通常允许 shift 自由变化，而 scatter 和 offset 多数情况下可固定为零，前提是观察衰减函数后发现其贡献可忽略。offset 可通过查看衰减的前几个通道进行估计——注意，由于样品荧光较弱而长时间成像通常会导致非零 offset。散射主要发生在较厚的样品中，在其他情况下可视为可忽略。
- 在运行拟合前，选择拟合算法。在 Show/Hide Model Options 中打开算法设置窗口。选择最大似然估计（MLE）算法（图7A）。
- 点击 Calculate | Decay matrix 开始图像拟合。完成后，寿命编码的 FLIM 图像将出现在寿命图像面板中（图6 紫色框）。
注意：在衰减曲线窗口（图6 绿色框）中，可通过移动蓝色十字线查看图像中每个像素对应的寿命值。
注意：如需自动批量处理大量相似的 FLIM 数据文件，可使用批处理模式。 - 通过观察残差（理想情况下应围绕 0 随机分布）和接近 1 的卡方值来检查拟合质量。
- 拟合数据可导出为多种格式。如需导出为 txt 文件，请进入 File | Export。在 Export 选项窗口（图7B）中，选择 Select All，然后点击 Export。
- 最后保存分析文件。分析文件以 *.img 格式保存，可直接在 SPCImage 中重新打开。
注意：在供体/受体数量不平衡的特殊情况下，FLIM-FRET 可揭示相互作用蛋白复合物混合物中的亚群——特别是当两个组分浓度差异较大时，会形成复合物与游离物种的混合物。假设供体寿命组分在整个数据集中空间不变，可将非相互作用物种（其衰减与仅含供体的衰减非常相似）与相互作用物种区分开来。此外，可能形成非化学计量比的相互作用复合物，即含有更多供体或更多荧光受体的复合物。此类复合物的荧光衰减通常难以解释。FLIM 图谱图可用于提供有关蛋白质相互作用（PPIs）化学计量比和结合模式的关键信息20,23。FLIM 图谱图是一种将最短寿命组分作为其振幅函数的图形表示，可用于可视化具有相似衰减特征的像素。要绘制此类图，需使用双指数模型对实验荧光衰减进行拟合。以下步骤可作为该过程的指导。 - 首先分析仅含供体构建体的数据。这有助于确定供体的寿命值。理想情况下，应在与供体/受体构建体相同条件下记录的多张图像上测量该值，以获得可靠的供体寿命值。
- 确定后，使用双指数模型拟合供体/受体构建体的荧光衰减。在青色衰减参数框（图6）中，将组分数设为 2。将 t2(ps) 参数固定为步骤 1 中确定的可靠供体寿命值，并勾选复选框以固定该参数。
注意：固定长寿命组分 τ2 非常重要，以避免过拟合、提高拟合收敛性，并获得更可靠的双指数拟合参数24,25,26。 - 保存 *img 文件，并按照步骤 7.1.11 的方法将数据导出为 *.asc 文件。
图7: (A) 使用指数模型拟合衰减曲线的算法设置。选择MLE（最大似然算法或最大似然估计，MLE）作为拟合模型，以及 (B) 导出选项窗口。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 在 R 中对 FLIM 图像进行高级分析
- 如有需要，请安装 R（https://cran.r-project.org）和 RStudio（https://rstudio.com）。
- 打开 RStudio 并创建一个新项目。
- 移动所有分析 *.asc 将文件存放在项目主文件夹中名为“data”的文件夹内。
- 打开一个新的脚本文件（或打开补充脚本 FLIM_analysis.R）。
- 安装用于荧光寿命（flim）数据分析的专用 flimDiagRam 软件包：https://github.com/jgodet/flimDiagRam。在工作区中调用该软件包。（参见说明文件 HowTo_FlimDiagRam）
注意：软件包的安装只需进行一次。安装完成后，可在任何新的 R 会话中调用这些软件包。从 GitHub 下载 R 软件包需要先安装 'devtools' 软件包。'devtools' 的安装可能需要数分钟。 荧光寿命诊断图 该软件包可用于表示FLIM数据的参数与分布，提取单个细胞水平的FLIM数据，比较不同条件或菌株间的FLIM结果，并利用高级可视化工具（如FLIM图谱图）对FLIM数据进行探索。 - 使用逐步注释的代码，相关数据可供独立复现下文“代表性结果”部分中展示的所有子图。本教程详见通知 如何进行荧光诊断成像 在 https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf该代码可轻松转换用于数据分析。
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结果
不同细菌菌株的荧光寿命测得值的经验累积分布函数（ecdf）如图所示 图8如果发生FRET，ecdfs将向较短的寿命方向移动（图8A,8B）。需要注意的是，当两种蛋白质相互作用导致两个荧光基团之间距离较远时，不会发生FRET（荧光共振能量转移）图8C）。在荧光寿命成像（FLIM）中，这种情况无法与两个分子之间完全无相互作用的情形相区分。因此，当无法根据分子模型或已知的复合物结构预测染料间距离时，重要的是考虑在蛋白质的不同位点进行标记，以最大化检测相互作用的可能性。同样，由于PvdA（高表达）与非核糖体肽合成酶PvdL（每细胞仅少数拷贝）之间的蛋白表达量存在显著差异，相同的PvdA/PvdL复合物不会产生相似的FLIM-FRET数据。事实上，不平衡的化学计量比会使FLIM-FRET数据的解释变得复杂。具体而言，取决于哪种蛋白被供体染料标记，化学计量比的不平衡会导致在记录的荧光寿命分布中，游离的与结合的供体标记蛋白所占比例出现差异。...
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讨论
与基于荧光强度的FRET成像相比，FLIM-FRET具有一些关键优势。荧光寿命是荧光团的内在参数，因此既不依赖于荧光团的局部浓度，也不依赖于激发光的强度。此外，荧光寿命受光漂白的影响也较小。在细胞内蛋白质浓度在亚细胞区室或区域间高度异质的情况下，FLIM-FRET特别适用于检测蛋白质相互作用（PPIs）。当蛋白复合物浓度较低，或两种蛋白中至少一种蛋白的表达水平较低时，FLIM-FRET在所有此类情况下均具有应用价值。
在蛋白质相互作用（PPIs）的背景下，仅通过平均寿命来推断导致寿命缩短的FRET机制以及相互作用性质的信息是困难的。事实上，平均寿命的缩短可能是由于大量以中等FRET效率发生相互作用的组分所致，也可能是相反的情况，即仅有少量供体与受体在很短的距离内发生相互作用。当形成化学计量比不平衡的复合物时，情况变得更加复杂。能够同时展示多个维度信息的图形可视化工具（例如在图示中展示tau1、alpha和<tau>）有助于提供有关所形成复合物性质的关键信息。此外，在此背景下，其他数据可视化方式也具有重要意义，例如基于相量分析的方法...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Ludovic Richert 博士在荧光寿命成像（FLIM）数据采集方面的宝贵帮助，以及对 FLIM 系统的技术维护与开发工作。本研究由法国化学研究基金会（https://icfrc.fr/）的资助项目提供经费支持。VN 由法国医学研究基金会（FRM‐SPF201809006906）资助。YM 感谢法国大学研究院（IUF）提供的支持及其为科研工作所额外给予的时间。IJS 和 JG 感谢斯特拉斯堡药物递送研究所提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 525/50 nm 带通滤光片 | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm 短通滤光片 | F75-680, AHF, Germany | ||
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 硫酸铵 (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA 聚合酶 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| 光纤耦合雪崩光电二极管 | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| 玻璃盖玻片（1.5号厚度，20×20 mm） | Knitel glass | MS0011 | |
| 高保真DNA聚合酶Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| LB培养基（Lysogeny broth） | Millipore | 1.10285 | |
| 七水合硫酸镁 (MgSO4 · 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| 显微镜载玻片（25×75 mm） | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin 凝胶和PCR产物纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin 质粒提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| 磷酸氢二钾 (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| 磷酸二氢钾 (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 琥珀酸钠（二钠盐） | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage，SPCM软件 | Becker & Hickl | ||
| 无菌接种环 | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA连接酶 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC模块 | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire激光器 | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| 50 mL离心管 | Falcon | 352070 |
参考文献
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