本方案提供了用于可视化囊性纤维化患者痰液中细菌细胞及多糖合成位点（Psl）多糖的方法。
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摘要
摘要
早期检测与根除 铜绿假单胞菌 囊性纤维化患者肺部内的慢性感染发生几率可能因此降低。慢性感染的形成 P. aeruginosa 感染与肺功能下降及发病率升高相关。因此，阐明无法彻底清除感染的原因备受关注 P. aeruginosa 使用抗生素治疗时发生的情况，在约10-40%的儿科患者中出现。诸多可能影响宿主清除能力的因素之一是 P. aeruginosa 抗生素敏感性的差异与空间结构（如聚集或生物膜形成）以及多糖产生有关。因此，我们希望对这些现象进行可视化观察 原位 特征 P. aeruginosa 在中国台湾患者的痰液中。将痰液样本包埋于水凝胶基质中以保留其相对于宿主细胞的三维结构，随后应用组织透明化技术。组织透明化后，加入荧光标记物和染料以实现可视化。荧光 原位 杂交用于可视化细菌细胞，荧光标记的抗Psl抗体结合用于可视化胞外多糖，DAPI染色用于标记宿主细胞以获得结构信息。这些方法实现了高分辨率成像 P. aeruginosa 通过共聚焦激光扫描显微镜在囊性纤维化患者痰液中进行检测。
引言
本研究设计了实验，旨在可视化囊性纤维化（CF）患儿痰液中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的体内结构。P. aeruginosa 感染在30–40%的儿科CF患者中会转为慢性；一旦慢性感染建立，几乎无法根除1。来自早期感染患者的P. aeruginosa分离株通常对抗微生物药物更为敏感，因此常采用抗假单胞菌抗生素治疗，以预防慢性感染的建立2。然而，并非所有P. aeruginosa分离株在抗生素治疗后都能被有效清除。导致抗生素治疗失败的具体机制尚未完全阐明。既往研究表明，生物膜细胞密度、聚集程度以及多糖产生的变化均可能影响抗生素的疗效3。P. aeruginosa 可产生三种胞外多糖：Pel、Psl和藻酸盐（alginate）4。大多数P. aeruginosa菌株在遗传上具备表达这三种胞外多糖的能力，但通常以其中一种多糖为主导表达形式5。胞外多糖藻酸盐与CF患者肺部的慢性感染相关，可导致黏液型表型的出现6,7。多糖Pel和Psl具有多种功能，包括促进初始黏附、维持生物膜结构以及赋予抗生素耐药性8。
针对多种样本类型，已开发出用于可视化体内组织结构的方法9,10,11。近年来，这些方法已被优化，用于可视化囊性纤维化（CF）患者痰液中的体内微生物群落12。DePas 等人于2016年开发了一种专门用于识别痰液中微生物群落的组织透明化方案12。该方法被称为 MiPACT，即microbial identification after Passive CLARITY technique（被动 CLARITY 技术后的微生物鉴定），专用于 CF 痰液的透明化处理11,12。在组织透明化技术中，样本首先被固定，随后被处理为透明状态，同时保持其固有结构完整，以便进行染色和显微观察11。对 CF 痰液样本进行固定和透明化处理，可使研究人员探究与生物膜结构、细菌细胞密度、多微生物相互关系以及病原体与宿主细胞之间相互作用相关的问题。直接检测保存在痰液中的细菌的优势在于，可以在特定宿主背景下对其进行分析和可视化。尽管在实验室中对临床分离株进行体外培养研究可提供重要信息，但此类方法无法完全模拟 CF 患者肺部环境，导致实验结果与患者实际状况之间存在脱节。
本文所述方法可用于固定和透明化痰液，以观察来自囊性纤维化患者或其他呼吸道感染患者的细菌。文中介绍的特定染色和显微分析方法为荧光染色 原位 杂交（FISH），随后在水凝胶内进行抗Psl抗体结合，再通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行分析。组织透明化后，也可应用其他免疫组织化学及显微镜检测方法。
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方案
采集和储存人类受试者的痰液样本需获得研究伦理委员会（REB）的批准。本文所述研究已获病童医院研究伦理委员会（REB#1000058579）批准。
1. 痰液采集
- 将咳出的痰液置于无菌收集杯中，并在固定前立即于4 °C下保存，最长不超过24小时。
注意：痰液在4 °C下放置过久而不进行固定可能导致细胞降解，尤其是白细胞的降解。建议尽快进行固定。 - 将痰液样本转移至无菌的15 mL离心管中。
- 向痰液样本中加入等体积的4%多聚甲醛（PFA）。例如，若痰液样本为0.5 mL，则加入0.5 mL的4% PFA。通过轻柔颠倒混匀。
- 将痰液在4 °C下孵育过夜。
- 向每2 mL固定后的痰液中加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤。
注意：此洗涤步骤无需离心。 - 用移液器小心吸除上清液。
注意：为避免吸入痰液，应将移液器吸头远离痰液沉淀，缓慢吸取表面液体。该洗涤步骤不进行离心，以保持痰栓结构的完整性。 - 重复步骤1.6–1.7两次。
- 用含0.01%（w/v）叠氮化钠的PBS重悬沉淀物，体积为原痰液体积的2倍。
- 将痰液在4 °C下保存。
2. 痰液的MiPACT（组织透明化技术）处理
- 将水凝胶组分（30% 29:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺、交联剂和 PBS）放入含有厌氧包的密封容器中，脱气处理 72 小时。
注意：必须使用厌氧包和密封容器，因为氧气会抑制丙烯酰胺的聚合反应。替代方法包括在厌氧操作台中进行此步骤、对密封容器抽真空，或向丙烯酰胺混合物中通入 N2 气体以去除氧气。- 在密封的厌氧容器内，向一个未盖盖子的 15 mL 离心管中加入 2 mL 的 30% 29:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液。
- 在 15 mL 离心管中，将 0.5 g 交联剂溶于 5 mL PBS 中，配制成 10% (w/v) 的高浓度储存液。管盖保持打开状态，并存放于密封的厌氧容器中。
- 在厌氧容器内，将数毫升无菌 PBS 置于一个未盖盖子的离心管中。
- 在 15 mL 离心管中配制 5 mL 水凝胶溶液，终浓度为 0.2% 交联剂和 4% 29:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺（溶于 PBS）。通过反复倒置混匀，并进行滤膜除菌。
- 从冰箱中取出痰液样本，在无菌条件下用手术刀将其切成小段（直径约 5 mm）。
注意：如果痰液较为稀薄，仍可执行此步骤，但需更多耐心和练习；在使用手术刀分离目标组分前，需先用无菌镊子小心地将痰液从保存液中取出。 - 将切好的痰液样本放入八孔玻璃底培养皿的孔中。
- 向每个含有痰液样本的孔中加入 300 µL 第 2.2 步中经滤膜除菌的水凝胶溶液。
- 将八孔玻璃底培养皿放入含有厌氧包的密封容器中，在 37 °C 下孵育 3 小时。
注意：聚合完成后，包埋有痰液的水凝胶应具有坚实凝胶的一致性。 - 将凝固的水凝胶-痰液样本转移至含有 5 mL 8% 十二烷基硫酸钠 (SDS)，pH 8 的 15 mL 培养管中，在 37 °C 下孵育 3–14 天（可选择是否震荡），直至痰液变得透明。
注意：透明化所需时间取决于痰液成分，通常可通过震荡缩短。但需注意避免震荡速度过高而破坏样本完整性。相比黏液丰富的样本，DNA 含量较高的样本需要更长的透明化时间。 - 将 8% SDS 溶液倾入废液收集容器中。使用无菌镊子将每个包埋有水凝胶的样本转移至无菌的 50 mL 锥形离心管中。向每个 50 mL 锥形管中加入 10 mL PBS 洗涤水凝胶，静置 30 分钟至 1 小时后倾去液体。重复此洗涤步骤两次。
注意：该洗涤步骤不涉及离心操作。多余的液体和上清液需用移液器小心吸除。 - 将洗涤后的样本保存于含 0.01% (w/v) 叠氮化钠和 1× RNase 抑制剂的 PBS 中，置于 4 °C 保存。
3. 水凝胶荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）实验方案
- 使用无菌镊子将水凝胶样品从保存溶液中取出，并将其放置在无菌表面（如玻片或培养皿）上。
- 使用无菌手术刀将水凝胶切成约 1 mm 厚的薄片。
- 将 1 mm 厚的水凝胶切片放入无菌的 1.5 mL 离心管中。
- 在 1.5 mL 离心管中配制 1 mL 杂交缓冲液（25% 甲酰胺，0.9 M NaCl，20 mM Tris-HCl [pH 7.6]，0.01% SDS，经纯化和去离子的 H2O）。
- 向杂交缓冲液中加入荧光标记的 PseaerA 探针（150.7 nM12），并通过翻转混匀。
注意：甲醛溶液应远离明火。杂交缓冲液可预先配制，并分装后于 -20 °C 保存13。 - 向每个约 1 mm 厚的水凝胶切片中加入 200–500 µL 杂交缓冲液，确保水凝胶样品完全浸没。
- 将样品置于黑暗环境中，在 46 °C 下静置孵育约 18–24 小时，使 PseaerA 探针与水凝胶样品充分杂交。
- 将杂交缓冲液倾倒至废液收集容器中。
- 用滤膜除菌的洗涤缓冲液（337.5 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，5 mM EDTA（乙二胺四乙酸）[pH 7.2]，0.01% SDS，以及经纯化和去离子的 H2O）对样品进行一次冲洗：向每个 1.5 mL 管中加入 1 mL 洗涤缓冲液，随后弃去。
注意：洗涤缓冲液可预先配制，并在室温（RT）下保存。 - 向各管中加入 1 mL 新鲜洗涤缓冲液，然后在 48 °C 下黑暗环境中静置孵育 6 小时。
4. 水凝胶与Psl0096抗体结合
- 使用1 mL移液器无菌移除洗涤缓冲液。
- 加入1 mL含2% BSA（w/v）的PBS溶液，对样品进行冲洗，随后移除该溶液。
- 向水凝胶样品中加入500 µL的2% BSA/PBS溶液，以阻断非特异性蛋白结合。然后将样品在室温下避光孵育过夜，不振荡。
- 使用1 mL移液器无菌移除封闭液。
- 将抗体用500 µL新鲜的2% BSA/PBS溶液稀释至终浓度为0.112 µg/mL，配制Psl0096-Texas Red抗体溶液。
- 向水凝胶样品中加入500 µL抗体溶液，在室温下避光孵育6小时，不振荡。
5. DAPI（4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚）染色
- 在含有磁力搅拌子的烧瓶中加入40 g非离子密度梯度介质、30 µL Tween20、3 µg叠氮化钠和30 mL PBS，配制折射率匹配溶液（RIMS）。将溶液置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，或直至完全溶解。
- 使用10 mL注射器和无菌0.2 µm滤器将溶液过滤灭菌至50 mL锥形管中。
注意：该溶液可在4 °C下保存数月。 - 用无菌1 mL移液器移除Psl0096-Texas Red抗体溶液。
- 向水凝胶样品中加入1 mL PBS，随后吸除，以进行清洗。
- 在室温、避光条件下，将水凝胶样品与250 µL RIMS溶液和10 µg/mL DAPI一起孵育，轻轻振荡过夜。
- 共聚焦成像前，将样品安装到0.9 mm或1.7 mm灌流腔室中，并用玻璃盖玻片密封。
注意：若需可视化痰液黏液，可在荧光原位杂交（FISH）和/或免疫组织化学染色后、浸入RIMS前应用荧光凝集素染色12。
6. 成像
- 采用标准技术，使用 25×、40×、63× 或 100× 物镜进行共聚焦激光扫描显微镜成像。
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结果
实验的整体设计总结于图1和图2中。图1概述了痰液处理与组织透明化流程。痰液处理和透明化过程最长可能需要17天。不过，该流程可在多聚甲醛（PFA）固定后（第2天）或组织透明化完成后（第5–17天，具体取决于透明化时间）暂停，样品可在此期间储存。图2总结了荧光原位杂交（FISH）和抗体结合流程。FISH与抗体染色流程需4天完成，一旦开始应连续完成，并及时采集共聚焦图像。通过上述流程，可获得P. aeruginosa细胞的高分辨率三维图像，并可视化其在痰液中的原位结构。
痰液的清除以及本方案中所用荧光染料的后续应用，可实现对目标结构的详细可视化观察 P. aeruginosa 在样本内。所示痰液样本 图3 和 图4<...
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讨论
本实验方案的目的是观察囊性纤维化（CF）患者痰液中P. aeruginosa细胞的原位组织结构。若无法立即固定，痰液样本应于4 °C保存。已有研究表明，若在4 °C条件下保存，痰液中P. aeruginosa的细胞数量在1小时、24小时或48小时处理时均无显著变化；但若在25 °C下放置24或48小时，由于细菌生长，细菌细胞计数将显著增加14。在本研究中，痰液样本在咳出后最多于4 °C保存24小时。需要注意的是，已有研究显示，若痰液在4 °C保存并延迟超过9小时处理，其中的炎性细胞计数会下降15。因此，在确定样本处理的截止时间时，必须考虑希望在痰液中观察的特定细胞类型和标记物。
本方法中的样本处理首先使用4%多聚甲醛（PFA）固定痰液样本。多聚甲醛可交联细菌细胞及其胞外基质，从而保持其结构，便于显微观察与分析11,16。然而，如果目标是...
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致谢
作者感谢囊性纤维化基金会为本研究提供的资助，以及MedImmune慷慨捐赠的抗Psl0096抗体。本研究的成像工作在多伦多大学的CAMiLoD成像中心完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 29:1 丙烯酰胺-双丙烯酰胺，30% 溶液 | BioRad | 161-0146 | |
| 8 孔腔室盖玻片 Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen 2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell 灌注腔室 | Electron Microscopy Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA RNase 抑制剂 | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | 订购详情：产品：修饰DNA寡核苷酸；名称：PseaerA；序列：[Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC；合成量：50 nmol；纯化方式：HPLC；运输状态：全产量（干粉） | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | Psl0096-Texas Red 抗体由 Medimmune 慷慨提供，订购咨询需联系该公司。 | |
| VA-044 硬化剂 | Wako | 27776-21-21 |
参考文献
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