OP-IVM：取卵后卵母细胞体外成熟与妇科手术的结合

摘要

在妇科手术前进行的体外成熟（IVM）（OP-IVM）将取卵后的体外成熟技术与常规妇科手术相结合，是传统IVM技术在生育力保存领域应用的延伸。

摘要

在妇科手术前采用体外成熟技术（IVM）（简称OP-IVM）是传统IVM技术的延伸，该技术将取卵后的体外成熟与常规妇科手术相结合。OP-IVM适用于因良性妇科疾病需接受手术治疗，同时又有生育力保存（FP）需求或需要进行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）等不孕治疗的患者。在手术室中，接受良性妇科手术的患者首先接受麻醉，随后进行超声引导下的未成熟卵泡抽吸（IMFA）治疗。在继续进行后续妇科手术的同时，所获取的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）被送至实验室进行评估，未成熟的COCs将被转移至体外成熟培养基中，在IVF实验室中培养28至32小时。培养结束后，对卵母细胞进行评估，选择处于MII期的成熟卵母细胞，将其冷冻保存于液氮中用于生育力保存，或通过卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）进行受精，以用于IVF-ET。通过将IVM与妇科手术相结合，原本会被丢弃的未成熟卵母细胞得以被挽救并用于辅助生殖技术（ART）。本文将详细描述OP-IVM的操作步骤、临床意义及关键技术要点。

引言

体外成熟（IVM）是一种辅助生殖技术（ART），指将人类未成熟卵母细胞在体外培养至成熟，用于体外受精-胚胎移植（IVF-ET）或生育力保存（FP）。在IVM过程中，无需使用促排卵药物，从而减轻了疼痛、经济负担以及卵巢过度刺激综合征（OHSS）等并发症的风险^1,2。此外，IVM特别适用于可能无法接受或没有时间进行促排卵治疗的癌症患者的生育力保存，以及激素敏感型不孕患者的治疗³。因此，尽管IVM所获得的卵母细胞数量、临床妊娠率（CPR）和活产率（LBR）低于常规IVF^4,5，但IVM仍具有其独特的优势。

患有子宫内膜异位症、输卵管积水或卵巢囊肿的不孕患者通常在辅助生殖技术（ART）治疗前需接受妇科手术，而此类患者的卵母细胞通常未成熟。经皮超声引导下取卵行体外成熟（OP-IVM）技术通过经阴道超声引导获取未成熟卵母细胞，并在体外培养至成熟，用于体外受精-胚胎移植（IVF-ET）或生育力保存（FP）。OP-IVM 将取卵后的体外成熟（IVM）与妇科手术相结合，从而减少控制性卵巢超排卵周期中常见的并发症，并节省时间和费用。对于有生育能力的患者，在接受常规妇科手术的同时，OP-IVM 可作为一种 “生育保险”手段""。

此外，在妇科手术前进行卵母细胞采集，可减少由电凝术^6,7和卵巢肿瘤切除术等妇科手术造成的损伤。因此，与常规妇科手术相比，OP-IVM 可减少不孕治疗过程中的手术次数，并避免卵巢手术期间功能性卵母细胞的丢失。

既往研究显示，额外进行取卵手术既不会增加外科并发症和不良妊娠结局，也不会延长住院时间⁸。部分患者已通过卵巢组织取卵后体外成熟技术（OP-IVM）成功分娩活婴⁸，表明该方法具有可行性。本文描述了可能从OP-IVM中获益的患者特征，以及OP-IVM的操作步骤和关键环节，并探讨了人卵母细胞成熟度的评估方法。

方案

注意：与体外成熟卵母细胞（OP-IVM）方法相关的研究已获得北京大学第三医院机构审查委员会（IRB）和北京大学伦理委员会（2014S2004）的批准。OP-IVM 的流程概要见图1。具体操作步骤将在下一部分中逐一介绍。

1. 向适宜患者介绍OP-IVM技术

1. 确定可能从OP-IVM中获益的潜在患者，例如步骤1.1.1-1.1.3中所述患者：
   1. 对氯米芬耐药且需要接受腹腔镜卵巢打孔术的多囊卵巢综合征（PCOS）患者。
   2. 在辅助生殖技术（ART）治疗前需要接受良性妇科手术的不孕患者，例如宫腔镜下肌瘤切除术、息肉切除术、经宫颈子宫纵隔切除术、腹腔镜输卵管手术以及卵巢囊肿切除术。
   3. 正在接受化疗放疗或放疗的癌症或血液系统疾病患者。

2. 知情同意

1. 向患者提供完整信息，包括卵巢组织体外成熟（OP-IVM）可能带来的益处、操作流程、IVM卵母细胞的用途（体外受精-胚胎移植或冷冻保存）、预计的临床妊娠率（CPR）和活产率（LBR），以及可能发生的并发症。要求患者签署知情同意书以表示同意。

3. 准备标签和IVM卵母细胞培养基

1. 为培养皿和试管打印带有患者姓名和日期的标识（ID）标签。
2. 向4孔板的每个孔中加入0.5 mL添加了0.75 IU/mL促卵泡激素（FSH）和0.75 IU/mL黄体生成素（LH）的IVM 培养基。用油覆盖培养基。
   注意：所有操作均应在层流洁净工作台中进行。
3. 使用前至少6小时，将含IVM卵母细胞培养基的4孔板置于37 °C、含5% CO₂和5% O₂的加湿空气中预热。

4. 在手术室中给予麻醉

1. 在给予麻醉前，核对患者的姓名。
2. 由麻醉师通过静脉途径对患者进行麻醉。

5. 进行卵母细胞采集

1. 在培养皿和试管上贴上标签，注明名称、日期和编号。
2. 将患者置于膀胱截石位；持续用温生理盐水消毒、铺巾并冲洗阴道。
3. 将超声探头置入阴道内，扫描并记录两侧卵巢的卵泡数量 卵巢。选择最靠近卵巢的位置作为穿刺点，并避开肠管、膀胱和大的血管。
4. 吸出卵泡液。
   1. 用蒸馏水冲洗针头 pH稳定的处理液，在穿刺前使用（参见 材料清单).
   2. 在超声引导下，将19 G单腔抽吸针插入卵巢。
   3. 用穿刺针穿刺靠近探头、边界清晰的较大卵泡。在较低位置快速注入添加了25 U/mL肝素的冲洗液。在80–90 mmHg压力下用针抽吸卵泡液，轻微旋转针头以尽可能充分抽吸卵泡液。在此平面上由近及远依次穿刺其他卵泡。
      注意：抽吸过程中，含有卵母细胞的卵泡液将在负压作用下流入无菌的10 mL试管中。肝素可降低卵泡液的黏度，从而促进抽吸过程。
   4. 将针头从卵巢中退出（保持针头位于阴道壁内）。调整超声探头的方向，穿刺其他平面上的剩余卵泡。尽量抽吸所有直径约为5-9 mm的卵泡。
      ​注意：调整探头位置，使其始终尽可能靠近卵巢。以适当力度按压阴道穹窿，以减少损伤和出血。
   5. 完成一侧卵巢操作后拔出针头，用操作液清洗针头，再用相同方法穿刺另一侧。
      注意：在25-30分钟内完成卵泡抽吸。
5. 在确认患者姓名和身份证号后几分钟内，将卵泡液从手术室转移至体外受精实验室。
   注意：尽快将抽吸的卵泡液转移至体外受精（IVF）实验室操作台，以防止凝固。
6. 用B型超声在穿刺所有卵泡后检测盆腔内是否存在活动性出血。插入窥阴器，将探头尖端对准后穹隆，以检测穿刺部位的活动性出血。
   ​注意：如果卵巢位置正常，阴道穿刺部位不应观察到活动性出血 并谨慎进行卵母细胞采集。对于加压后仍持续的轻度出血，将无菌纱布垫置于阴道内压迫2-4小时。使用血管钳夹住小动脉以控制较大量出血，持续2-4小时。盆腔或卵巢出血虽罕见，但需通过腹腔镜手术进行电凝止血。

6. 妇科手术

1. 根据患者的具体需求和身体状况，在取卵后实施适当的妇科手术。
   1. 对克罗米芬抵抗的多囊卵巢综合征（PCOS）患者，行腹腔镜下卵巢打孔术。
   2. 在辅助生殖技术（ART）治疗前，对不孕患者行良性妇科手术，如宫腔镜下肌瘤切除术、息肉切除术、经宫颈子宫纵隔切除术、腹腔镜下输卵管手术以及卵巢囊肿切除术。
   3. 对因癌症或血液系统疾病需接受放化疗、拟行生育力冷冻保存的患者，行卵巢切除术。
      ​注：上述妇科手术均为基础且标准化的临床操作，各国及各医疗机构的手术指南应大致相似。

7. 进行体外成熟（IVM）

注意：卵母细胞体外成熟（IVM）的整个过程均需在 37 °C 的恒温平板上进行。

1. 使用70 µm尼龙细胞滤网过滤抽吸的卵泡液。用预热的pH稳定操作培养基反复冲洗培养管和滤网。确保将所有未成熟COCs完全转移至培养皿中。收集滤过的液体，冲洗并置于100 × 15 mm培养皿中进行培养。
2. 观察COCs（图2在体视显微镜下以40倍放大倍率进行观察。迅速将未成熟卵母细胞转移至预热的IVM卵母细胞培养液中。
   ​注：根据操作者的习惯选择合适的放大倍数。
3. 记录培养的未成熟 COCs 数量。
4. 告知患者培养的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）数量。与患者及其伴侣讨论精液采集事宜。按照常规操作流程进行精子提取。
5. 将未成熟的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在37 °C、含5% CO2和5% O2的湿润空气中培养₂ 28-32 小时。
6. 评估卵母细胞成熟度。
   1. 在体视显微镜下（40倍放大）使用玻璃巴斯德吸管反复吹打，去除卵丘细胞。观察第一极体（PB）的排出情况，以确定卵母细胞的发育阶段。参见 图2 具有典型形态特征的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）中卵母细胞、第二次减数分裂中期（MII）、第一次减数分裂中期（MI）以及生发泡（GVs）的代表性图像。
      注意：使用垂直火焰（例如本生灯火焰）将玻璃巴斯德移液管的直径拉至与卵母细胞大小相匹配。
   2. 统计MII期卵母细胞数量并记录。
   3. 选择成熟的卵母细胞用于体外受精或玻璃化冷冻。
      ​注意：进行体外受精（IVF）时，应在卵母细胞成熟的当天收集精子，但卵母细胞玻璃化冷冻时无需收集精子。
   4. 将GV期和MI期的未成熟卵母细胞与卵丘细胞一起，在原始的IVM培养液中继续培养10–14小时。重复步骤7.6.2–7.6.3。

8. 进行ICSI或卵母细胞玻璃化冷冻

1. 遵循生殖中心的标准操作流程⁸。

9. 培养胚胎并进行胚胎冷冻保存

1. 遵循生殖中心的标准操作流程⁸。

结果

截至2019年12月，OP-IVM已用于274名患者的生育力保存。2014年至2016年间158名患者的胚胎学及生殖结局已在先前发表的论文中报道。⁸以下案例讨论了一名于2016年接受体外成熟卵母细胞（OP-IVM）治疗的多囊卵巢综合征（PCOS）患者的治疗过程。该患者为28岁女性，诊断为原发性不孕、左侧附件囊肿及多囊卵巢综合征。她于9月28日接受了腹腔镜下囊肿切除术及OP-IVM治疗^th，2016年；共获得27个未成熟COCs。经过28小时培养后，选取7个处于MII期的卵母细胞进行ICSI受精。第1天具有两个原核（2PN）的优质受精卵数量为6个，第3天优质胚胎数为6个，第5天优质胚胎数为2个。第5天获得的囊胚（10月4日^th，2016）被冷冻。2月14日^th2017年，解冻一枚囊胚。该解冻后的囊胚存活，并于2月14日移植入子宫^th，2017年。人绒毛膜促性腺激素（hCG）血液检测结果为阳性，超声检查显示宫内早期妊娠。该患者于11月2日孕4...

讨论

本文所述的OP-IVM方法可推广至常规的体外成熟（IVM）应用，将取卵后的卵母细胞体外成熟技术与常规妇科手术相结合。原本在妇科手术中可能丢失的卵母细胞，现在可用于体外受精-胚胎移植（IVF-ET）或生育力保存（FP），且无需增加额外的手术风险。OP-IVM最初用于多囊卵巢综合征（PCOS）患者在卵巢打孔术前获取卵母细胞，随后其应用迅速扩展至需要良性妇科手术的不孕症患者，以及需要接受放化疗的癌症或血液系统疾病患者。由于存在转移的潜在风险，OP-IVM不适用于或不推荐用于恶性肿瘤患者。基于OP-IVM技术，本机构已建立了一种新型的中国模式卵子库，用于不孕症患者和癌症患者的生育力保存。

对于卵巢内卵母细胞体外成熟（OP-IVM），应同时考虑妇科手术的紧急程度以及获取较多数目卵母细胞的潜力。通常，体外成熟（IVM）的结果与取卵过程中获得的未成熟卵母细胞数量呈正相关⁹。优势卵泡可能抑制周围较小卵泡的生长并导致其闭锁¹⁰，从而减少所获取的未成熟卵母细胞数量。因此，若妇科手术并非紧急，OP-IVM 的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
19 G 单腔抽吸针	库克，澳大利亚	K-OPS-7035-REH-ET
4孔板	康宁
70 μm 尼龙细胞滤网	Falcon，美国	352350
一氧化碳2 培养箱	Thermo
培养油	Vitrolife，瑞典	10029，OVOIL	步骤 3.2.
FSH &和 LH	德国 Ferring 生殖健康	MENOPUR®
巴斯德玻璃吸管	Hilgenberg GmbH，德国	3154102-26
G-MOPS 培养基			穿刺前用于冲洗针头的pH稳定型操作液
IVM 培养基	丹麦奥瑞高	ART-1600-B
层流洁净工作台	ESCO
培养皿	赛默飞世尔科技，丹麦	263991
pH 稳定的操蛋与胚胎操作液，用于支持在培养箱外对卵母细胞和胚胎进行操作与处理	Vitrolife，瑞典	10130，G-MOPS PLUS	步骤 7.1.
冲洗液	库克，澳大利亚	K-SIFB-100
体视显微镜	尼康