CRISPR/Cas9 越来越多地被用于在非模式生物中鉴定基因功能。本实验方案描述了如何从制备显微注射混合物、获取并注射蚊子胚胎，到饲养、杂交和筛选注射后的蚊子及其后代以获得目标突变，从而建立致倦库蚊（Culex pipiens）的基因敲除品系。
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本文内容
摘要
摘要
Culex蚊子是多种对人类和动物健康产生负面影响疾病的首要传播媒介，包括西尼罗病毒以及由丝状线虫引起的疾病，例如犬心丝虫病和象皮病。近年来，CRISPR/Cas9基因组编辑技术已被用于诱导定点突变，方法是将与向导RNA（gRNA）结合的Cas9蛋白注射到多种昆虫物种新产下的胚胎中，其中包括属于Anopheles和Aedes属的蚊子。对Culex蚊子的操作和注射略为困难，因为这类蚊子以直立方式将卵产在浮筏结构上，而非像其他蚊种那样单独产卵。本文介绍如何设计gRNA，将其与Cas9蛋白形成复合物，诱导尖音库蚊（Culex pipiens）雌蚊产卵，以及如何准备并注射新产下的胚胎，以进行Cas9/gRNA的显微注射。我们还描述了如何饲养注射后的蚊子并筛选获得目标突变个体。代表性结果表明，该技术可用于在Culex蚊子基因组中诱导定点突变，并且经过轻微修改后，也可用于在其他蚊种中产生无效突变体。
引言
Culex 蚊广泛分布于全球温带和热带地区，可传播多种致命病毒，包括西尼罗病毒1、圣路易斯脑炎病毒2，以及引起犬心丝虫病3和象皮病4的丝虫类线虫。Culex pipiens 复合体成员包括 Cx. quinquefasciatus、Cx. pipiens pipiens 和 Cx. pipiens molestus，它们在生物学多个方面表现出显著差异。例如，Cx. quinquefasciatus 和 Cx. pipiens molestus 无法进入越冬休眠状态5,6，而 Cx. pipiens pipiens 则表现出强烈的季节性反应，并在短日照条件下进入滞育状态7,8。此外，Cx. pipiens molestus 倾向于嗜人血，而 Cx. pipiens 和 Cx. quinquefasciatus 更倾向于....
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方案
在大多数研究机构中，在产生或维持转基因昆虫之前，必须制定经批准的生物安全规程，以确保转基因生物不会逃逸或被带出实验室设施。此外，可能还适用其他政府法规。在启动此类项目之前，应查阅所有机构的政策和程序，以确定所需的文件和审批事项。
1. 设计gRNA并制备显微注射混合液
- 为每个目标基因设计 2-5 个 gRNA，因为不同 gRNA 的效率存在差异。可手动设计针对目标基因的 gRNA，也可使用 Chop-Chop 等免费程序进行设计。
- 设计并订购可扩增每个 gRNA 周围 100–200 bp 片段的引物。理想情况下，切割位点应位于 PCR 产物中间三分之一至二分之一区域。注意切割后在每侧将产生多少 bp 的片段。
- 获取 gRNA。
- 从商业公司（如 Integrated DNA Technologies、Fisher Scientific、Genescript 等）购买 gRNA。这是最简便的方法。
- 或者，在实验室中通过 PCR 扩增生成模板，用于后续的等温合成来制备 gRNA。参见 Port 等人21 和 Kistler 等人22 描述的方案。
- 通过注射携带 gRNA 的质粒进入胚胎来提供 gRNA。在此情况下，gRNA....
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结果
通过采用所述方案，我们成功地对尖音库蚊（Cx. pipiens）的胚胎进行了显微注射，并观察到注射后胚胎具有较高的存活率（约55%，图1）。早期实验的存活率较低，可能是因为卵泡前端附着在医用敷料条上，阻碍了蚊子幼虫从卵壳中脱出并顺利游入水中。确保卵的前端超出医用敷料条边缘，可显著提高幼虫存活率，并获得能够正常发育至成虫并具备繁殖能力的高质量后代（图2B）。
后续实验和筛选结果表明，生物钟基因cycle（cyc；KM355981）的无效突变已整合至显微注射胚胎的生殖系中（图3）。由于所设计的引物扩增的是靠近切割位点的cyc基因大片段，因此在杂合子F1代蚊子中难以观察到两条独立的条带。这说明在设计引物时，应使其扩增产物位于切割位点周围约100–200 bp范围内，并且对所有疑似突变个体进行测序验证至关重要。测序结果显.......
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讨论
本方案介绍了将特定突变引入基因组的方法 库蚊属 蚊子，并且也可用于编辑其他蚊子的基因组。该方案的意义在于，不仅详细说明了如何准备注射材料，还提供了关于如何诱导蚊子产卵，以及如何准备和注射卵的详细视频概述。我们还总结了如何利用雌性蚊子的生物学特性 Cx. pipiens 将卵产在独立的卵筏中，从而对每只雌虫较少比例的后代进行目标突变筛选。本文所述方法已针对以下情况优化 Cx. pipiens 但通过微小调整，也可适用于编辑其他蚊虫或昆虫的基因组。此外，本文所述的显微操作与显微注射方案可用于向昆虫胚胎中注射多种不同物质，包括转座子、双链RNA（dsRNA）或其他核酸内切酶，如TALENs或锌指核酸酶（Zinc-Finger nucleases）。同时，斜面打磨方案可制备出针孔大小可变的显微注射针，从而获得适用于注射多种不同类型注射材料的针头。针孔大小可通过在针头打磨完成后逐步降低气压，并记录气泡停止从新开口针尖流出时的气压值来推断。产生气泡所需气压越低，表明针头开口越大；反之，所需气压越高，则表明针头开口越小。开口较大的针头更适合注射较大颗粒或黏稠度较高的物质，但可能对胚胎造成更大损伤，.......
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披露
RH 任职于昆虫转化设施中心，该中心提供昆虫遗传改造相关服务。
致谢
我们感谢 David O’Brochta 博士以及昆虫遗传技术协作研究网络的所有成员，为我们及其他研究人员在遗传技术应用方面提供的帮助与培训。我们特别感谢 Channa Aluvihare 优化了显微操作方案，使得能够对 Culex 胚胎进行显微注射并成功孵化。我们还感谢在 Meuti 实验室工作的本科学生 Devante Simmons 和 Joseph Urso 在转基因蚊虫的饲养与筛选工作中提供的协助，以及来自 ITF 的 Zora Elmkami 在蚊虫饲养和注射前准备方面的帮助。本研究得到了俄亥俄州立大学传染病研究所向 MEM 提供的跨学科种子基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人工膜饲喂器 | Hemotek | SP5W1-3 | 公司所在地：英国布莱克本 |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | 公司所在地：美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 |
| 硼硅酸盐玻璃微毛细管，外径 1 mm | World Precision Instruments | 1B100-6 | 公司所在地：美国佛罗里达州萨拉索塔 |
| BV10 针头斜面打磨仪 | Sutter Instruments | BV-10-B | 公司所在地：美国加利福尼亚州诺瓦托 |
| Whatman 圆形滤纸（12.5 cm） | Sigma Aldrich | WHA1001125 | 公司所在地：美国密苏里州圣路易斯 |
| 锥形管（50 mL） | Thermo Fisher Scientific | 339652 | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| Fisherbrand 快速流速粗孔滤纸 | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| 盖玻片（24 × 40 mm） | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| 牙科橡皮障 | Henry Schein Inc | 1010171 | 公司所在地：美国纽约州梅尔维尔 |
| Scotch 双面胶带 | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| FemtoJet 4i 微注射仪 | Eppendorf | 5252000021 | 公司所在地：德国汉堡 |
| 玻璃小瓶（2 dram） | Thermo Fisher Scientific | 033401C | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| 卤代烃油 | Sigma Aldrich | H8898-50ML | 公司所在地：美国密苏里州圣路易斯 |
| P-2000 激光拉针仪 | Sutter Instruments | P-2000/G | 公司所在地：美国加利福尼亚州诺瓦托 |
| Parafilm 封口膜 | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| PC-100 加重拉针仪 | Narishige | PC-100 | 该设备与已停产的早期 PC-10 型号兼容。公司所在地：美国纽约州阿米蒂维尔 |
| Phire 直接 PCR 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | F140WH | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| Kodak Photo-Flo（1%） | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| 石英玻璃微毛细管，外径 1 mm | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | 公司所在地：英国康沃尔 |
| Guide-it™ sgRNA 筛选试剂盒 | Takara Bio USA | 632639 | 该试剂盒可用于体外检测 gRNA 是否切割 DNA 序列。公司所在地：美国加利福尼亚州山景城 |
| Sigmacote 疏水涂层剂 | Sigma Aldrich | SL2-100ML | 公司所在地：美国密苏里州圣路易斯 |
| 小型培养皿（35 × 10 mm） | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| 柠檬酸钠抗凝鸡血 | Lampire Biologicals | 7201406 | 公司所在地：美国宾夕法尼亚州埃弗里特 |
| Fisherbrand 方形培养皿（10 cm × 10 cm） | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| Tegaderm 透明敷料 | Henry Schein Inc. | 7771180 | 公司所在地：美国纽约州梅尔维尔 |
| 热带鱼饲料 | Tetramin | N/A | |
| Whatman 滤纸 | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | 公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 |
| Whatman 滤纸，4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | 公司所在地：美国密苏里州圣路易斯 |
参考文献
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephaliti....
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重印与许可
