使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

摘要

CRISPR/Cas9 越来越多地被用于在非模式生物中鉴定基因功能。本实验方案描述了如何从制备显微注射混合物、获取并注射蚊子胚胎，到饲养、杂交和筛选注射后的蚊子及其后代以获得目标突变，从而建立致倦库蚊（Culex pipiens）的基因敲除品系。

摘要

Culex蚊子是多种对人类和动物健康产生负面影响疾病的首要传播媒介，包括西尼罗病毒以及由丝状线虫引起的疾病，例如犬心丝虫病和象皮病。近年来，CRISPR/Cas9基因组编辑技术已被用于诱导定点突变，方法是将与向导RNA（gRNA）结合的Cas9蛋白注射到多种昆虫物种新产下的胚胎中，其中包括属于Anopheles和Aedes属的蚊子。对Culex蚊子的操作和注射略为困难，因为这类蚊子以直立方式将卵产在浮筏结构上，而非像其他蚊种那样单独产卵。本文介绍如何设计gRNA，将其与Cas9蛋白形成复合物，诱导尖音库蚊（Culex pipiens）雌蚊产卵，以及如何准备并注射新产下的胚胎，以进行Cas9/gRNA的显微注射。我们还描述了如何饲养注射后的蚊子并筛选获得目标突变个体。代表性结果表明，该技术可用于在Culex蚊子基因组中诱导定点突变，并且经过轻微修改后，也可用于在其他蚊种中产生无效突变体。 

引言

Culex 蚊广泛分布于全球温带和热带地区，可传播多种致命病毒，包括西尼罗病毒¹、圣路易斯脑炎病毒²，以及引起犬心丝虫病³和象皮病⁴的丝虫类线虫。Culex pipiens 复合体成员包括 Cx. quinquefasciatus、Cx. pipiens pipiens 和 Cx. pipiens molestus，它们在生物学多个方面表现出显著差异。例如，Cx. quinquefasciatus 和 Cx. pipiens molestus 无法进入越冬休眠状态^5,6，而 Cx. pipiens pipiens 则表现出强烈的季节性反应，并在短日照条件下进入滞育状态^7,8。此外，Cx. pipiens molestus 倾向于嗜人血，而 Cx. pipiens 和 Cx. quinquefasciatus 更倾向于嗜动物血⁶。然而，在美国及世界许多其他地区，这些物种之间会发生杂交，这对疾病传播具有重要影响，因为 Cx. pipiens pipiens 与 Cx. pipiens molestus 的杂交后代具有机会性吸血行为，既叮咬鸟类也叮咬人类⁹，从而成为西尼罗病毒的桥梁传播媒介。对 Culex 蚊生物学中这些及其他有趣现象的研究在一定程度上受到限制，部分原因是 Culex 蚊在实验室饲养难度略高于 Aedes 蚊，后者可产下处于静息状态且耐干燥的卵¹⁰；此外，针对 Culex 蚊物种的功能性分子工具也尚未充分发展。

CRISPR/Cas9 基因组编辑是一种强大的技术，已被用于研究多种重要蚊类物种的生物学特性^11,12,13，其中包括南方库蚊（Culex quinquefasciatus）^14,15,16。该技术由 Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 开发，利用细菌来源的 CRISPR 相关核酸酶（Cas 蛋白；参见 Van der Oost 等人的综述¹⁷）来模拟细菌抵御病毒的天然防御机制。当将 Cas9 蛋白与适当的引导 RNA 共同注射到动物胚胎中时，可在基因组内产生双链断裂。这一过程通常通过使用与引导 RNA 形成复合物的 Cas9 蛋白实现，该复合物可将核酸酶活性靶向基因组中的特定区域。在 Cas9 蛋白造成位点特异性的双链断裂后，细胞机制会尝试通过两种机制之一来修复断裂。第一种机制是通过非同源末端连接（NHEJ）将两个末端连接在一起，该过程易出错，常在基因组中产生移码插入或缺失，导致蛋白质功能丧失，从而形成基因敲除突变。另一种机制是细胞利用同源定向修复（HDR），通过寻找相似序列来准确修复断裂。这种相似序列可能来自生物体内的另一条染色体（参见综述¹⁸）。然而，如果修复后的序列与原始序列完全一致，Cas9 蛋白将能够再次切割该 DNA。此外，研究人员还可以提供一个供体质粒，其在靶序列切割位点两侧含有同源序列，并携带替代性修复序列——通常是荧光标记蛋白、原始基因的修饰版本或其他修饰——该序列可被复制并插入基因组中，即实现“基因敲入”。

胚胎注射的时机至关重要，尤其是在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在昆虫中创制突变时。这是因为Cas9蛋白和gRNA只有在胚胎处于合胞体状态（即细胞膜尚未形成、多个细胞核共存于胚胎内）时，才具有最强的突变诱导能力。对于蚊子而言，细胞核迁移至胚胎外围大约发生在产卵后2-4小时，具体时间取决于温度¹⁹，因此显微注射必须在此时间之前完成。此外，Cas9蛋白能够切割其可接触的任何细胞核DNA，导致注射后发育而成的个体由嵌合的细胞组成，其中部分细胞携带目标突变，而另一些则没有。为了使这些突变得以成功遗传，Cas9蛋白必须切割存在于未来将发育为卵子和精子的生殖系中的DNA。为确保突变发生在生殖系中，最佳做法是将所有注射材料注入胚胎中极细胞附近的位置，因为极细胞是昆虫生殖系的前体细胞。Culex 胚胎的极细胞位于其后端附近²⁰。除了胚胎注射外，还必须制定周密的后代杂交与筛选方案，以便检测目标突变。

本方案描述了如何生成gRNAs，并将其与Cas9蛋白复合以制备显微注射混合物，以及如何诱导雌性蚊子 Culex pipiens 产卵以及如何准备和注射这些卵以进行CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。此外，我们还描述了如何培育、杂交并筛选注射后的胚胎及其后代，以确认已获得目标突变。利用本方案，我们针对一个目的基因成功产生了无效突变， 循环，于巴克眼品系中 Culex pipiens该品系于2013年最初由美国俄亥俄州哥伦布市采集的蚊虫建立，并由Meuti实验室保种。本方案可用于需要在蚊虫中进行CRISPR/Cas9基因组编辑的其他研究。 库蚊 蚊子以及其他蚊虫物种，更广泛地说，该方法适用于利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对任何昆虫物种进行操作。

方案

在大多数研究机构中，在产生或维持转基因昆虫之前，必须制定经批准的生物安全规程，以确保转基因生物不会逃逸或被带出实验室设施。此外，可能还适用其他政府法规。在启动此类项目之前，应查阅所有机构的政策和程序，以确定所需的文件和审批事项。

1. 设计gRNA并制备显微注射混合液

1. 为每个目标基因设计 2-5 个 gRNA，因为不同 gRNA 的效率存在差异。可手动设计针对目标基因的 gRNA，也可使用 Chop-Chop 等免费程序进行设计。
2. 设计并订购可扩增每个 gRNA 周围 100–200 bp 片段的引物。理想情况下，切割位点应位于 PCR 产物中间三分之一至二分之一区域。注意切割后在每侧将产生多少 bp 的片段。
3. 获取 gRNA。
   1. 从商业公司（如 Integrated DNA Technologies、Fisher Scientific、Genescript 等）购买 gRNA。这是最简便的方法。
   2. 或者，在实验室中通过 PCR 扩增生成模板，用于后续的等温合成来制备 gRNA。参见 Port 等人²¹ 和 Kistler 等人²² 描述的方案。
   3. 通过注射携带 gRNA 的质粒进入胚胎来提供 gRNA。在此情况下，gRNA 应由 U6 启动子驱动（详见文献^23,24）。
4. 获取 Cas9 蛋白。
   1. 从 Fisher Scientific 等多家公司商业订购 Cas9。这是最简便的方法。
   2. 根据 Basu 等人²⁵ 和 Kistler 等人²² 的方法在实验室中表达并纯化 Cas9 蛋白。
   3. 将 Cas9 mRNA 注射到胚胎中，其将在体内翻译为有活性的 Cas9 蛋白。Cas9 mRNA 可通过体外转录在实验室合成²²，也可从 Sigma 等供应商处购买。
      注意：翻译产生的 Cas9 蛋白必须在 C 末端含有核定位信号（NLS），因此注射的 Cas9 mRNA 中也必须包含 NLS 序列。
   4. 通过基于质粒的表达在体内表达 Cas9 蛋白。在此情况下，最好使用在目标物种中已有明确表征的胚胎期启动子来驱动质粒上的 Cas9 表达。
      注意：截至目前，在 Culex 蚊子中尚未充分表征胚胎期启动子，因此建议注射纯化的 Cas9 蛋白或 Cas9 mRNA。
5. 参照 Kistler 等人²² 的方法，将 gRNA 与 Cas9 蛋白形成复合物 。
   1. 若建议同时注射 Cas9 蛋白与 gRNA，则确保 Cas9 蛋白的终浓度为 300 ng/µL，单个 gRNA 的终浓度为 80 µg/µL。将蛋白与单个 gRNA 混合于 0.2 mL 的 PCR 管中。
   2. 冰上孵育 20 分钟。
6. 使用体外检测方法（例如 Guide-it sgRNA 筛选试剂盒）测试 gRNA 活性。
   1. 通过 PCR 扩增每个 gRNA 切割位点周围的片段。
   2. 将 PCR 产物跑胶，确认其大小正确。随后纯化 PCR 产物并进行测序，以确保其靶向正确的基因区域。
   3. 取 200 ng 剩余的纯化 PCR 产物，加入 1 µL Cas9 反应缓冲液、1 µL BSA、1.5 µL Cas9:gRNA 复合物，并用缓冲液补足总体积至 15 µL。37°C 孵育 5 分钟。
   4. 再次将反应产物跑胶。若 Cas9 蛋白成功切割 PCR 产物，则主条带应变弱，并出现额外的小分子量条带。注意原始 PCR 产物条带大小的减少情况，如有需要，可通过计算条带强度的降低程度来估算切割效率。
7. 制备最终的注射混合液
   1. 对于每个成功切割其靶向 PCR 产物的 gRNA，将相应体积的 Cas9 与各 gRNA 混合于 0.5 mL 离心管中，使终浓度保持为 Cas9 蛋白 300 ng/µL，每种 gRNA 80 ng/µL。
   2. 将形成的 Cas9 与 gRNA 复合物储存于 -80 °C，待注射时使用。

2. 拉制与斜面处理针头

注意：成功的注射以及胚胎的存活需要使用锋利的针头（图1）。

1. 使用外径为 1 mm 的硼硅酸盐玻璃或石英玻璃微毛细管。在拉制前，需在化学通风橱中对微毛细管进行硅化处理。
   1. 简要步骤：将 3 mL Sigmacote 溶液倒入玻璃烧杯中，通过真空抽吸将其引入另一个装有玻璃微毛细管的烧杯中，持续至少 4 小时，使硅化溶液挥发并沉积在微毛细管的所有表面。
   2. 之后，通过缓慢打开旋塞阀，使空气逐渐进入真空腔室，使真空腔室压力缓慢恢复至环境压力。此时针头即可进行拉制。
   3. 使用拉针仪前，务必阅读其使用说明书。
      注意：以下说明详细描述了如何使用 P-2000 激光拉针仪来拉制玻璃针头。需特别注意的是，即使是同一品牌的拉针仪，不同设备之间的校准也存在差异，无法完全一致地拉制出相同的针头。获得理想针头的关键是先设定一组参数，然后在此基础上尝试略高和略低的参数组合。通过评估针头刺入胚胎的顺畅程度以及注射混合物从针头流出的情况，对各组参数下的针头进行测试，并不断优化参数，直至获得易于开刃或斜面处理、能平滑刺入胚胎且能顺畅输送注射液的针头。
2. 使用 P-2000 激光拉针仪拉制针头
   1. 打开激光拉针仪，首次拉制前让激光预热 15 分钟。
   2. 根据所用玻璃微毛细管类型对仪器进行编程（请注意，任何拉针仪的参数仅作为起始参考，因为不同拉针仪之间无法校准至完全一致的拉制效果）：
      石英：Heat = 730；Fil = 4；Vel = 40；Del = 122；Pul = 156
   3. 完成参数设置后，将一根微毛细管装入仪器并夹紧，注意仅接触微毛细管的末端，避免触碰将被激光加热的区域。
   4. 夹紧微毛细管后，用拇指和食指握住指杆，然后依次按压弹簧释放装置，释放拉杆。
   5. 挤压拇指和食指，使拉杆完全合拢。
   6. 将微毛细管另一端放入对应的夹具中，确保管子两端均略微伸出。拧紧夹具，确保两个夹具均用手拧紧，并牢固固定“拉杆”位置。
   7. 关闭拉针仪的防护罩。
   8. 按下 拉制 按钮，激光开始加热玻璃，防护罩下方的红色“激光开启”指示灯亮起。当拉杆完全分离并伴随金属撞击声时，拉制完成。
   9. 在抬起防护罩前，务必确认“激光开启”指示灯已熄灭。
   10. 用拇指和食指握住夹具外延伸的微毛细管细端，松开夹具，然后将微毛细管从夹具中取出。
   11. 使用镊子小心地将微毛细管放入铺有双面胶的方形培养皿中。放置针头时，确保针头后端先接触培养皿，再轻轻放下，避免损伤尖端。
3. 使用 PC-10/PC-100 拉针仪拉制针头
   1. 使用 4 个配重设置 PC-10 拉针仪，并将温度设定为 50.4 °C，进行单步拉制。
   2. 将一根硼硅酸盐玻璃微毛细管放入上部夹具中，然后将带配重的下部夹具升至指定位置，夹紧微毛细管的下部，确保毛细管位置合适，可拉出两根优质针头。此拉制过程较长，但能产生适合斜面处理的优质针头。
4. 针头斜面处理
   注意：这种湿法斜面处理方法可实时反馈针头开口的相对大小。
   1. 组装针头斜面研磨仪的磨盘和固定环。确保磨盘的灰色面朝上，位于上下固定环之间。交替拧紧固定环上的螺丝，确保每个螺丝均匀受力。此后，磨盘与固定环组件统称为研磨组件。
   2. 在光学平面上滴加 13 滴（约 520 µL）支承油，然后将研磨组件置于其上。将组件置于解剖显微镜下，开启斜面仪。相比 Sutter 公司的推荐用量，此处使用稍多的油量，以便在采用此湿法斜面处理时，磨盘能持续旋转更长时间。
   3. 向研磨表面加入 1% Photo-Flo 溶液，并将灯芯移至适当位置，使其浸入 Photo-Flo 溶液中。
   4. 打开主气源。将一根已拉制的硼硅酸盐针头插入持针器中，并拧紧固定环。打开调压阀的气源，调节压力至 26 PSI。
   5. 从侧面观察，使用粗调旋钮降低针头，使其接近但不接触 Photo-Flo 液面。
   6. 调节显微镜，使针头位于视野中央。先使用最低放大倍数，再逐步提高放大倍数。使用粗调旋钮仔细调节针头位置，直至其刚好接触 Photo-Flo 液面。
   7. 继续在显微镜下观察，使用粗调旋钮将针头进一步降低，使其接近但不接触磨盘表面。
   8. 使用微调旋钮，缓慢而小心地继续降低针头，密切观察针头及其在磨盘表面投下的阴影。当针头与其阴影即将接触磨盘表面时，应更加缓慢和谨慎地继续下移。
   9. 交替进行针头“斜面处理”操作：先将针头轻轻压向磨盘表面，再将其略微抬起。在抬起针头前，迅速记录微调旋钮上微米计的读数，以便后续将针头降至相同位置或略低位置。注意始终保持针头位于 Photo-Flo 液层之下。每次将针头抬离磨盘表面后，迅速停止并重新启动研磨盘旋转，以检查是否有气泡产生。若针头已适当斜面处理，空气气泡应从针头逸出并进入 Photo-Flo 溶液中。若不及时停止研磨盘旋转，可能直到针头开口过大时才观察到气泡。
   10. 若在抬起针头并停止研磨盘后未见气泡产生，重复斜面处理步骤，将针头在微调旋钮的微米计上降至略低位置，再次抬起针头，停止研磨盘并检查气泡。重复此过程，直至出现少量但持续的气泡流。
   11. 当观察到气泡后，通过停止研磨盘旋转并逐步降低气压，检查针头开口的相对大小，记录气泡停止产生时的 PSI 值，该值可相对反映斜面针头开口的大小。气泡停止逸出时的气压越低，针头开口越大。若针头在 18–20 PSI 时气泡停止逸出，表明其开口相对较小，用于显微注射时对胚胎造成的损伤较小。
   12. 检查完针头开口后，将气压恢复至 26 PSI，防止液体进入针头。然后使用粗调旋钮将针头从 Photo-Flo 液层中抬起并取出。需注意，只要空气持续从针头流出，Photo-Flo 溶液就不会进入针头内部，从而保护针头内部免受污染。
   13. 针头完全离开 Photo-Flo 液层后，关闭气源，并从持针器中取出针头。
   14. 使用镊子将新处理的针头放入装有双面胶或橡皮泥的培养皿中固定。重复此过程，直至制备出 10–20 根斜面针头。

3. 对蚊子亲代进行血液饲喂

1. 在明确的长日照条件（>13 小时光照/天）下，于 25–27 °C 饲养尖音库蚊（Cx. pipiens）幼虫，以确保蚊子不会进入越冬滞育状态（diapause）。
2. 在成虫羽化高峰后的 7 至 10 天，通过将加热单元插入电源来准备 Hemotek 膜饲系统。使用单元顶部的调节螺丝，将每个加热单元的温度调节至 37 °C（人体内部温度）或 41 °C（鸡体内温度），并使用电子温度计确认温度已准确达到设定值。
3. 准备用于饲喂的血液餐储液器。
   1. 为每个血液饲喂圆筒准备一块方形 Parafilm 膜，并用其摩擦裸露的脚部，以附着对蚊子具有吸引力的气味。
   2. 将 Parafilm 膜尽可能拉薄，并将边缘紧密包裹在餐储液器周围。如有需要，可用橡胶 O 形圈固定。
   3. 在 15 mL 新鲜或解冻的柠檬酸钠抗凝鸡全血中加入约 200 µL 的 0.1 M ATP 溶液。ATP 有助于刺激蚊子吸血，而柠檬酸钠可防止血液凝固。
   4. 手持储液器使 Parafilm 膜面朝下，用一次性移液器小心地将血液注入储液器中。每个储液器可容纳约 3 mL 血液。用塑料塞密封加样孔。
   5. 将餐储液器旋入加热单元，并放置于蚊笼上方，确保 Parafilm 膜面朝下，蚊子可通过笼网从下方吸食血液。
4. 用黑色垃圾袋覆盖蚊笼以模拟黄昏环境，并向每个笼内用力吹气，利用升高的 CO₂ 浓度刺激蚊子吸血行为。
5. 将饲喂装置保留在蚊笼上 2–8 小时，以最大程度促进吸血。定期检查并记录完成吸血的雌蚊比例（表现为腹部变红且膨大）。

4. 诱导成年蚊虫产卵

1. 吸血后四到五天，准备一个 50 mL 的锥形管用于蚊虫产卵。
   1. 在锥形管底部附近开一个约 20 mm 的孔。
   2. 用两块（每块 35 mm²）牙科橡皮障覆盖该孔，其中一块切有水平切口，另一块切有垂直切口。用胶带将牙科橡皮障固定在锥形管上。
   3. 将一段 4.25 cm 的滤纸放入 35 mm × 10 mm 的培养皿中，并加入 750 µL 蒸馏水润湿滤纸。
   4. 将锥形管倒置在滤纸上，并来回旋转数次以确保其固定牢固。
2. 使用口吸器小心地从笼中取出约 10 只 Cx. pipiens 雌蚊，并转移至已准备好的锥形管中。
3. 将一个不透明的圆筒罩在锥形管外，为蚊虫提供黑暗环境以刺激产卵，并等待 20–25 分钟。

5. 显微操作新产的 Culex 蚊卵

1. 准备用于固定蚊子胚胎以进行显微注射的载玻片。
   1. 将一段双面胶带粘贴在盖玻片的宽度方向上。
   2. 将一条细长的透明医用敷料（例如 Tegaderm，宽 2–3 mm）粘贴在双面胶带上，使其平行于盖玻片的短边，并距离盖玻片末端约 5 mm 处。
   3. 用锋利的剃刀片去除多余的双面胶带，并从盖玻片两端各去除 2–3 mm 的医用敷料和双面胶带。这样可在卵固定到盖玻片后，使油层保留在载玻片上。
   4. 使用石蜡笔在双面胶带和医用敷料周围画出一个“D”形，作为阻挡水扩散的屏障，以在注射后保持卵周围的水分。
2. 在完成载玻片准备并经过 20–25 分钟后，取下不透明的试管，检查蚊子是否已产卵。
   1. 若未产卵，则继续覆盖 5–10 分钟。
   2. 若蚊子已产卵，小心而迅速地提起锥形管并盖上盖子。将蚊子转移至另一个笼中，并在电子表格中记录收卵时间。然后向含有卵筏的滤纸中加入 50–100 µL 去离子水。
3. 在解剖显微镜下排列卵。
   1. 将一块滤纸（由快速流速的粗滤纸裁成 10 mm × 30 mm 的矩形）置于 24 mm × 40 mm 的盖玻片下方，使盖玻片覆盖滤纸左侧的 50–60% 区域。
   2. 用 50 µL 去离子水润湿滤纸。水会缓慢扩散至盖玻片下方，形成一个储水区，以在显微操作过程中保持滤纸和卵的湿润。当加水量适当时，盖玻片与滤纸之间会形成弯月面。
   3. 使用细毛画笔将卵从卵筏中分离，并调整其位置，使胚胎较窄的后端接触盖玻片（左侧），较宽的前端朝向右侧。
   4. 排列卵 20 分钟，仔细观察其颜色由乳白色逐渐变为极浅的灰色。定期检查盖玻片下方的水膜，确保水量充足。若发现卵有干燥迹象，向滤纸添加少量去离子水（20–30 µL）。
   5. 20 分钟后，丢弃所有剩余的卵。
4. 将卵转移至显微注射载玻片。
   1. 使用一小块（10 mm × 30 mm）粗滤纸从饱和滤纸边缘吸去水分，然后用镊子移除该吸水滤纸。重复 2–3 次，确保带有卵的滤纸尽可能干燥。
   2. 放置一块新的干燥矩形滤纸，并用一对镊子固定。小心地将盖玻片向左拉离排列好的卵。
   3. 在不扰动含有排列卵的小滤纸的前提下，擦干载物台上的多余水分。继续多次擦干带有卵的湿润滤纸，用拇指和/或镊子按压滤纸小块，确保在转移至注射载玻片前卵尽可能干燥。
   4. 用镊子从固定载玻片上的医用敷料条上移除纸背衬。
   5. 用拇指和中指夹持固定载玻片，使暴露的医用敷料面向下，以 45° 角度将载玻片缓慢压向排列好的卵列。放置时应使卵较宽的前端（左侧）略微超出医用敷料末端，这有助于Culex 幼虫从固定后的卵中成功孵化。
   6. 在继续用拇指和中指夹持盖玻片的同时，用食指按压盖玻片底面，确保所有排列好的卵牢固地粘附在医用敷料上。
   7. 立即翻转载玻片，使卵朝上，并在卵上覆盖一层薄薄的石蜡油（Halocarbon oil，2–3 滴；约 20 µL），以防止卵在显微注射过程中脱水。移除未粘附在医用敷料上或未被油覆盖的卵。
   8. 将卵朝上的盖玻片放入一个方形培养皿中，培养皿内放置一大块湿润滤纸，用于运输至显微注射区域。

6. 显微注射 Culex 胚胎

1. 用注射混合液回填注射针
   1. 选择一个能够轻松插入所选注射针后端的针头填充器或凝胶上样枪头，并确保填充器末端与注射针之间留有少量空间。
   2. 使用针头填充器，将少量注射混合液（约0.5–1 µL）小心地滴入注射针内，从针尾进行回填。将注射混合液滴加在注射针开始变细的部位附近。
2. 将注射针连接至显微注射仪。
3. 将载有胚胎的载玻片放置在显微镜载物台上。
4. 打开针尖
   注意：若使用斜面针头，则此步骤无需进行。
   1. 起始注射压力设为约30 PSI，并根据需要调整，以输送适当体积的注射混合液。
   2. 在解剖显微镜下，将针头置于胚胎上方，使用显微操作器小心地将针头下降至接触胚胎表面。当针头刚刚接触到胚胎时，迅速将胚胎沿垂直于针头长轴的方向移动。
   3. 为判断针尖是否成功打开，按下注射触发器，观察是否有气泡或注射混合液从针头逸出。若无液体逸出，则重复将胚胎抵向针头的操作，直至针尖打开且按下触发器时有注射混合液流出。
5. 注射胚胎
   1. 将排在首位的胚胎置于显微镜视野中央，并确保其处于焦点清晰状态。
   2. 将针头移至第一个卵的上方，同样位于显微镜视野中心。
   3. 逐步增加显微镜放大倍数，同时小心降低针头，使其始终保持在第一个胚胎的正上方，居中且聚焦。持续操作，直至显微镜达到最高放大倍数，胚胎与针头均清晰聚焦。
   4. 轻微移动载物台上的胚胎向左，并略微降低针头，使针头与胚胎处于同一焦平面。
   5. 利用显微镜载物台移动胚胎，小心而轻柔地使胚胎接触针尖。胚胎狭长的后端应出现轻微偏转。若针头过高或过低，需调整其高度。
   6. 使用载物台将胚胎的后端移向针头，观察针头刺入蚊卵的卵壳。针头应刚好穿透膜结构，刺入位置大致对应于 Culex 胚胎极细胞所在区域。一旦完成穿刺，拉动注射触发器1–3次，将注射混合液注入胚胎。注入量应较小，仅需在胚质中形成一个微小的透亮区域即可。
   7. 使用载物台将胚胎向右移动，使其脱离针尖。若注射成功，胚胎应仅有极少或无液体渗出。
   8. 向下移动载物台，使下一个待注射胚胎位于针头前方。然后再次向左移动载物台，将胚胎对准注射针并拉动注射触发器进行注射。
   9. 若发现无注射混合液流出，和/或针头拔出后胚胎有大量液体渗出，应更换注射针并重新开始操作。
   10. 销毁所有未成功注射或受损的卵。
6. 注射后胚胎的处理
   1. 完成载玻片上所有胚胎的注射后，使用去离子水冲洗除去卤代烃油。用洗瓶将水流对准覆盖在注射胚胎上方的盖玻片顶部，使水流沿盖玻片流下并经过胚胎表面，以冲洗掉油滴。注意水流不得直接冲击胚胎，以免造成损伤或使其从医用敷料上脱落。此过程可去除大部分但并非全部的卤代烃油。
   2. 在载玻片上覆盖150 µL去离子水。
   3. 将注射后的胚胎载玻片放置于方形培养皿内的湿润滤纸上。
   4. 将含有注射胚胎的培养皿置于环境培养箱中，设置温度为25–27 °C、相对湿度70–80%，并维持长日照光周期（>13 小时光照/天）。

7. 将显微注射后的胚胎（F₀）培育至成体并建立杂交

1. 每天观察注射后胚胎的载玻片，预期在1^st 一龄幼虫应在注射后1.5天孵化。
2. 统计1的数量^st 三龄幼虫，取100–200条放入鞋盒大小的密闭塑料容器中，加入450 mL去离子水和50 mg碾碎的鱼食。同时，准备1–5倍数量的容器，分别放入野生型或未注射的幼虫，用于后续与已注射蚊子交配。
3. 每天喂食幼虫一次，逐渐略微增加食物量，直至第6天达到300–500 mg^th 幼虫生命天数
4. 一旦出现蛹，使用移液枪将单个蛹转移至装有50%-75%去离子水的2 mL 微离心管中。对所有蛹重复此操作，包括胚胎期注射过的蛹以及未注射的野生型蛹。小心按压管盖，使其略微打开，以防止蚊子逃逸，同时允许少量气体交换。
5. 当成蚊在微量离心管中羽化后，将注射过的雌蚊释放至含有未交配的野生型雄蚊的笼中，确保每只注射雌蚊对应至少1只野生型雄蚊。同样，将注射过的雄蚊释放至含有未交配的野生型雌蚊的笼中，使每只注射雄蚊对应约5–10只未交配的野生型雌蚊。由于每只雄蚊可多次交配，建议采用较高的野生型雌蚊与注射雄蚊比例。因此，增加与注射雄蚊交配的野生型雌蚊数量，可提高F1代子代的产量。

8. 获取并饲养F_1­ 代蚊子，并筛选其突变

1. 成虫羽化后7至10天，按照上述方法（步骤3）为每个笼中的雌虫提供血餐。
2. 吸血后第四天，向每个笼子中放入产卵用水。每块卵筏代表单只雌蚊的后代，因此在产卵后应尽快将每块卵筏分别放入独立的塑料饲养盒（鞋盒大小）中。每个饲养盒需标记唯一标识符，并注明幼虫属于F代₁ 目标基因的生成、注射的是雄性还是雌性亲本、培养皿建立日期、饲养条件以及实验人员的姓名首字母。
3. 每天监测幼虫盘。一旦幼虫孵化，立即提供50 mg碾碎的鱼食。按照上述方法（步骤7.3）连续6天每日增加食物量。
4. 将单个蛹转移至含有1-1.5 mL去离子水的2 mL微量离心管中，标记每根管子，并将管盖拧松。
5. 成年蚊子羽化后，小心打开2 mL微量离心管，用一根手指盖住管口，另一只手将一个3 dram的玻璃小瓶倒扣在微量离心管上方。蚊子会本能地向上飞入玻璃小瓶中。待其进入后，迅速用手指盖住玻璃小瓶的开口，快速将其倒置，并在瓶口塞入一小团用10%蔗糖溶液略微润湿的棉花。此举可防止蚊子逃逸，同时为其提供必要的食物和水分来源。
6. 将含有蛹壳的离心管和装有成蚊的玻璃小瓶分别标记，注明该个体所来源的幼虫盘编号、蚊子性别以及该个体的唯一标识符。示例：II.C.M32，其中“II”表示父本为注射个体，“C”表示该个体所来源的幼虫盘/卵筏编号，“M32”表示该盘中第32只雄性个体^nd 从该幼虫饲养容器中羽化的雄性个体。
7. 将成蚊放回各自盛装的玻璃小瓶中，并重新放入环境培养箱。每天向棉塞中加入少量（约20 µL）10%蔗糖溶液。注意避免过量喂食或使棉塞饱和，否则蚊虫会陷入蔗糖溶液中而死亡。
8. 筛选具有目标突变的蚊子
   1. 使用 Phire Direct PCR Kit，按照制造商说明书从每个卵筏/幼虫培养皿中的5-10个蛹壳中提取基因组DNA，同时提取1-2个野生型个体作为对照。
      注意：由于每个培养皿中后代可能均为全同胞，因此从每个培养皿中筛选5-10条幼虫即可判断突变是否已传递给子代。若某个培养皿中所有被筛选的幼虫均无目标突变，则无需继续筛选该皿中的其他个体。若部分幼虫携带该突变，则应筛查该培养皿中的每一个个体。
   2. 使用先前设计的PCR引物（步骤1.2），利用Phire PCR试剂盒在野生型和F1子代中扩增预测突变位点附近的片段，并将PCR产物在3-4%琼脂糖凝胶上电泳，以检测是否存在明显的插入或缺失（indels）。
      注意：任何具有目标突变的个体均为杂合子，应显示两条条带，一条为野生型，另一条在目标位置处略短或略长。为区分这些条带，需比较野生型个体与F1代子代中条带的位置和厚度。理想情况下可观察到两条清晰分离的条带，但如果插入缺失（indel）非常小，则条带可能显得更宽和/或更模糊。
   3. 通过切取含有疑似插入缺失（indels）的条带（推荐方法），或纯化未上样至凝胶中的剩余PCR产物，对PCR产物进行纯化。将纯化后的PCR产物送交测序，以确定是否含有预期的突变。

9. 获取并饲养F₂和F₃代蚊子，并筛选突变体

1. 释放所有 F₁ 通过逐个检查成年蚊子的蛹蜕，并在装有野生型、未注射的异性蚊子的笼子中筛选出携带目标突变的个体。第二代回交应能消除所有由显微注射和近亲交配带来的有害效应。
2. 为突变体 F 的笼子提供血液饲料₁ 蚊虫及其野生型对应样本，如前所述。四到五天后，收集所得的 F₂ 卵筏
3. 标记并饲养 F₂ 如上所述处理幼虫，将每块卵筏放入单独标记的容器中。化蛹后，将各个蛹分别移入单独的2 mL微量离心管中，并在成虫羽化后将其各自转移至装有蔗糖浸润棉塞的玻璃小瓶中。随后对每只F代蛹壳进行筛选₂ 按照之前所述方法（步骤8.5-8.8）对个体引入目标突变。
   注意：此处所有具有目标突变的个体均为杂合子，因此在3-4%琼脂糖凝胶电泳中，PCR产物应理想地显示出两条 distinct 条带。
4. 一旦突变型 F­₂ 鉴定出幼虫后，将所有带有该突变的雄性和雌性个体放入同一笼中交配。成虫羽化后7-10天进行血餐，再过4-5天后，收集F₁代₃ 卵筏
5. 将每个 F₃ 将卵筏放入单独的幼虫培养容器中，并按上述方法标记和喂养。
6. 分离 F­₃ 将蛹分别放入单独的2 mL微量离心管中。待成虫羽化后，将其转移至装有10%蔗糖溶液浸润棉塞的单独玻璃小瓶中。按先前所述方法筛选蛹壳。此次每盘子代中约有25%个体应为无效突变的纯合子。将这些个体集中放入同一个饲养笼中，用于建立并维持新生成的蚊子突变品系。
   注意：如果纯合子蚊子数量较少，可使用杂合子F₃ 雄性和雌性个体可相互交配，以在F代中产生更多的纯合子缺失型蚊子₄ 生成

结果

通过采用所述方案，我们成功地对尖音库蚊（Cx. pipiens）的胚胎进行了显微注射，并观察到注射后胚胎具有较高的存活率（约55%，图1）。早期实验的存活率较低，可能是因为卵泡前端附着在医用胶带条上，阻碍了蚊子幼虫从卵壳中脱出并顺利游入水中。确保卵的前端超出医用胶带条边缘，可显著提高幼虫存活率，并获得高质量的后代，这些后代能够正常发育至成虫阶段并具备繁殖能力（图2B）。

后续实验和筛选结果表明，生物钟基因cycle（cyc；KM355981）的无效突变已整合至显微注射胚胎的生殖系中（图3）。由于所设计的引物扩增的是靠近切割位点的cyc基因大片段，因此在杂合子F₁代蚊子中难以观察到两条独立的条带。这说明在设计引物时，应选择能够扩增出约100–200 bp、围绕切割位点的片段，同时也强调了对所有疑似突变蚊子进行测序验...

讨论

本方案介绍了将特定突变引入基因组的方法 库蚊属 蚊子，并且也可用于编辑其他蚊子的基因组。该方案的意义在于，不仅详细说明了如何准备注射材料，还提供了关于如何诱导蚊子产卵，以及如何准备和注射卵的详细视频概述。我们还总结了如何利用雌性蚊子的生物学特性 Cx. pipiens 将卵产在独立的卵筏中，从而对每只雌虫较少比例的后代进行目标突变筛选。本文所述方法已针对以下情况优化 Cx. pipiens 但通过微小调整，也可适用于编辑其他蚊虫或昆虫的基因组。此外，本文所述的显微操作与显微注射方案可用于向昆虫胚胎中注射多种不同物质，包括转座子、双链RNA（dsRNA）或其他核酸内切酶，如TALENs或锌指核酸酶（Zinc-Finger nucleases）。同时，斜面打磨方案可制备出针孔大小可变的显微注射针，从而获得适用于注射多种不同类型注射材料的针头。针孔大小可通过在针头打磨完成后逐步降低气压，并记录气泡停止从新开口针尖流出时的气压值来推断。产生气泡所需气压越低，表明针头开口越大；反之，所需气压越高，则表明针头开口越小。开口较大的针头更适合注射较大颗粒或黏稠度较高的物质，但可能对胚胎造成更大损伤，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工膜饲喂器	Hemotek	SP5W1-3	公司所在地：英国布莱克本
ATP	Invitrogen	18330019	公司所在地：美国加利福尼亚州卡尔斯巴德
硼硅酸盐玻璃微毛细管，外径 1 mm	World Precision Instruments	1B100-6	公司所在地：美国佛罗里达州萨拉索塔
BV10 针头斜面打磨仪	Sutter Instruments	BV-10-B	公司所在地：美国加利福尼亚州诺瓦托
Whatman 圆形滤纸（12.5 cm）	Sigma Aldrich	WHA1001125	公司所在地：美国密苏里州圣路易斯
锥形管（50 mL）	Thermo Fisher Scientific	339652	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
Fisherbrand 快速流速粗孔滤纸	Thermo Fisher Scientific	09-800	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
盖玻片（24 × 40 mm）	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
牙科橡皮障	Henry Schein Inc	1010171	公司所在地：美国纽约州梅尔维尔
Scotch 双面胶带	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
FemtoJet 4i 微注射仪	Eppendorf	5252000021	公司所在地：德国汉堡
玻璃小瓶（2 dram）	Thermo Fisher Scientific	033401C	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
卤代烃油	Sigma Aldrich	H8898-50ML	公司所在地：美国密苏里州圣路易斯
P-2000 激光拉针仪	Sutter Instruments	P-2000/G	公司所在地：美国加利福尼亚州诺瓦托
Parafilm 封口膜	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
PC-100 加重拉针仪	Narishige	PC-100	该设备与已停产的早期 PC-10 型号兼容。公司所在地：美国纽约州阿米蒂维尔
Phire 直接 PCR 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	F140WH	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
Kodak Photo-Flo（1%）	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
石英玻璃微毛细管，外径 1 mm	Capillary Tube Supplies Limited	QGCT 1.0	公司所在地：英国康沃尔
Guide-it™ sgRNA 筛选试剂盒	Takara Bio USA	632639	该试剂盒可用于体外检测 gRNA 是否切割 DNA 序列。公司所在地：美国加利福尼亚州山景城
Sigmacote 疏水涂层剂	Sigma Aldrich	SL2-100ML	公司所在地：美国密苏里州圣路易斯
小型培养皿（35 × 10 mm）	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
柠檬酸钠抗凝鸡血	Lampire Biologicals	7201406	公司所在地：美国宾夕法尼亚州埃弗里特
Fisherbrand 方形培养皿（10 cm × 10 cm）	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
Tegaderm 透明敷料	Henry Schein Inc.	7771180	公司所在地：美国纽约州梅尔维尔
热带鱼饲料	Tetramin	N/A
Whatman 滤纸	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	公司所在地：美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
Whatman 滤纸，4.25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	公司所在地：美国密苏里州圣路易斯