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通过微透析芯片法进行蛋白质结晶 原位 X射线衍射研究

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DOI：

10.3791/61660

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2021年4月11日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

本文内容

摘要

本文详细介绍了用于芯片上透析法蛋白质结晶的微流控芯片的制备方案 原位 X射线衍射实验。微加工工艺使得能够在芯片的两层之间集成具有任意分子量截留值的半透再生纤维素透析膜。

摘要

本方案描述了一种可重复且低成本的微流控装置的制备方法，涵盖采用透析法在芯片上进行蛋白质结晶的完整流程，并实现了 原位 室温下单晶或序列晶体学实验。该方案详细描述了微芯片的制备过程、芯片上结晶实验的操作以及数据处理方法 原位 收集X射线衍射数据以解析蛋白质样品的结构。该微加工工艺的主要特征在于将一种市售的半透性再生纤维素透析膜集成于芯片的两层之间。嵌入膜的分子量截留值取决于大分子的分子量及沉淀剂的种类。该装置利用了微流控技术的优势，例如使用极微量的样品（<1 µL）以及对传质现象的精细调控。该芯片结合透析法，可对结晶过程实现精确且可逆的控制，适用于在微升级规模下研究蛋白质的相图。该装置采用基于光固化硫醇-烯烃的树脂，通过在光学透明聚合物基底上进行软压印光刻加工而成。此外，还评估了构成微芯片材料的背景散射及其产生的背景噪声，结果表明该芯片适用于 原位 X射线衍射实验。一旦蛋白质晶体在芯片上生长至足够尺寸并具有良好的均一性，即可借助3D打印的样品架将微芯片直接安装于X射线束前进行检测。该方法以简便且低成本的方式克服了传统蛋白质晶体学实验中使用冷冻保护剂及人工挑取晶体所带来的技术难题。在室温条件下，采集了芯片上生长的多个同晶型溶菌酶晶体的完整X射线衍射数据集，用于结构解析。

引言

阐明生物大分子的三维（3D）结构是结构生物学中持续不断的研究目标，其中X射线晶体学仍是主要的研究技术。该技术用于解析蛋白质等复杂大分子的结构细节，旨在促进理解其作用机制以及在多种生物学功能中的参与。同步辐射装置和X射线自由电子激光（XFELs）提供的强大X射线源，具备在接近原子分辨率下深入探究蛋白质结构所需的全部工具。尽管X射线在结构研究中具有诸多优势，但X射线辐射本身以及结晶过程仍存在固有的局限性。高X射线通量和蛋白质晶体在X射线束前长时间暴露所引发的辐射损伤，是晶体学家必须克服的限制因素，通常需借助低温冷却技术来缓解1。然而，寻找最优的低温冷却条件可能十分繁琐，因为这可能会掩盖蛋白质天然结构的构象变化或引入人为假象2,3。此外，近期研究表明，在室温下进行衍射实验可导致更低的特异性辐射损伤4。结构生物学中的另一个瓶颈是获得尺寸足够且能良好衍射的晶体5。小晶体更容易获得，尤其是在膜蛋白的情况下，但由于必须将高辐射剂量集中于更小的体积，即使在低温冷却条件下，小晶体也更易受到辐射损伤，相较于较大蛋白质晶体更为脆弱6。在同步辐射装置和XFELs上发展的串行晶体学新方法7,8，可通过整合来自多个同晶型且随机取向的蛋白质晶体的数据集，克服辐射损伤的限制，同时有效利用更小的晶体（200 nm至2 µm）7，并得益于相关技术进步，如飞秒脉冲、更短的曝光时间以及微聚焦X射线束5,7,9,10。

微流控技术对X射线晶体学具有重要价值，在生物大分子的结晶及其结构研究中展现出多方面的优势。在微流控装置中进行结晶实验所需蛋白样品体积小，因而可降低这些高价值生物大分子的生产成本，并有利于对大量结晶条件进行高通量筛选与优化。此外，微流控尺度固有的高比表面积以及扩散主导的传质现象，能够实现对流体、温度梯度或浓度梯度的精确调控11,12,13,14，使微流控装置适用于培养尺寸均一的晶体并研究相图15,16,17,18,19此外，微流控工具在解决蛋白质晶体学的另一难题方面展现出独特潜力，即样品递送，以及在用于X射线衍射实验前对蛋白质晶体进行操作和收集的必要性。芯片上 原位 X射线晶体学消除了数据收集前对晶体的人工操作以及晶体质量可能下降的问题。多种适用于 原位 X射线蛋白质晶体学已由多个研究团队设计、开发和测试，这些团队面对的是微加工材料本身的性质及其与X射线相互作用所带来的相关限制14,19,20,21,22,23制造材料必须具有光学透明性、生物惰性，并在数据采集过程中对X射线辐射具有高透过率和最佳的信噪比。

常规蛋白质晶体学中应用的大部分结晶方法24,25 也已在微流控尺度上实现11,14 用于芯片上的结晶 原位 X射线衍射分析。采用蒸气扩散法的简单、杂交或多层次微流控装置26，蒸发27，自由界面扩散（FID）28微批量26，甚至接种29 已用于可溶性蛋白和膜蛋白的结晶。可通过高通量筛选和优化结晶条件实现30,31 在孔板中32基于液滴的33或阀门控制的34 设备 原位 在室温下对具有挑战性的蛋白质靶标进行X射线衍射实验时，已使用多种材料制成的微流控芯片开展研究，这些材料包括PDMS（聚二甲基硅氧烷）、COC（环烯烃共聚物）和PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）。21,22,26,28,29石墨烯薄膜23，聚酰亚胺薄膜（Kapton）35环氧胶6，或 NOA（Norland光学胶）19 并且已评估了材料对X射线辐射的透射性及其对背景噪声的贡献。此外，已设计微芯片以实现耦合 原位 以及在同步辐射源上进行X射线蛋白质晶体学实验时，将序列数据采集策略集成于单一工具中23,35,36 和XFELs7.

室温下 原位数据采集已应用于多种递送方法和装置中。例如，Nogly 等人54使用脂质立方相（LCP）注射器，结合X射线自由电子激光（XFEL）光源，通过序列飞秒晶体学（SFX）研究光驱动质子泵细菌视紫红质（bR）的结构。该研究解析出分辨率为2.3 Å的bR晶体结构，证明了LCP注射器与时间分辨序列飞秒晶体学（TR-SFX）的兼容性。Baxter 等人55设计了一种高密度多晶体网格，由厚度为100或200 µm的聚碳酸酯塑料制成，其上具有多种尺寸的激光切割孔。在将该装置用于坐滴或悬滴结晶实验时，可在网格一侧固定一层额外的5 µm厚聚碳酸酯薄膜。这种高密度网格具有多种用途：晶体可直接加载到装置的孔位上，也可通过蒸气扩散法或LCP法在装置上生长晶体。此外，该网格可安装于标准磁性底座中，用于在低温或室温条件下进行原位 X射线数据采集。最近，Feiler 等人56开发了一种适用于大分子原位 X射线晶体学的样品支架，可在低温和常温条件下实现极低背景噪声的测量。该支架具体包括一个塑料支撑体、一层透明的环烯烃共聚物（COC）膜以及一层具有微孔结构的聚酰亚胺膜。该设计旨在替代常用的盖玻片用于设置结晶液滴，同时允许在不打开结晶液滴或手动操作晶体的情况下，原位进行配体浸泡、复合物形成及低温保护等操作。此外，该样品支架可从结晶板上取下，并置于磁性底座上，用于标准测角仪型光束线的原位数据采集。在常温数据采集时，实验前移除COC膜，仅剩21 µm厚的聚酰亚胺膜产生背景散射，此时背景信号极低。上述实例仅占当前研究中为X射线蛋白质晶体学所开发的众多多功能微芯片的一小部分。

然而，透析蛋白质结晶方法尚未在微流控技术中得到广泛应用。透析是一种基于扩散的方法，旨在通过半透膜使沉淀剂浓度达到平衡，从而接近蛋白质结晶所需的设定浓度，并实现对结晶条件的精确且可逆的控制24。可根据大分子和沉淀剂的分子量选择半透透析膜的截留分子量（MWCO），以允许小分子沉淀剂扩散，同时保留目标大分子。由于透析过程具有可逆性，因此可结合温度控制，独立地解耦并优化成核与晶体生长过程37，从而在使用同一样品的情况下，通过调节沉淀剂浓度来研究相图。de Jong 等人38综述了微流控系统中膜的集成应用，而将透析技术引入微芯片的生物学案例研究主要集中在样品制备、浓缩或过滤应用39,40,41,42，或与细胞相关的研究43,44。Shim 等人37利用 PDMS 的渗透蒸发作用，在不同条件下研究了木聚糖酶的成核与生长过程。水穿过15 µm厚的PDMS膜进入微流控装置的蛋白质储液区，从而改变蛋白质和沉淀剂的浓度。

Junius 等人开发的实验方案19,45 用于制造一种微流控芯片，该芯片可同时兼容片上微透析蛋白质结晶 原位 室温下的X射线衍射实验被展示。器件制备的方案直接受到Studer及其同事所完成的开创性工作的启发12,46 用于嵌入市售膜的光固化硫醇-烯基树脂NOA 81微图案化贴片，采用软印模光刻技术。该方法的创新性改进实现了微芯片的制备，可利用微透析精确监测和控制芯片上蛋白质晶体生长的实验参数，同时加以利用 微流控技术的优势，例如每次实验减少蛋白质样品的消耗量（<1 µL）。在之前的研究中，透析原理应用于宏观尺度系统（典型体积 >通过绘制温度-沉淀剂浓度相图，展示了用于筛选和优化结晶条件的20 µL级微小体积方法47本研究描述了一种制备透析微芯片的方案，该芯片整合了不同截留分子量（MWCO）的再生纤维素（RC）透析膜，用于在芯片上进行结晶实验。 原位 X射线衍射数据采集。已对构成微芯片的材料在X射线透射性方面进行了评估19 且设备可直接置于X射线束前方，用于室温实验 原位 衍射实验，避免手动操作并最大限度减少脆弱蛋白质晶体的降解。在一个案例研究中，通过芯片上的微透析法生长出尺寸均一的鸡蛋清溶菌酶晶体。随后，将该微芯片安装在X射线束前方，使用3D打印支架固定19 并完成 原位 在室温下从多个同晶型晶体收集了衍射数据集，展示了芯片在具有挑战性的大分子靶标同步辐射串行晶体学研究中的高潜力与重要性。

方案

1. 掩模设计与母版制备

  1. 使用任意矢量绘图软件绘制所需微流控装置的几何结构。针对下一步光刻工艺中将使用的每一层光刻胶，分别准备独立的掩模：一张掩模上包含通道和柱状结构的轮廓，另一张仅包含柱状结构。
  2. 将绘图软件生成的CIF文件转换为胶片光掩模。此步骤可通过商业服务完成。根据光刻过程中所用光刻胶的类型，选择相应的光掩模。
    注：对于SU-8光刻胶，应订购黑色图案、透明背景的掩模。SU-8是一种基于环氧树脂的负性光刻胶，这意味着在紫外光（365 nm）照射下，受光照区域会发生交联，而未受光照区域仍可溶解。因此，掩模上的黑色图案区域在光刻过程中不会被紫外光交联。通道和柱状结构将在母模上被刻蚀出来。
  3. 通过使用SU-8负性光刻胶的光刻工艺，在硅片上为每个芯片设计制备两个母模。
    ​注：步骤1.3.1–1.3.7需在洁净室中进行。以下所述步骤为光刻工艺后接PDMS软光刻的传统流程，此类流程已在众多教科书中描述。所有实验参数（光刻胶、时间、温度等）的取值均依赖于多种细微因素，需根据所用不同设备进行优化。
    1. 使用一片3英寸硅片，并将其表面用等离子体处理90秒，以促进SU-8光刻胶的沉积与附着。
    2. 在硅片中央倒入约3 mL SU-8光刻胶，通过匀胶机旋涂至所需厚度（图1A）。对于标称厚度为50 µm的情况，使用SU-8 3050光刻胶，先以500 rpm转速旋涂10秒，再以3500 rpm转速旋涂30秒。随后在热板上于368 K温度下前烘15分钟，使树脂中的溶剂蒸发，实现部分固化，防止其在后续光刻过程中粘附于掩模。之后将硅片在室温下静置2分钟。
    3. 将光刻胶暴露于紫外光下（图1B）。使用功率为35 mW cm-2的掩模对准器，曝光时间为8秒。
    4. 进行曝光后烘烤。将硅片置于热板上，在368 K温度下加热5分钟，以完成由紫外曝光引发的光化学反应。
    5. 将未交联的SU-8光刻胶去除：将硅片浸入含丙二醇甲醚醋酸酯（PGMEA）的溶液中，搅拌15分钟。随后用异丙醇冲洗硅片，直至无浑浊沉淀物可见。用氮气吹干硅片，并将其存放于培养皿（标准尺寸100 mm × 15 mm）中。
    6. 用硅烷处理硅片表面，以利于后续用于制作两个印章的聚二甲基硅氧烷（PDMS）的脱模。将硅片置于加热板上，在六甲基二硅氮烷（HMDS）蒸气环境中于368 K下加热10分钟。
      ​注：若在多次使用后发现PDMS难以从硅片上剥离，则应再次用HMDS蒸气处理硅片表面。
    7. 第一个包含通道和柱状结构的母模已准备就绪。重复上述步骤，制备第二个仅包含柱状结构图案的母模。
      ​注：光刻工艺的目标是在SU-8母模上获得高度为50 µm的装置几何结构。然而，在两个SU-8母模制备完成后，应使用轮廓仪测量母模上刻蚀结构的实际高度，以获取实验值。本实验方案中所制备的两个SU-8母模实测高度均约为45 µm。

2. PDMS 模具的制备

注意：只要使用层流罩，在处理 NOA 81 树脂时使用黄光照明（步骤 3.6–3.11），并具备可用于聚合 NOA 81 树脂的紫外光源（步骤 3.7 和 3.11），本实验方案的以下步骤可在任何实验室中进行。

  1. 将50 g PDMS硅胶基质与其固化剂按10:1的质量比混合。
  2. 将两种成分在烧杯中用刮刀混合均匀，然后将混合物放入真空腔室以去除所有气泡。
  3. 将25 g预混的PDMS倒入SU-8模具（存放于培养皿中），覆盖微通道和微柱结构，高度约5 mm。将剩余的25 g PDMS倒入第二个SU-8模具中，仅覆盖微柱结构，高度约5 mm。图1C).
  4. 将两个培养皿放入烘箱中，在 338 K 下固化 PDMS 层 1 小时。
  5. 用手术刀沿SU-8模具上的图案边缘切割固化的PDMS层，并轻轻将PDMS模具从模具上剥离。图1D).
    注意：上述步骤称为复制 molding（replica molding），常用于制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具，该模具将被固定在玻璃表面，并作为微流控装置的一部分53在此方案中，PDMS模具并非芯片的组成部分，而是作为芯片制备过程中的中间模板使用。针对每种设计，均需使用相应的SU-8母模制备两块PDMS模具。图1D 和1E）并将根据以下描述用于微芯片的制备。

3. 透析芯片的制备

  1. 将带有通道和柱状结构图案的PDMS模具放置在刚性显微镜玻片（标准尺寸为3 x 1英寸）上，图案面朝上（图1F）。对应于蛋白质储液池的中央柱状结构在垂直方向上比PDMS模具的水平表面高出45 µm。
  2. 裁剪并分离一块干燥的再生纤维素（RC）透析膜，将其放置在支撑于玻片上的PDMS模具的中央柱状结构上（图1F）。
    注：RC透析膜为市售产品，其分子量截留值（MWCO）应根据所研究蛋白质及所用沉淀剂的分子量进行选择。RC透析膜的尺寸取决于芯片设计。本方案中设计了两种原型，蛋白质储液池体积分别为0.1或0.3 µL。在这些情况下，透析膜的尺寸分别为2 x 2 mm2 或 4 x 4 mm2。
  3. 将仅带有柱状结构图案的第二块PDMS模具图案面朝下放置在支撑于玻片上的PDMS模具上方（图1F）。该模具的中央柱状结构对应于蛋白质储液池，在垂直方向上（朝下）比水平表面高出45 µm。
  4. 对齐两块PDMS模具的中央柱状结构。RC透析膜被"夹在"两块PDMS模具之间（图1G）。
    注：两块PDMS模具微结构之间的对齐可通过肉眼完成，无需额外设备。否则，可在显微镜下进行此操作。只要流体通道以及输入或输出点未被完全覆盖，储液池之间的小幅偏移并不影响使用。
  5. 将组装体置于真空干燥箱中干燥30分钟，以去除PDMS模具中所有被困住的气泡，并促进下一步制造过程中树脂的填充。
    注：两块PDMS模具依靠PDMS-PDMS间的粘附力固定，无需额外压力或其他临时键合方式。
  6. 通过毛细作用将光固化、基于硫醇-烯烃的NOA 81树脂填充至两块PDMS模具之间的空隙中（图1H 和 1I）。
  7. 使用准直紫外灯（功率为35 mW cm-2）照射紫外光（365 nm）8秒，使树脂固化。
    注：此次初步曝光使NOA 81树脂发生部分交联，因两侧与PDMS模具接触的一薄层NOA 81仍保持未固化状态。
  8. 使用手术刀切除PDMS模具外侧多余的NOA 81。
  9. 将上层PDMS模具连同部分交联并粘附其上的NOA 81从底层PDMS模具及玻片上取下。
  10. 将一块厚度为175 µm的PMMA片材裁剪成显微镜玻片的标准尺寸（3 x 1英寸），并从PMMA片材两侧剥离塑料保护膜。轻轻将上层PDMS模具与部分固化的NOA 81的组合体压在PMMA片材上（图1J）。
  11. 再次暴露于紫外光下照射60秒以完全固化NOA 81，随后移除上层PDMS模具（图1K）。树脂无需进一步处理即可牢固粘附于PMMA基底上。
    ​注：只要PDMS模具未发生弯曲，经异丙醇和丙酮清洗后可重复使用约5次。RC透析膜已整合入NOA 81贴片中，无需进一步操作或机械夹紧。

4. 流体连接件

注意：微流控芯片的设计包含一条用于结晶溶液的线性流体通道，以及一个用于蛋白质样品的中央储液池（蛋白质储液池），两者均在图2A中两个微芯片的俯视图中展示。一层RC透析膜嵌于这两个微结构之间（图2D），在膜两侧的芯片区域之间因浓度梯度的存在，结晶溶液中的沉淀剂会穿过膜扩散，从而推动结晶过程的进行。微流控通道被压印在底部PDMS模具上（图1F）。一旦芯片制备流程完成，该线性通道即位于NOA 81贴片的底层，并与PMMA基底接触，如图1K所示。结晶溶液的入口和出口通路分别位于线性通道的两端，外观呈孔状（总高度90 µm），如图2A所示。为便于结晶溶液的操作，需在这些通路处安装连接器。

  1. 使用快速环氧胶将市售的连接器（NanoPort）固定在微流控通道的入口和出口处（图2C）。
  2. 根据连接器的尺寸选择合适直径的PTFE管。PTFE管将用于向芯片的流体通道中引入结晶溶液。
    注意：建议使用市售试剂盒，以便对流速进行简便且精确的控制，这类试剂盒通常与自动化的压力驱动或流量控制（注射泵）系统联用，用于混合和流体操作。然而，结晶溶液也可通过一次性塑料注射器手动注入线性通道中。在此情况下，建议执行步骤4.3至4.5。
  3. 用1 mL一次性注射器吸取结晶溶液。对于本方案中所述的芯片，注入400 µL溶液即可充满整个流体通道。
  4. 截取两个移液器吸头，使其一端的直径与用于溶液操作的PTFE管内径相匹配。使用快速环氧胶将截短后的吸头粘接至通道的接入点（图2B）。
  5. 用适当尺寸的PTFE管将注射器与截短的吸头连接，并通过缓慢而持续地推动注射器活塞，将溶液注入通道内。

5. 蛋白质包封

注意：用于作为蛋白质储存区的芯片区域目前仍向大气开放。以下方案旨在将蛋白质样品精确地限定在微流控芯片内部。

  1. 如图2E所示，用移液器手动将蛋白样品液滴加入位于RC透析膜正上方的蛋白储液池内。蛋白样品的体积根据芯片设计而定，可为0.1或0.3 µL。
  2. 在蛋白储液池周围均匀涂抹一层高真空硅脂。
  3. 剪取一小块厚度为175 µm的PMMA片材，轻轻放置在硅脂薄层之上，确保PMMA片完全覆盖住已滴加蛋白溶液的蛋白储液池表面。
    注：硅脂用于增强密封性并防止蛋白液滴扩散。用于覆盖蛋白储液池的PMMA片与NOA 81贴片之间无任何粘合或密封，二者接触面为固-固界面。为了实现整体密封及对蛋白样品的气密性封装，需按步骤5.4所述使用Kapton胶带。
    注：当采用压力驱动系统将结晶溶液引入微流控通道（步骤6.4）时，有时难以将蛋白样品限制在芯片指定的腔体（蛋白储液池）内。为避免上述问题，在循环结晶溶液时应维持相对较低的压力。建议对水溶液使用20–60 mbar的注入压力，对黏度较高的溶液（如PEG、甘油）使用50–150 mbar的压力19。
  4. 裁剪一块足够大的Kapton胶带（厚度20 µm），使其能够覆盖住位于蛋白储液池上方的PMMA片，并粘附在NOA芯片四周。此时蛋白样品已被封装于储液池中，芯片已准备就绪，可用于结晶实验，如图2C所示。
    ​注：只要透析膜和NOA在PMMA基底上的粘附性未受损，芯片可重复使用多次。若芯片的这些部分受损，则会出现泄漏，表明该装置已无法继续使用。芯片的清洗方式取决于所用的结晶溶液。对于低黏度溶液（如盐类、缓冲液），可通过向流道中注入去离子水并使其流动数分钟来进行清洗。为完全替换通道内的溶液，所需体积为400 µL。对于黏度较高的溶液（如PEG、甘油），不建议重复使用芯片，因为仅用水清洗通道并不充分。芯片上部（即蛋白储液池所在区域）也可用去离子水清洗，并用加压空气吹干。

6. 芯片上蛋白质结晶

  1. 称取冻干的鸡卵清溶菌酶粉末，溶于蒸馏水中，配制成终浓度为 30 mg mL-1 的溶液。
  2. 将蛋白溶液经 0.22 µm 滤膜过滤，并在 293 K 条件下以最高速度离心 5 分钟，以去除所有固体颗粒。取上清液用于结晶实验。
  3. 配制 500 µL 结晶溶液，其中缓冲液和沉淀剂的浓度见表 1。将溶液经 0.22 µm 滤膜过滤。
  4. 使用注射器、自动压力驱动流体系统或注射泵，将溶液注入芯片的进样口，操作如步骤 4.1–4.5 所述。
    注：结晶实验可在静态条件下进行，即微流控通道充满结晶溶液后静置；也可在流动条件下进行，即以恒定流速持续向通道内注入溶液。对于后者，建议使用外部压力驱动系统或注射泵。在流动条件下进行实验还可实现流体通道内结晶溶液的动态更换，从而利用同一样品蛋白进行多个实验。
  5. 当微流控通道充满结晶溶液后，用 Parafilm 封膜密封芯片的进样口和出样口。
  6. 用移液器将适量体积的蛋白溶液加入蛋白储液池中，并按照步骤 5.1–5.4 所述方法封装蛋白样品。
  7. 将芯片置于 293 K 条件下保存。
    ​注：透析法结晶的动力学过程与采用蒸汽扩散法或批量结晶法的实验不同，其过程显著依赖于参与扩散的沉淀剂分子的性质，根据实测数据51，成核可能需要更长时间才能开始。为防止在此期间可能发生蒸发，应将芯片置于 293 K 的饱和湿度环境中。

7. 原位 片上X射线衍射

  1. 用于光束线的3D打印支撑结构
    1. 打印可同时承载三个芯片的支撑架。该支撑架的尺寸与商用结晶板（96孔/SBS标准）相同，可兼容板内X射线衍射实验。
      注意：支撑结构的打印可交由商业服务机构完成。该支撑结构使用3D-CAD设计软件进行设计，如图所示。 图3A 在芯片上进行蛋白质结晶实验期间及在 图 3B 在……期间 原位 在欧洲同步辐射装置（ESRF）BM30A-FIP线站进行X射线衍射数据采集
    2. 使用单面或双面胶带将透析芯片固定在支架上。
  2. 原位 X射线衍射
    1. 在室温下收集从蛋白质储液中生长的晶体的X射线衍射数据。例如，使用能量为12.656 keV、通量为3.32 × 1010 光子 s-1 光束尺寸为 250 × 250 µm2使用 ADSC Quantum 315r 探测器（配备 3 × 3 CCD 矩阵，有效感光面为 315 × 315 mm）记录衍射图像2 940万像素分辨率。
      注意：在透析芯片上生长的溶菌酶晶体的衍射数据是在欧洲同步辐射设施（ESRF）的BM30A-FIP光束线上收集的。然而，其他X射线辐射源的光束尺寸、通量和探测器类型可能有所不同。3D打印的支撑结构可实现围绕晶体在-40°至+40°范围内的角度采集数据。所暴露的溶菌酶晶体数量为 原位 数据收集、每个晶体收集的衍射图样数量、每次曝光的振荡角度范围以及曝光时间总结如下 表 2.
  3. 数据处理
    1. 使用XDS程序处理溶菌酶晶体的完整或部分数据集及其衍射图样48.
    2. 为每套数据生成HKL文件，并使用XSCALE软件进行标度处理48.
    3. 使用 CCP4 套件中的 Phaser 程序进行分子置换49 并确定用于模型构建的相位。在此步骤中，使用来自蛋白质数据库（PDB）条目193L的溶菌酶已知3D坐标。
    4. 使用 Phenix 精修结构52 使用 COOT 检查最终的蛋白质模型50.

结果

Junius 等人开发的微流控芯片19,45 适用于芯片上采用微透析法的蛋白质结晶 原位 室温下进行X射线衍射数据采集。微芯片的图片、其详细设计、流体连接器以及RC透析膜如图所示。 图2将蛋白质样品通过手动移液直接加入蛋白质储液池中，并使用自动化压力驱动系统、注射泵或借助注射器手动将结晶溶液引入线性流体通道，从而建立结晶实验。蛋白质储液池与流体通道可在 图 2A用于制造芯片的设计方案 0.1 µL 或 0.3 µL 蛋白质储液的最大体积如图所示 图2A 左侧和右侧。带有 0.2 µL 或 0.7 µL 蛋白质样品的最大载样量在其他地方已有展示19该装置制备方案的关键在于使用光固化硫醇-烯烃类树脂NOA 81，封装市售的具有不同截留分子量（MWCO）的RC透析膜。在微流控装置的制备过程中，线性流体通道被压印到底层PDMS模具上。图1F），而上层PDMS模具仅包含用于蛋白质储存区以及进样口和出样口的图案化柱结构（图1F）。一旦NOA 81完成交联并从组装件上移除PDMS模具后（图1K），微流控通道位于芯片的底层，而蛋白质通道及进样/出样口位于两层之中。 图1L 展示了透析芯片的侧视示意图，其中标明了装置各层及其相应的厚度。芯片底层（流体通道）上压印图案的高度约为 45 µm，而进出口端口的总高度约为 90 µm. 蛋白质储存液（45 µm 高度）也在图中展示 图 2D 和 2E在光学显微镜下观察两层的对齐情况，微芯片内嵌入的再生纤维素透析膜部分可清晰辨别。 图 2D在同一图像中，上样结晶溶液时有空气被截留在微流控通道内，如蛋白质储液池左上区域所示。 图2E 是蛋白液滴通过移液器手动点样后、在用PMMA和聚酰亚胺胶带封装液滴前的蛋白储存区特写照片，如实验方案步骤5.2和5.3所述。图中还展示了蛋白样品完成封装以及流体连接件粘接后，准备用于结晶实验的微流控芯片。 图2C气密性组装可确保不会发生泄漏。微流控通道的进样口和出样口所用的流体连接件，可采用方案步骤4.1中所述及图中所示的市售产品。 图2C，或可使用一次性移液器吸头达到相同目的（图2B，方案步骤 4.4）。

在微流控芯片的制备过程中，选用了光学透明且生物惰性的材料，表现出良好的生物相容性 原位 室温下的X射线衍射实验。X射线与微流控装置材料及周围大气（空气）之间的相互作用，包括吸收和散射，会产生一种称为背景噪声的信号。该噪声会叠加到探测器记录的蛋白质晶体衍射信号上，降低信噪比，因此在X射线衍射数据采集过程中应尽可能保持背景噪声处于最低水平。我们评估了构成蛋白质储存区的材料所产生的背景噪声，该区域位于X射线束的直接路径上。蛋白质储存区由RC透析膜、Kapton胶带以及两片PMMA组成，其中一片PMMA用作芯片基底，另一片用于封装蛋白质样品。PMMA的厚度为2 × 175 µm聚酰亚胺胶带的 20 µm，且RC透析膜的孔径约为 40 µm 厚（图1L）。这些层的总厚度约为 410 µm 且NOA 81层不在X射线的直接路径中。除了制造材料的厚度外，其密度对于测量背景散射噪声也至关重要，因为X射线散射随元素原子序数的增加而增强。因此，在ESRF的BM30A-FIP光束线上进行材料表征和蛋白质衍射实验的数据采集时，使用了氦气流（ESRF BM30A-FIP提供的功能）而非空气。 图3C 展示了聚酰亚胺胶带、RC透析膜、PMMA薄片及其在氦气环境中的组装所产生的背景噪声。每种材料均暴露于波长为0.98 Å的X射线照射20秒，样品与探测器之间的距离为200 mm。实验在ESRF的BM30A-FIP光束线上进行，具体步骤如方案第7步所述。在分辨率低于4 Å时可观察到聚酰亚胺胶带产生的弥散环，PMMA薄片的弥散环出现在4–8 Å分辨率范围内，透析膜的弥散环出现在4–5 Å分辨率范围内。透析芯片产生的背景噪声主要出现在分辨率低于6 Å的区域，该噪声不影响大尺寸溶菌酶晶体高分辨率衍射数据的处理。微芯片及各单独材料的背景散射强度随分辨率的变化关系在其他文献中已有报道19. 在所呈现的测量中 图3C透析芯片中无任何溶液（蛋白质或沉淀剂溶液），尚未测量溶液存在对背景噪声的影响。芯片被安装在3D打印支架上，置于X射线束前方图3B）专为 原位 衍射实验19然而，使用与96孔/SBS标准结晶板尺寸相同的支撑架，可同时进行1至3个结晶实验，因为它最多可同时容纳3个芯片（图 3A).

实验旨在评估微流控装置结合微透析方法在芯片上对模式可溶性蛋白质进行结晶的效率。按照方案步骤4所述填充流体通道，而步骤5和步骤6描述了如何将蛋白质样品封装至专用的蛋白质储液池中，以及如何设置结晶实验。 图4 显示在293 K、1.5 M氯化钠（NaCl）和0.1 M乙酸钠（CH₃COONa）条件下生长的溶菌酶晶体3COONa) pH 4.0（A）以及在 1 M NaCl、0.1 M CH3COONa pH 4.5，含30%聚乙二醇（PEG）400（B）。冻干溶菌酶粉末溶于水，终浓度约为 30 mg mL-1 或在 20 mM CH3COONa pH 4.2 缓冲液至终浓度约 20 mg/mL-1 对于图示实验中的 图4A 和 4B分别为。两个实验中蛋白质样品的体积均约为 0.3 µL 微芯片中嵌入的再生纤维素透析膜的截留分子量（MWCO）范围为6-8 kDa。图中所示的溶菌酶晶体 图3A 1 小时内生长，且晶体在 图3B 在实验开始后的30分钟内生长。结晶实验在静态条件下进行。然而，已有研究表明19 在流动条件下进行实验可实现结晶条件的动态交换，并用于研究相图，从而验证微透析方法的可逆性。

原位 溶菌酶晶体的X射线衍射数据如图所示 图 4A 用于证明透析芯片在该类实验中的适用性。数据收集在ESRF的BM30A-FIP光束线于室温下进行，具体步骤如方案7.2.1所述。微芯片借助3D打印支撑架安装至光束线上图3B）并从芯片上生长的两个溶菌酶单晶收集了完整的X射线衍射数据集，晶体生长条件见第二行所示 表1使用 XDS 对数据集的观测反射进行处理、指数化和积分48 使用 Phaser 完成分子置换和结构精修49 和 Phenix52，分别。每种溶菌酶晶体完整数据集的晶体学统计信息以及两套数据合并后的统计信息见于 表2对于分子置换，使用了 PDB 数据库中的 193L 条目。

分别从单个溶菌酶晶体和两个晶体合并数据集获得的电子密度图分辨率分别为1.95 Å和1.85 Å，如图所示。 图5A 和5B两种电子密度图均展示了可获得的详细结构信息 原位 在室温下直接对透析微芯片中的单个晶体或多个晶体进行X射线衍射实验，使芯片适用于 原位 X射线晶体学研究

微流控器件制备；SU-8上的PDMS模具，紫外光曝光；透析芯片组装示意图。
图1：透析芯片制备的示意图。（A）将SU-8树脂涂覆于两片硅片上，并进行旋涂。（B）通过光掩模对光刻胶进行紫外光照射，并显影未曝光区域，从而获得SU-8母模。（C）将PDMS滴加至SU-8母模上，并在338 K条件下固化1小时，（D）通过复制成型和微结构转印所制得的两块PDMS模具从母模上剥离，（E）并裁剪至合适尺寸。（F）将PDMS模具固定在载玻片上，透析膜（再生纤维素，RC）置于两个中心支柱之间。（G）随后将两块PDMS模具对准，并在真空腔中干燥约30分钟。（H）将NOA 81树脂注入两模具之间，（I）依靠毛细作用充满间隙。（J）首次紫外光照射后，移除底部PDMS模具，并将组件置于PMMA片上。（K）进行第二次紫外光照射，使NOA 81树脂完全聚合，随后移除剩余的上层PDMS模具，透析芯片即可使用。（L）透析芯片的侧视示意图，标明了器件各层及其相应厚度。请点击此处查看该图的放大版本。

用于蛋白质分析的微流控装置示意图，包含连接器和透析膜设置。
图2：用于芯片上蛋白质结晶的嵌入RC透析膜的透析芯片及 原位 X射线衍射实验 (ANOA 81 微芯片上 175 µm 带有蛋白质储存区的厚型PMMA基板 0.1 µL （左）和 0.3 µL （右）标称体积。B) 在微流控通道的入口和出口端口上粘接移液管尖端作为流体连接器的微芯片。C) 蛋白质结晶实验过程中微芯片的照片。蛋白质样品被一段 175 µm 厚的PMMA板和聚酰亚胺胶带。Peek Nanoport接头用于流体通道的入口和出口。D) 蛋白质储存室的俯视图，显示结晶溶液在流体通道内循环时的情况。空气滞留在储存室上部、RC透析膜正下方，可清晰观察到。E) 光学显微镜下观察透析储液池的俯视图，显示蛋白质样品沉积过程。蛋白质液滴沉积于嵌入式RC透析膜正上方。 请点击此处以查看此图的放大版本。

透析芯片实验中的静态平衡；示意图显示X射线散射分析结果。
图33D打印支架 (A用于结晶实验的微芯片以及（B安装在欧洲同步辐射装置（ESRF）BM30A-FIP光束线X射线束前方的 原位 X射线衍射实验。C) 背景噪声由X射线与聚酰亚胺（Kapton）、RC透析膜、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）及透析芯片（从左至右）相互作用产生。 请点击此处以查看此图的放大版本。

种子发育阶段的显微镜图像；左侧为具有细胞分化的胚胎，右侧为种皮。
图4：采用微透析法在芯片上进行溶菌酶结晶。 （A）在1.5 M NaCl和0.1 M CH3COONa（pH 4.0）条件下，在芯片上生长的溶菌酶（~30 mg mL-1）晶体；（B）在含有1 M NaCl、0.1 M CH3COONa（pH 4.5）和30% PEG 400的结晶条件下生长的溶菌酶（~20 mg mL-1）晶体。两个实验均在293 K下进行。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质结构分析、电子密度图、分子构象比较、晶体学。
图 5：通过透析微芯片上生长的单晶（A）和两颗晶体合并数据集（B）解析的溶菌酶结构的电子密度图。 电子密度图的分辨率分别为 1.95 Å 和 1.84 Å，等高线水平设为 1σ。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质蛋白质浓度
(mg/mL-1)		蛋白缓冲液初始浓度
沉淀剂溶液		RC的截留分子量
透析膜
（kDa）		温度
(K)
溶菌酶~ 30水1.5 M NaCl
0.1 M CH3COONa pH 4.0		6 - 8293
溶菌酶~ 2020 mM CH3COONa pH 4.21 M NaCl
0.1 M CH3COONa pH 4.5
30% PEG 400		6 - 8293

表1：采用微透析法在芯片上进行溶菌酶结晶的蛋白质缓冲液与沉淀剂溶液的组成。 使用芯片上生长且采用第二行条件制备的溶菌酶晶体进行后续实验 原位 X射线衍射数据收集

蛋白质溶菌酶溶菌酶溶菌酶
晶体数量112
衍射图像帧数403070
每次曝光的振荡角度（°）11
曝光时间（s）3030
温度（K）293293293
空间群P43212P43212P43212
晶胞参数78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
分辨率范围（Å）27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
镶嵌度（°）0.3190.121
总衍射点数（观测）25127 (3552)19991 (3001)
唯一衍射点数（观测）8641 (1357)8295 (1321)10404 (975)
冗余度2.90 (2.61)2.41 (2.27)
数据完整性（%）95.0 (94.8)91.9 (93.3)98.23 (93.15)
平均 I/σ6.83 (1.16)7.09 (1.66)3.7
CC(1/2)99.1 (42.4)97.9 (37.0)97.0
R-merge0.184
R-meas0.1390.2210.219
R-pim0.116
用于精修的衍射点数8645 (787)8451 (857)10391 (965)
用于 R-free 的衍射点数864 (78)846 (85)1039 (96)
R-工作0.1988 (0.2968)0.1853 (0.2872)0.1839 (0.3102)
R-自由0.2430 (0.3437)0.2297 (0.3622)0.2207 (0.3703)
非氢原子数量106910711096
大分子101210121012
水分子555782
配体222
蛋白质残基数131131131
键长均方根偏差（Å）0.0080.0090.005
键角均方根偏差（°）1.171.261.05
Ramachandran 图 favored 区域（%）98.4397.6499.21
Ramachandran 图 allowed 区域（%）1.572.360.79
Ramachandran 图离群点（%）0.000.000.00
平均 B 因子34.2628.5424.34
蛋白质33.9428.1423.62
水分子40.2335.5733.16
配体33.2329.6324.77

表2：通过芯片上微透析法生长的溶菌酶晶体的数据收集参数、晶体学及精修统计结果。 括号中的数值对应于最高分辨率壳层。第四列对应于第二列和第三列数据集合并后所得的数值。

讨论

一种用于芯片上蛋白质结晶的微流控装置已通过微透析方法开发出来 原位 室温下的X射线衍射实验。可通过制造集成任意截留分子量的RC透析膜的NOA 81芯片，实现基于微透析的片上蛋白质结晶。所用制造材料具有较高的X射线通透性，使芯片适用于 原位 蛋白质晶体学。对该装置用于蛋白质结晶的腔室所用的制备材料（PMMA、Kapton、RC透析膜）进行了评估，以产生低背景噪声。具体而言，透析芯片产生的背景噪声主要出现在低分辨率区域> 6 Å），且不影响用于蛋白质结构测定的大尺寸溶菌酶晶体的高分辨率衍射数据处理。通过使用一种3D打印的支架，可将该支架直接安装在大分子晶体学光束线上，并同时承载最多三个微芯片，从而进一步提高了数据采集的自动化程度。该方法避免了对脆弱的蛋白质晶体进行人工挑取和操作。此外，数据采集在室温下进行，无需使用冷冻保护剂，从而避免了因冷冻保护可能引起的蛋白质天然结构的构象变化。2,3.

采用微透析法在芯片上生长晶体，可精确监测和控制结晶过程。正如引言中所述，大多数传统的蛋白质结晶方法均已通过微流控装置得以实现。11,14然而，透析在微尺度蛋白质结晶中的优势尚未得到充分开发。芯片上的微透析为研究相图以及利用同一样品进行结晶条件的筛选与优化提供了可能19对于本文所展示的原型，每枚芯片的蛋白质消耗量可低至0.1或0.3 µL。根据目前的实验结果，该方案中最关键的步骤并非来自芯片的制备过程，而是蛋白质在芯片上的结晶过程。尽管芯片制备流程包含多个步骤，但其操作简便，且可在洁净室环境中使用相对廉价的材料，于一天内完成20至30枚芯片的批量制备。然而，由于成核与晶体生长本身具有内在的随机性，尤其是在微尺度条件下，蛋白质在芯片上的结晶可能是一项较为精细的操作。本文描述了一个案例研究，其中采用已确立的成熟条件对溶菌酶进行结晶，获得了结构完整、形态清晰且适用于后续分析的晶体 原位 X射线衍射数据收集。然而，在使用更具挑战性的蛋白质靶标（如膜蛋白）时可能会遇到困难，因为此类蛋白的结晶介质更为复杂，相图尚未明确，且有效的结晶条件仍未充分建立。透析芯片提供了一种克服这些困难的途径，可在芯片上研究相图，而无需消耗珍贵且通常成本较高的蛋白质样品，仅需在微流控通道内更换结晶溶液即可。

微流控装置的多功能性源于利用微透析在芯片上实现蛋白质结晶，从而可逆地控制结晶条件，并使用少量蛋白质样品绘制随浓度和温度变化的相图。此外，该装置与 原位 X射线衍射实验及器件原型的制备成本低廉且快速。可在芯片上生长大量可溶性蛋白质及膜蛋白（准备中）的同晶型晶体，预计这些特性可被用于在同步辐射和X射线自由电子激光设施上对具有挑战性的蛋白质靶标开展序列X射线晶体学研究。最后，可在芯片上进行 原位 时间分辨研究是未来可能实现的方向，对晶体学领域具有重要意义。因此，通过在透析芯片上生长晶体，并通过手动（使用注射器）或自动（使用压力控制流体系统或注射泵）方式将试剂引入微流控通道，未来的研究工作将致力于验证微流控芯片能否成功用于在同步辐射光束线上触发时间分辨实验。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

MBS 感谢法国国家科学研究中心（CNRS）在“极限仪器”项目（2014-2015）合同下提供的支持。NJ 感谢法国原子能和替代能源委员会（CEA）国际博士研究计划（Irtelis）提供的博士奖学金。MBS 和 SJ 感谢欧盟“地平线2020”研究与创新计划通过玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议编号 722687 提供的资金支持。MBS、SJ 和 NJ 感谢格勒诺布尔阿尔卑斯大学（UGA）物理研究所（LIPhy）为微加工实验提供的洁净室设施。IBS 感谢被纳入格勒诺布尔跨学科研究机构（IRIG，CEA）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3 英寸晶圆Silicon Materials Inc.硅材料晶圆
离心机EppendorfMinispin台式离心机
CleWin 3.0WieWeb software设计软件
环氧胶Devcon5 分钟快干环氧胶
流体连接件Cluzeao Info LabN-333NanoPort 套件，适用于 1/16" 外径管路
鸡蛋清溶菌酶Roche10 837 059 001冻干蛋白粉末
高真空硅脂Sigma-AldrichZ273554Dow Corning 高真空硅脂
HMDSSigma-Aldrich440191硅烷，化学试剂
加热板SawatecHP-200-Z-HMDS BM加热板
异丙醇Sigma-Aldrich溶剂
聚酰亚胺胶带DuPont聚酰亚胺胶带（Kapton 胶带）
掩模对准器SUSS MicroTecMJB4掩模对准器，紫外光源
膜过滤器MilliporeGSWP047000.22 μm 孔径过滤器
显微镜载玻片Fisher Scientific121646823 × 1 英寸玻璃载片
NOA81Norland Products Inc. NOA81光固化树脂
烘箱Memmert烘箱
Parafilm 封口膜Sigma-AldrichP6543Parafilm M 卷膜，20 英寸 × 50 英尺
PDMSDow CorningSylgard 184硅橡胶
PEG 400Hampton ResearchHR2-603化学试剂
培养皿Sigma-AldrichP5731100 × 15 mm
PGMEASigma-Aldrich484431显影剂
等离子体处理设备Diener ElectronicZEPTO等离子体处理系统
PMMAGoodfellow137-745-63PMMA 薄板，150×150 mm，厚度 0.175 mm
压力驱动系统ElveflowOB1 MK3+压力/真空控制器
PTFE 管路Elveflow/Darwin microfluidicsLVF-KTU-15PTFE 管卷，1/16" 外径 × 1/32" 内径
RC 透析膜Spectra/Por多种截留分子量（MWCO）可选
手术刀Swann-Morton碳钢外科刀片
乙酸钠Sigma-AldrichS2889化学试剂
氯化钠Sigma-Aldrich746398化学试剂
SolidworksDassault Systemes三维计算机辅助设计（3D-CAD）设计软件
旋涂仪SPSSpin150晶圆旋涂机
SU-8 3000 系列MicroChem Corp.SU-8 3050光刻胶
注射器BD3096281 mL 鲁尔锁式注射器
紫外交联仪UvitecCL-508紫外交联仪

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