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活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

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DOI：

10.3791/61671

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2020年12月4日

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1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

本文内容

摘要

本方法涉及在允许活细胞共聚焦显微镜观察的同时，对嵌入硅橡胶中的三维软水凝胶进行单轴拉伸。文中展示了对外部和内部水凝胶应变以及纤维取向的表征。所开发的装置与实验方案可用于评估细胞对不同应变条件的响应。

摘要

外部力是组织形成、发育和维持的重要因素。这些力的作用通常通过特制的体外拉伸方法进行研究。现有的各种系统采用基于二维基底的拉伸装置，而可用于对软性水凝胶施加应变的三维技术则相对受限。本文介绍一种方法，可通过弹性硅胶条作为样品载体，从软性水凝胶的周边对其进行外部拉伸。本方案所使用的拉伸系统由3D打印部件和低成本电子元件构成，结构简单，易于在其他实验室中复制。实验过程首先是在硅胶条中央的切口处聚合较厚（>100 μm）且柔软的纤维蛋白水凝胶（弹性模量约为100 Pa）。随后将硅胶-凝胶复合物固定于打印的拉伸装置上，并置于共聚焦显微镜载物台上。在活体显微成像过程中启动拉伸装置，对不同拉伸程度下的凝胶进行成像。通过图像处理量化凝胶的形变结果，显示在整个凝胶的三维厚度（Z-轴）方向上应变分布相对均匀，并伴有纤维的取向排列。该方法的优点包括能够在三维条件下对极软的水凝胶施加应变，同时实现原位显微观察，并可根据用户需求自由调节样品的几何形状和尺寸。此外，经过适当调整后，该方法还可用于拉伸其他类型的水凝胶（如胶原蛋白、聚丙烯酰胺或聚乙二醇），并可在更接近生物模拟的三维环境中分析细胞和组织对外部力的响应。

引言

组织对机械力的响应是多种生物功能的重要组成部分，包括基因表达1、细胞分化2以及组织重塑3。此外，细胞外基质（ECM）在受力作用下发生的改变（如纤维排列和致密化）也会影响细胞行为和组织形成4,5,6。ECM的纤维网状结构具有独特的力学特性，例如非线性弹性、非仿射变形以及塑性变形7,8,9,10,11,12。这些特性影响着细胞及其周围微环境对外部机械力的响应方式13,14。深入理解ECM和组织对机械力的响应机制，将有助于推动组织工程领域的发展，并促进构建更精确的计算模型和理论模型。

目前最常见的机械拉伸样品方法主要集中在含细胞的二维基底上，以研究其对细胞行为的影响。例如，对聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底施加应变，并分析细胞相对于拉伸方向的重新取向角度15,16,17,18,19。然而，针对更接近组织微环境的三维细胞包埋水凝胶在外部拉伸下的响应研究方法则较为有限。开发三维拉伸技术具有重要意义，因为细胞在二维基底上的行为与在三维基质中存在差异20，这些差异包括细胞的重新排列、蛋白表达水平以及迁移模式21,22,23。

可用于实现三维样品拉伸的方法和装置既包括商业化的设备24,25,26,27,28，也包括为实验室研究开发的装置29。这些方法使用可延展的硅胶管30、多孔培养室31、夹具26,32、生物反应器11,33、悬臂梁34,35,36以及磁体37,38。某些技术可产生局部变形三维水凝胶的拉伸，例如通过从凝胶内部两个单点处牵拉针头实现5，而其他技术则允许对整个凝胶本体进行变形16。此外，大多数此类系统专注于分析X-Y平面内的应变场，而对于Z方向的应变场信息则较为有限。另外，仅有少数装置能够实现显微原位成像。原位高倍成像（例如共聚焦显微镜）的主要挑战在于物镜与样品之间的工作距离有限，通常仅为几百微米。那些允许在拉伸过程中进行活体成像的装置，往往牺牲了Z轴方向上应变的均匀性，或者结构相对复杂，难以在其他实验室中复制39,40。

这种拉伸3D水凝胶的方法可在活细胞共聚焦显微镜观察期间施加静态或周期性的单轴应变。该拉伸装置（称为“智能周期性单轴拉伸器——SCyUS”）由3D打印部件和低成本硬件构成，便于其他实验室轻松复制。装置上附有一块市售的硅橡胶，其中心具有特定几何形状的切口。水凝胶组分在该切口内聚合填充。在聚合过程中，生物水凝胶（如纤维蛋白或胶原蛋白）会自然黏附于切口的内壁。通过使用SCyUS，可对硅胶条进行单轴拉伸，从而将可控的应变传递至嵌入的3D水凝胶41。

与现有其他方法相比，该系统具有一系列独特的功能和优势。首先，该系统能够从周边对较厚的三维软水凝胶（>100 µm 厚，<1 kPa 刚度）进行单轴拉伸，且在整个水凝胶中实现 Z 方向均匀的形变。这类水凝胶过于柔软，无法通过传统拉伸技术夹持并拉伸。其次，由于3D打印技术在科研人员中已广泛可及，且设计中所用电子元件成本低廉，拉伸装置可被其他实验室轻松复制。第三，或许也是最具吸引力的特点是，硅胶条上切口的几何形状和尺寸可方便地调节，从而实现可调的应变梯度和边界条件，并可使用多种样品体积，最低可达几微升。

本方案包括在0.5 mm厚的硅橡胶条上制备直径约2 mm的纤维蛋白凝胶圆片，并在活细胞共聚焦显微镜下进行单轴拉伸。下文详细讨论了测量和分析作用于几何切口处的应变、水凝胶内部产生的应变，以及在不同拉伸操作后纤维排列情况的实验步骤。最后，探讨了在水凝胶中包埋细胞并对其施加可控外部拉伸的可能性。

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方案

1. 溶液配制（需提前进行）

  1. 纤维蛋白原标记
    注意：仅当需要分析纤维蛋白凝胶变形时，才需进行标记步骤。对于细胞实验，可以使用未标记的凝胶。
    1. 添加 38 μL 将 10 mg/mL 琥珀酰亚胺酯荧光染料（溶于 DMSO）1.5 mL 加入 15 mg/mL 纤维蛋白原溶液 1.5 mL（摩尔比 5:1）中，置于 50 mL 离心管内，室温下振荡反应 1 小时。随后将离心管放入离心机，以 800 × g 离心 3 分钟 g （室温）
    2. 将上一步的上清液通过装有葡聚糖凝胶树脂的脱盐柱进行过滤（材料清单以分离未反应的染料，42 通过执行以下步骤。
      1. 用 25 mL 纤维蛋白原缓冲液预洗涤层析柱。
      2. 缓慢将步骤1.1.1中标记的纤维蛋白原注入层析柱中，确保无气泡进入滤膜。弃去最初约0.3 mL的洗脱液（4–6滴淡色液体），随后收集接下来的1.0–1.5 mL纯化溶液（更详细的说明请参照试剂盒说明书）。
      3. 使用注射器式滤器（0.22 μm）对所得的纯化溶液进行过滤除菌，完成过滤过程。0.45 μm).
      4. 用20 mL纤维蛋白原缓冲液清洗柱子以进行清洁和回收，然后将其保存在25 mL的20%乙醇中。
  2. 洗脱后，将所得纯化的标记纤维蛋白原分装为每份约7-50 μL，根据所需拉伸凝胶的数量而定。对于每个拉伸后直径为 2 mm 的圆形凝胶，准备约 3.5 μL 纤维蛋白原（2.5 μL 每块凝胶使用量 + 1 μL 以避免移液误差。
    1. 将分装样品储存于 -20 °C 冷冻保存。样品可保存约一年（不建议反复冻融）。
    2. 在本方案的其余步骤中，保持约 7 μL 纯化标记的纤维蛋白原置于冰箱中（4 °C）直至第4步。此体积用于制备两块拉伸凝胶（2.5 μL 每块凝胶所需体积，以及额外的体积 1 μL 用于校正样品制备过程中的误差。
      注意：该过滤步骤通常会将初始浓度为 15 mg/mL 的纤维蛋白原溶液稀释至终浓度约为 10 mg/mL。稀释倍数取决于纤维蛋白原的初始体积和浓度，具体参数详见制造商说明书。
  3. 准备 7 μL 凝血酶溶液（使用凝血酶缓冲液稀释至 2 单位/毫升， 材料清单）并置于冰箱中保存（4 °C) 直至第4步。此体积旨在填充两块拉伸凝胶的切口部分。
    注意：为了进行内部应变分析， 1 µm 直径荧光球形微珠（以水溶液形式购买，含2%固体成分及2 mM NaN3) 应加入凝血酶溶液中（建议使用 40 倍物镜时，微珠与凝血酶的体积比为 1:25 v/v %）。仅在需要测量内部应变时才应加入微珠，无论是否存在细胞。

2. 硅胶条制备

  1. 取出0.5 mm厚的硅橡胶，将其切割成15 × 80 mm2的条状，条中央打一个直径为2 mm的孔（图1）。如有可能，使用可编程激光切割机以实现高精度切割。若无此类设备，使用剪刀裁剪条状轮廓，再用小型打孔器在中央打孔即可满足要求。
    注意：商用硅橡胶通常两面均覆有塑料保护膜。如条件允许，请保留硅橡胶两面的原始塑料覆盖层。若重复使用先前实验中的硅橡胶条，请先用胰蛋白酶处理0.5小时，再用0.2 M NaOH浸泡0.5小时，随后用70%乙醇浸泡1小时，最后晾干后方可使用。
  2. 准备尺寸至少为20 × 30 mm2的密封膜（疏水性）层，使其宽度大于硅橡胶条，从而确保密封膜能够完全覆盖几何切口区域，形成有效密封。
  3. 用70%乙醇清洗一个10 cm培养皿，然后使用无尘擦拭纸擦拭并干燥（适用于无菌和非无菌实验）。此步骤至关重要，因其有助于密封膜层更好地粘附于培养皿表面，并在制备过程中限制样品移动。
  4. 将密封膜层放置于已清洗的10 cm培养皿中，确保有足够的空间可将两条硅橡胶条并排置于同一培养皿内（图2A）。
    1. 撕去硅橡胶条一侧的塑料保护膜，将暴露面朝下贴附于密封膜层上，使切口区域完全被密封膜层包围（图2B）。然后用洁净的手套手指轻轻按压硅橡胶与密封膜接触的区域，使切口周围实现密封。
      注意：确保硅橡胶与密封膜之间无气泡，尤其是在切口周围区域。可通过观察培养皿底部来确认（图2C）。

凝胶变形测试装置；显示弹性体样品应力分布的示意图。
图1：水凝胶拉伸方法。（A）尺寸为15 × 80 mm2的硅胶条，其中心位置设有直径为2 mm的圆形切口；（B）带有圆形切口并嵌入纤维蛋白凝胶的硅胶条。为便于说明，图中硅胶上的切口比实际实验中更大；（C）拉伸方法的示意图，包括硅胶条（橙色）、圆形凝胶（位于中央切口处）以及将硅胶连接至拉伸装置的织物延伸器（绿色）。放大区域显示了凝胶在硅胶单轴拉伸作用下的形变情况。为简化图示，未展示凝胶厚度方向（Z轴）上的压缩变形。图1B和1C经Roitblat Riba等41改编。请点击此处查看该图的放大版本。

静态平衡实验；培养皿装置，带有胶带固定的表面，显示气泡形成。
图2：凝胶聚合前将硅胶条正确放置在密封膜层上的示例。（A）在10 cm 培养皿中放置两层密封膜；（B）将硅胶条放置在密封膜层上；（C）培养皿底部视图，显示硅胶与密封膜层之间形成的气密密封。左侧：密封膜层与硅胶条在切口周围形成无气泡的正确密封。右侧：密封膜层与硅胶条切口之间存在边缘气泡的错误密封，这将导致水凝胶组分渗漏至硅胶下方。红色箭头指向形成气泡的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 使用细胞制备凝血酶

注意：仅当需要将细胞包埋于水凝胶中时才执行此步骤，且须在生物安全柜内无菌条件下进行（材料表）。

  1. 灭菌：细胞实验前一天，将硅胶条放入 & 将密封膜层置于70%乙醇中过夜，然后在每侧进行30分钟的紫外线灭菌（如果10 cm培养皿尚未无菌，则在70%乙醇清洗后也应于紫外线下每侧照射30分钟进行灭菌）。本方案中使用的紫外系统为生物安全柜内置的紫外灯。
    注：也可采用高压灭菌循环（140 °C）可以在硅胶条上进行，因为硅胶条可耐受高达 260 °C.
  2. 进行细胞计数以确定细胞浓度，然后离心并用培养基重悬细胞沉淀 7 μL 凝血酶（2 units/mL）置于1.5 mL离心管中。建议细胞浓度为800个细胞/μLμL 凝血酶。将细胞保持在低温状态直至使用（不超过半小时，以避免损伤细胞）。

4. 纤维蛋白凝胶的聚合

  1. 从冰箱中取出2 Unit/mL凝血酶和10 mg/mL标记纤维蛋白原溶液（已在步骤1中配制），置于冰上备用。
    注意：在混合前将溶液保持低温，以减缓聚合反应动力学，从而实现蛋白质更均匀的混合。
  2. 准备好培养皿（步骤2）后，吸取2.5 μL标记纤维蛋白原溶液，均匀加入硅胶模具的切口内（切口底部附有封膜层），使切口整个周长均与纤维蛋白原接触。操作时需避免溶液中产生气泡或空气间隙，特别注意切口底部边缘（即封膜层与硅胶的界面处）。
  3. 立即吸取2.5 μL凝血酶溶液（可含或不含细胞/微珠），直接加入切口内的纤维蛋白原溶液中（最终纤维蛋白总体积为5 μL）。随后迅速用移液器轻柔地上下吹打约10次，充分混匀两种溶液。混合过程中应移动枪头覆盖整个体积，以获得尽可能均一的混合液。
  4. 沿每皿边缘加入少量磷酸盐缓冲液（PBS）[细胞实验可选用细胞培养基，参见材料表]，防止水凝胶在聚合过程中干燥。注意确保PBS/细胞培养基不与样品直接接触，以免损伤样品。
  5. 盖上皿盖，将培养皿置于37 °C培养箱中孵育30分钟。
    注意：所需孵育时间取决于凝胶体积。若使用更大体积，应相应延长孵育时间。
  6. 从培养箱中取出培养皿，向皿内加入PBS/细胞培养基，完全浸没凝胶-硅胶复合结构。
  7. 逐个小心地将样品结构从皿中提起，确保封膜层仍牢固附着于条带上。从硅胶一端开始，轻柔地逐步剥离封膜层至另一端（图3）。避免在靠近切口区域施力，以防应力集中（此点对非圆形几何结构尤为重要）。切勿触碰切口区域，以免损坏样品。
  8. 将条带重新放回含有PBS/细胞培养基的培养皿中，使其漂浮于液体中。随后将培养皿转移至标准细胞培养显微镜下，定性评估各样品状态。凝胶应均匀、在整个切口内连续完整，且无气泡存在。参照图4选择质量最佳的样品用于后续分析。

使用红色条带和塑料标注的静力学平衡装置，用于演示物理学概念。
图3：从硅胶条底部正确移除密封膜层的方法。移除过程应缓慢进行，以防止水凝胶撕裂或与切口内壁脱粘。白色箭头指示移除方向。 请点击此处查看该图的放大版本。

硅胶聚集结构、气泡、撕裂的显微镜图像；材料分析。
图4：硅胶切口内纤维蛋白凝胶的显微观察。（A）两种正确聚合的纤维蛋白凝胶示例。注意凝胶的相对均一性及其与切口边缘的完全贴附。（B）两种样品聚合失败的示例。上图：注意大量气泡以及左下侧形成的聚集体。下图：注意凝胶从切口边缘撕裂，以及切口左下区域的聚集体。比例尺 = 300 μm 请点击此处查看此图的放大版本。

5. 在 SCyUS 装置上加样

  1. 用 PBS/细胞培养基填充浴槽（图5），并将承载样品凝胶的硅胶条横跨放置在浴槽顶部，使两端分别置于浴槽两侧。该浴槽用于防止凝胶干燥。安装并拧紧夹具（紫色）以及织物条（绿色），使所有部件连接成一条直线，且中央留有切口（图5）。
  2. 取出 SCyUS 装置，安装铝制液体槽和 22 mm × 40 mm 的矩形玻璃盖玻片（No. 1 或 1.5）（图6Aiii）。使用密封材料（例如真空脂）将盖玻片固定在槽的底部，以确保槽内液体不会泄漏。
    1. 向槽内加入约 1–2 mL 的 PBS/细胞培养基，然后将条带 + 织物 + 凝胶组件（图6B）放入装置中。将织物条（2）夹入支架（1），使中央的切口 + 凝胶（5）处于中心位置，如图所示；然后小心地将压紧插入件（4）放入装置中并锁定到位。
    2. 接着，将另一侧的织物插入转轴（暂不连接伺服电机），并将其锁定在转轴中（图6C）。
  3. 将装有样品的 SCyUS 装置插入显微镜载物台（图6C）。通过 USB 线缆将微控制器（材料表）连接至计算机，并将伺服电机连接至微控制器。在计算机上打开 SCyUS 控制模块。此时样品已准备就绪，可在共聚焦显微镜下成像，以检查凝胶厚度及纤维均匀性是否合适。

静态平衡示意图，PBS浴槽装置展示用于生化分析的液体流动。
图5：（A）包含PBS浴槽的夹具（3D打印）（B）在夹具上放置凝胶条的位置，以确保支架（紫色）正确对齐连接，并防止凝胶干燥。本图经Roitblat Riba等41许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

微流控装置设置示意图及带伺服主轴的光学分析实验。
图6：SCyUS拉伸装置。（A）SCyUS主要部件的CAD模型的多个视图：连接至伺服电机的主轴（蓝色）、静态锚定件（红色）、用于压紧硅胶条的插件（紫色），以及防止插件上移的固定件（黄绿色）。系统顶视图（Ai）、系统剖面图（Aii），其中显示了条带的路径（橙色线），以及带玻璃盖玻片的铝制液体槽底视图（Aiii）。通过旋转装入主螺纹的螺丝，可上下移动液体槽。铝制液体槽的向上运动受紫色插件的侧翼限制，如白色箭头所示。（B）实际系统：（1）静态锚定件（2）绿色不可拉伸织物（3）用于控制铝制液体槽高度的螺丝（4）红色压紧插件（5）带圆形切口的硅胶条（6）蓝色连接夹具（C）放置在共聚焦显微镜上的拉伸系统。伺服电机和主轴由箭头标示。本图经Roitblat Riba等人许可修改。 41 请点击此处查看此图的放大版本。

6. 确保凝胶量足够用于取样

  1. 使用共聚焦显微镜（材料表），利用488/543/561 nm激光对整个凝胶进行低倍率（10×）、低分辨率（约1.4 μm × 1.4 μm像素尺寸）的共聚焦Z轴层扫（≤10层Z切片，步进约10 μm即可）拼图成像，以检查凝胶在整个硅胶厚度方向上几何切口边缘的均匀性及粘附情况（图7A-B）。将此Z轴层扫图像作为后续步骤的定位参考图。
  2. 通过低分辨率活体成像扫描凝胶，确定凝胶在切口内壁完全粘附且无撕裂或气泡时的最低Z位置，并记录显微镜的Z坐标（Zl）。为判断凝胶在整个圆周方向上是否完全粘附于硅胶，可在显微镜下观察凝胶荧光标记与硅胶条（暗背景）之间的界面（图7C）。
  3. 沿Z方向向上移动，直至凝胶连续性消失，记录此时的Z位置（Zu）：
  4. 将Z方向的上限（Zu）减去下限（Zl），得到样品的参考厚度（Zo）：
    静水平衡方程，Z_o=Z_u-Z_l，公式表示。
    若Zo ≥ 100 μm，则认为该凝胶满足分析要求。需注意，硅胶切口的厚度约为500 μm，但凝胶在切口内的聚合通常会导致实际凝胶厚度更小。推荐最小厚度为100 μm，以确保拉伸过程稳定，避免凝胶撕裂或从硅胶切口脱离。
    注意：在不同的XY位置，凝胶厚度可能有所不同。本部分方案测量的是凝胶的最小厚度，从而评估凝胶质量，并判断其是否足以进行拉伸。此外，确定凝胶中心位置可为拉伸后（无论是静态还是动态拉伸）返回原位提供参考点。

胚胎细胞发育示意图，显微镜图像显示细胞分布模式。
图7：凝胶均一性。 使用共聚焦显微镜软件（材料表）采集并拼接 tile 图像。（A）纤维蛋白凝胶样品的一个拼接 tile Z 切片图像，由于聚合前凝血酶与纤维蛋白原混合不充分，导致纤维密度相对不均。该凝胶无法提供可靠的分析结果。（B）纤维蛋白凝胶样品的一个拼接 tile Z 切片图像，纤维密度相对均一。此凝胶适用于拉伸实验。图像 A 和 B 的比例尺为 200 μm。（C）荧光标记凝胶（红色）与硅胶（黑色背景）界面的放大图。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看该图的高清版本。

7. SCyUS 操作、拉伸与成像

  1. 在确认样品质量合格并已正确安装于SCyUS装置上后，确定样品的预拉伸位置。此步骤通过共聚焦显微镜下的实时成像完成（类似于步骤6.2）。
    1. 通过点击Go To Zero Servo Pos按钮，确保伺服电机处于零位（点击图8A，并确认图8B显示为零），然后如图6C所示将装置连接至拉伸设备。
      注意：执行此步骤时应缓慢且小心，避免对样品施加额外张力。
    2. 在对样品进行成像的同时，通过点击+1按钮，每次顺时针方向移动电机一度（图8C），直至观察到切口右侧开始移动。随后，通过点击-1按钮将运动反向（图8D），返回至倒数第二步的位置。此操作可确认样品处于最小张力状态。点击Set Min Servo Position按钮（图8E）以设定参考位置。此后可随时通过点击Go To Min Servo Position按钮（图8F）返回该参考位置。
      注意：建议在本步骤中使用高倍物镜（≥40×），以减小误差。
    3. 采集整个凝胶区域的高倍率（40×）、高分辨率（约0.2 μm × 0.2 μm 像素尺寸）单Z平面拼接图像。该图像将作为后续处理分析的参考图像。建议采集位于凝胶厚度中间位置的单个Z平面图像（通过使用公式1中的Zo），以便在拉伸后能大致返回相同的Z位置。同时请注意，采集整个凝胶区域的高分辨率拼接图像需要较长时间（约20–30分钟）。
    4. 此时样品已准备好进行静态拉伸。在图形用户界面（GUI）中，每次前进一度（图8C），逐步将伺服电机调节至目标拉伸幅度（操作应缓慢，约1度/秒）。
  2. 在每个需要分析的拉伸幅度下，采集整个凝胶区域的单Z平面高分辨率拼接图像，用于后续处理分析。类似于步骤6.2，通过扫描凝胶（红色）与硅胶（深色背景）之间的界面，检查与前一拉伸幅度相比是否存在粘附变化，以确认凝胶在整个圆周方向上未从硅胶上脱落。
    注意：在电机激活过程中，应使用实时成像（采用低分辨率、低倍率设置）跟踪凝胶在X-Y方向的位置。由于凝胶会经历Z方向的泊松效应，其底部会上升，因此应在每个拉伸幅度下，将显微镜的Z位置调整至凝胶厚度的大致中心。这可通过针对每个拉伸幅度重新计算Zo（公式1）实现。由于Z方向的拉伸相对均匀，无需精确确定凝胶的中心深度。

伺服电机控制界面，包含位置调节、循环选项和复位功能布局。
图8：SCyUS控制模块的图形用户界面（GUI）。（A）电机的位置（以度为单位），取值范围为-90°至90°；（B）“设定伺服最小位置”按钮，用于预设最小位置，以设置一个不同于零位的新参考位置；（C）“加1°”按钮，使伺服电机顺时针移动1°；（D）“减1°”按钮，使伺服电机逆时针移动1°；（E）“回到零位”按钮，将伺服电机位置设为0°（[A]将显示为零）；（F）“转至最小伺服位置”按钮，使伺服电机移动至用户自定义的“最小”位置。请点击此处查看此图的放大版本。

8. 外部应变测量的后处理

  1. 为测量切口边界的有效应变，需在拉伸方向（X轴）上测量 Y 轴中心位置的边缘到边缘长度（图9A）。
    1. 将拉伸前的图像上传至图像处理软件（ImageJ FIJI43），测量中心位置最大边缘到边缘的距离，该距离定义为孔的轴向长度（静力平衡图解，ΣFx=0，力平衡，物理学概念教学资源。）。
    2. 将从顶部到底部的最大距离定义为垂直距离（静力平衡方程 ΣFx=0 图示；展示力平衡、受力分析、矢量分解。）。
    3. 对所有拉伸间隔图像重复此过程，并计算切口外围的轴向（色谱法；方程：Rt=Vm+KVs；图示；气相色谱系统；化学分离。）和垂直（静力平衡图解，ΣFx=0，通过矢量和平衡分析说明力平衡。）距离（图9A，底部），然后进行以下计算以确定切口边缘的应变：

静态平衡分析中的应变方程 εxx；变形分析公式。

应变计算公式，εyy(孔)=(d-do)/do，用于材料变形分析。

用于材料研究的应变分析示意图，包含形变、显微图像及应力-应变曲线图。
图9：由于硅胶条外部拉伸导致的凝胶应变。 (A) X-Y 未拉伸纤维蛋白凝胶的横截面（顶部），以及施加拉伸后的横截面（底部） ε孔 沿 x 方向施加 64% 应变（底部）。凝胶中嵌入了荧光微珠。相关长度的 d 和 l 用于计算 ε孔 在图像中表示（B虚线方框区域的放大图像 A (C本研究中所考虑的菌株类型示意图： ε孔 是切口在其最大直径处的轴向应变，且 ε凝胶 是凝胶中心的轴向应变（通过微珠聚集体位置测得）D) 在两者之间发现存在线性关系 ε孔 和 ε凝胶 在两者中 xx 方向（红线）和 yy 方向（绿线）。该图已获 Roitblat Riba 等人许可改编。41 请点击此处以查看此图的放大版本。

9. 纤维取向分析

  1. 利用纤维取向的量化方法来表征纤维凝胶在逐渐增加拉伸程度下的结构响应。将高分辨率图像上传至 ImageJ FIJI 软件（NIH）43，然后使用 OrientationJ（EPFL）44 模块进行分析（设置参数：高斯梯度，3 像素窗口，图 10）。
    1. 按下式计算取向直方图的二维向列序参量（NOP）：45
      NOP 方程，2(cosθ)²-1=0，符号，用于光学中入射角分析。
      注：NOP = 1 表示纤维完全沿轴向（角度为零）排列，NOP = 0 表示各向同性。取向角 θ 是通过图像分析获得的纤维相对于应变轴（x 轴）的角度，其精确定义见 OrientationJ 文档44。

用于取向分析的 ImageJ 界面；高斯梯度；插件设置对话框。
图10：使用 FIJI ImageJ 软件进行纤维取向分析。（A）ImageJ 的主菜单，箭头指示“插件”下拉菜单中可找到“OrientationJ”的位置。在“OrientationJ”扩展菜单下，点击“OrientationJ Distribution”选项。（B）OrientationJ 的分布模块。将“Local window σ”设置为 3 像素，“Gradient”设置为“Gaussian”，然后按下“Run”按钮（红色箭头）。请点击此处查看此图的放大版本。

10. 手动内部凝胶应变分析

  1. 在对含有嵌入微珠的水凝胶进行活体高倍成像时，手动定位一个具有易于识别特征的感兴趣区域（ROI）（例如微珠聚集体），以便在每次施加不同拉伸幅度后能够返回到相同位置。
    注意：在Z方向上的压缩（泊松效应）可能导致随着拉伸增加微珠密度升高，因此建议选择足够大的微珠聚集体，使其能够被清晰识别。本方案要求分析纤维蛋白凝胶的中央区域，尽管也可选择其他任意区域。
  2. 在预拉伸位置（步骤6）时，采集所选ROI的高分辨率Z-层扫描图像。在每次设定的拉伸间隔后，返回同一ROI并重复图像采集过程。
  3. 获取图像后导入ImageJ软件。在ROI内记录每个可见微珠聚集体的X-Y像素位置，并将记录的数据转移至电子表格中。
  4. 测量每对聚集体之间的距离，并将其与参考图像中相同配对的距离进行比较，从而计算X和Y方向上的应变。
    注意：如果在凝胶拉伸过程中录制连续的实时视频（而非静态图像采集），可采用数字图像相关或数字体相关（DIC/DVC）方法进行自动应变分析，如先前研究所示46,47。然而需注意，在本实验条件下自动DIC/DVC分析具有挑战性，因为Z-层扫描不仅在X-Y平面内移动，还由于泊松效应（压缩）在Z方向上发生位移，导致录制视频期间出现显著漂移。

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结果

对携带嵌有1 μm荧光微球的三维纤维蛋白水凝胶的硅胶条施加逐渐增加的静态拉伸，所得代表性数据如图9所示。分析结果展示了硅胶拉伸对切口几何形变以及凝胶内部应变发展的影响。Z-堆栈图像用于评估原始圆形切口向椭圆几何形状的变形情况（图9A）。利用这些图像可计算εxx(孔洞)（公式2）。在拉伸水凝胶过程中，放大图像并手动追踪多个微球聚集体（图9B），可计算凝胶中心区域在轴向εxx(gel)和垂直方向εyy(gel)的局部凝胶应变（图9C,D）。轴向应变从硅胶切口边缘向凝胶中心相对线性地传播，且其值大于压缩性的垂直应变（图9D）。<...

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讨论

本文所述方法与方案主要基于 Roitblat Riba 等人先前的研究41。我们在此提供了 SCyUS 装置的完整计算机辅助设计（CAD）、Python 程序及微控制器代码。

与现有方法相比，本方法的主要优势在于能够从三维水凝胶的周边对其施加应变，且适用于弹性模量低至约100 Pa的极软水凝胶，并可在拉伸过程中进行活细胞共聚焦成像。其他方法通常难以在Z轴方向施加应变场，且在拉伸过程中无法提供原位高倍显微图像，这主要是由于样品与物镜之间的工作距离受限所致。目前大多数可用系统基于二维基底拉伸，难以真实模拟生理组织环境。

该系统的局限性包括聚合后凝胶纤维密度可能存在不一致的均匀性（图7A），尤其是在使用较大凝胶体积或复杂几何形状时。此类非均匀性可能导致凝胶中应变分布和纤维排列不均。此外，在较深的 Z 轴截面（>30 μm）存在光学限制，可能引起纤维...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本文中部分图示经版权清算中心许可转载：施普林格·自然， 生物医学工程年鉴在实现活细胞显微成像的同时对三维水凝胶施加均匀的z轴应变，A. Roitblat Riba，S. Natan，A. Kolel，H. Rushkin，O. Tchaicheeyan，A. Lesman，版权所有© (2019)

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 546 羧酸琥珀酰亚胺酯InvitrogenA20002
细胞培养基（DMEM高糖）生物工业公司01-052-1A加入10% FBS、1% PNS、1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠
盖玻片 #1.5Bar-Naor Ltd.BN72204-3022×40 毫米
二甲基亚砜 99.5% 气相色谱级 DMSOSigma-Aldrich 公司D-5879-500 ML
杜尔贝科磷酸盐缓冲液生物工业公司02-023-1A
EVICEL 人纤维蛋白胶Omrix Biopharmaceuticals3902纤维蛋白原：70 mg/mL，凝血酶：800–1200 IU/mL
纤维蛋白原缓冲液N/A1升配方：7克 NaCl，2.94克二水合柠檬酸三钠，9克甘氨酸，20克盐酸精氨酸 & 0.15 g 二水合氯化钙。用纯水定容至 1 L（pH 7.0–7.2）
荧光微珠 FluoSpheres (1 µm)InvitrogenF8820橙色（540/560）
以水溶液形式提供（含2%固体成分及2 mM叠氮化钠）
高温硅橡胶McMaster-Carr3788T41580 µm厚的
E = 1.5 Mpa
泊松比 = 0.48
抗拉强度 = 4.8 MPa
拉伸上限 = +300% 工程应变
HiTrap 脱盐柱 5 mL （Sephadex G-25 填充）GE Healthcare17-1408-01
HIVAC-G 高真空密封胶信越化学工业株式会社HIVAC-G 100
ImageJ FIJI 软件39美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州版本 1.8.0_112
微控制器（Arduino Uno + Adafruit 电机扩展板 v2.3）Arduino/AdafruitArduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R 离心机赛默飞世尔科技75002470
ParafilmBemisPM-996
Primovert 倒置显微镜卡尔蔡司苏州有限公司491206-0011-000
SCyUS CAD（Solidworks）达索系统èmesN/A
SCyUS 代码37N/AN/A
伺服电机 - TowerPro SG-5010Adafruit155
SL 16R 离心机赛默飞世尔科技7500403050 mL 管
无菌 10 厘米 非培养板康宁430167
凝血酶缓冲液N/A1升配方：20克甘露醇，8.77克氯化钠，2.72克三水合乙酸钠，24毫升25%人血清白蛋白，5.88克氯化钙。用纯水定容至1升（pH 7.0）
0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液 B，0.05% EDTA生物工业公司03-052-1B
USB线缆（B型公头至A型公头）N/AN/A
蔡司 LSM 880 共聚焦显微镜卡尔蔡司股份公司2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3（黑色）卡尔·蔡司股份公司发布版本 14.0.0.0

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