方法文章

通过 16 重串联质量标签标记结合二维色谱和质谱进行高通量和深度蛋白质组分析

DOI：

10.3791/61684

⸱

2020年8月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种使用 16 重串联质谱标签试剂开发的优化高通量方案，可实现生物样品的定量蛋白质组分析。广泛的碱性 pH 分离和高分辨率 LC-MS/MS 可减轻比率压缩并提供深度蛋白质组覆盖。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

同量异位串联质量标签 （TMT） 标记因其高多重能力和较深的蛋白质组覆盖而广泛用于蛋白质组学。最近，引入了一种扩展的 16 重 TMT 方法，进一步提高了蛋白质组学研究的通量。在本手稿中，我们提出了一种基于 16 重 TMT 的深度蛋白质组分析的优化方案，包括蛋白质样品制备、酶消化、TMT 标记反应、二维反相液相色谱 （LC/LC） 分馏、串联质谱 （MS/MS） 和计算数据处理。重点介绍了 16 重 TMT 分析的关键质量控制步骤和特定流程的改进。这种多重过程为分析各种复杂样品（如细胞、组织和临床标本）提供了强大的工具。在单个实验中可以定量多达 16 个不同样品中高度复杂的生物样品中的 10,000 多种蛋白质和翻译后修饰，如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化，为基础和临床研究提供了有力的工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

质谱技术的快速发展使得在蛋白质组学应用中实现高灵敏度和深度蛋白质组覆盖成为可能 1,2。尽管有这些发展，但样本多重检测仍然是研究人员处理大量样本组分析的瓶颈。

多重同量异位标记技术广泛用于大批量样品的蛋白质组范围相对定量 3,4,5,6。基于串联质量标签 （TMT） 的定量因其高多重检测能力而成为一种流行的选择 7,8。TMT 试剂最初以 6 重试剂盒的形式推出，能够同时定量多达 6 个样品9。该技术进一步扩展到定量 10-11 个样品10,11。最近开发的 16 重 TMTpro（以下简称 TMT16）试剂进一步将多路复用能力提高到单个实验中的 16 个样品12,13。TMT16 试剂使用基于脯氨酸的报告基团，而 11 重 TMT 使用二甲基哌啶衍生的报告基团。TMT11 和 TMT16 都使用相同的胺反应基团，但 TMT16 的质量平衡基团大于 TMT11，使报告离子中的 8 个稳定的 C13 和 N15 同位素的组合达到 16 个报告基团（图 1）。

多路复用能力的提高为设计具有足够重复的实验提供了一个平台，以克服统计挑战14。此外，16 重 TMT 中的额外通道有助于减少每个通道的起始材料总量，这可能有助于新兴单细胞蛋白质组学的开发15。高多重检测能力在翻译后修饰的定量中也很有价值，这通常需要大量的起始材料16,17。

采用 TMT 技术的蛋白质组学工作流程已经得到简化 18,19,20，并且在过去十年中，它们在样品制备、液相色谱分离、质谱数据采集和计算分析方面取得了显着发展 21,22,23,24,25,26 .我们之前的文章对 10 重 TMT 平台27 进行了深入概述。此处描述的方案介绍了一种详细的 TMT16 优化方法，包括蛋白质提取和消化、TMT16 标记、样品混合和脱盐、碱性 pH 值和酸性 pH 反相 （RP） LC、高分辨率 MS 和数据处理（图 2）。该方案还强调了为成功完成定量蛋白质组学实验而纳入的关键质量控制步骤。该方案可用于常规识别和定量超过 10,000 种具有高重现性的蛋白质，以研究生物途径、细胞过程和疾病进展 20,28,29,30。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该研究的人体组织已获得 Banner Sun Health Research Institute 的大脑和身体捐赠计划的批准。

1. 从组织中提取蛋白质和质量控制

注:为了减少样品采集对蛋白质组的影响，如果可能，在最短时间内在低温下采集样品至关重要31。这在分析翻译后修饰时尤其重要，因为它们通常不稳定，例如，一些磷酸化事件只有几秒钟的半衰期32,33。

  1. 切除和称量组织样品
    1. 使用分析天平去皮 1.5 mL 微量离心管，并在干冰上预冷管。
    2. 将冷冻组织（例如，人脑组织，~10 mg）从指定区域切成小块，并立即将组织块转移到预冷的试管中。
      注:为了减少样品的异质性，对所有 16 个样品使用均匀的大小和解剖区域非常重要。从组织获得的蛋白质量通常为组织重量的 5-10%。
    3. 称量试管和组织，并立即将试管放在干冰上。使用相同的程序处理剩余的 15 个样品。解剖后立即将样品保存在干冰中，并储存在 ˗80 °C。
  2. 裂解组织样品
    1. 在实验当天准备新鲜的裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 8.5、8 M 尿素和 0.5% 脱氧胆酸钠）。应在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂，以保持蛋白质的磷酸化状态。
      注:使用前将裂解缓冲液置于室温下，因为 8 M 尿素会在冰上沉淀，这可能导致样品裂解过程中蛋白质变性不完全，并降低蛋白质消化效率。
    2. 向每个样品中加入裂解缓冲液（每 10 mg 组织添加 100 μL 裂解缓冲液，以达到 5 至 10 μg/μL 的最终蛋白质浓度）和玻璃珠（裂解物体积的 ~20%，直径 0.5 mm）。
    3. 在 4 °C 的搅拌机中以速度设置为 8 裂解组织 30 秒，静置 5 秒，重复直到样品均质化（~ 5 个循环）。
  3. 准备裂解物的等分试样。
    1. 每个样品至少准备两个等分试样。使用小等分试样 （~10 μL） 分析蛋白质浓度和评估蛋白质质量（例如，阳性对照蛋白的 western blotting 验证）。较大的等分试样 （~50 μL） 用于蛋白质组分析。
    2. 立即将等分试样冷冻在干冰上，并储存在 -80 °C 直至进一步使用。
  4. 测量蛋白质浓度
    注意:蛋白质浓度可以通过 BCA 测定或短 SDS 凝胶染色方法34 测量（图 3A）。由于组织裂解物中的非蛋白还原组分可能会影响 BCA 检测中的测量，因此用户可以通过短 SDS 凝胶染色方法验证蛋白质浓度。此处介绍了简短的 SDS 凝胶染色方法。
    1. 将 16 个等分试样稀释 10 倍，并制备 BSA 标准品（例如，0.15、0.5、1.5 和 3 μg 的 BSA 滴定）。
    2. 在带有浓缩凝胶的 10% SDS-PAGE 凝胶（26 孔）上运行样品和 BSA 标准品，直到所有蛋白质迁移到凝胶中约 3 mm。
    3. 用考马斯蓝对凝胶染色 1 小时，然后对凝胶进行脱色，直到空白区域的背景清晰。
    4. 扫描凝胶以通过 ImageJ 测量考马斯染色蛋白质条带的强度，并根据测量值创建 BSA 标准曲线。
    5. 通过标准曲线计算绝对蛋白质浓度。
      注:本实验中每个样品的最终蛋白质浓度为 ~5-10 μg/μL。对于基于 TMT16 的蛋白质组学分析，每个样品 50 μg 蛋白质（全蛋白质组分析总共 0.8 mg 蛋白质）就足够了。
  5. 样品质量控制
    注:在进行 TMT 分析之前，此质量控制步骤对于识别低质量样品至关重要。对于已知蛋白质变化的样品，建议通过 western blotting 验证变化。还建议使用标准 SDS-PAGE 分析来检查蛋白质模式并排除任何高度降解的样品（图 3B）。
    1. 从小等分试样中取出每个样品 ~10 μg，并在梯度 SDS-PAGE 凝胶上运行样品，直到溴酚蓝染料到达凝胶底部。
    2. 用考马斯蓝对凝胶进行染色，然后对凝胶进行脱色。检查蛋白质质量以去除高度降解的蛋白质样品。
      注意:降解的样品可以鉴定为在高分子量区域具有非常少的蛋白质条带，而在低分子量区域具有增强条带的样品（图 3B）。

2. 溶液内蛋白质消化、肽还原和烷基化、消化效率测试、肽脱盐

  1. 通过 Lys-C 和胰蛋白酶进行蛋白质消化
    1. 从每个样品的大等分试样中取出 ~50 μg 蛋白质，并添加裂解缓冲液至 50 μL。
    2. 添加 100% 乙腈 （ACN） 以达到 10% 的最终浓度。
    3. 通过以 100:1 （w/w） 的蛋白质:Lys-C 比率添加 Lys-C 并在室温下孵育 3 小时来进行 Lys-C 消化。
    4. 用 50 mM HEPES （pH 8.5） 稀释样品，以含有终浓度为 2 M 尿素。
    5. 以 50:1 （w/w） 的蛋白质:胰蛋白酶比例向每个样品中加入胰蛋白酶，并在室温下消化 3 小时或过夜。
  2. 肽还原和烷基化
    1. 将新鲜制备的二硫苏糖醇 （1 M DTT） 溶液加入至最终 1 mM 浓度，并在室温下孵育 1 小时以减少二硫键。
    2. 将新鲜制备的碘乙酰胺 （1 M IAA） 溶液加入至最终 10 mM 浓度，在黑暗中反应 30 分钟，以烷基化半胱氨酸残基。
    3. 通过添加 1M DTT 至最终 30 mM 浓度来淬灭未反应的 IAA，并在室温下再孵育 30 分钟。
  3. 检查消化效率
    1. 每个样品取 ~1 μg，并根据制造商的方案使用 C18 树脂涂层移液器吸头脱盐。
    2. 通过短梯度 LC-MS/MS 运行分析每个样品（请参阅步骤 5 中的更多详细信息）。
    3. 对 MS 原始数据执行数据库搜索（请参阅步骤 6 中的更多详细信息）。计算鉴定出的具有至少一个胰蛋白酶错误切割位点的肽的百分比。百分比通常低于 15%。
    4. 如果百分比大于 15%，则向样品中添加额外的胰蛋白酶以重复酶解。
    5. 消化后，通过添加 TFA 至 0.5% （v/v） 使样品酸化。用 pH 试纸检查 pH 值，确保 pH 值小于 3。
  4. 肽脱盐
    1. 将酸化肽以 21,000 x g 离心 10 分钟。将上清液转移到新管中。
    2. 用 250 μL 100% 甲醇洗涤 C18 脱盐柱（~25 μL 树脂）两次，以 500 x g 离心 30 秒。
      注:为了减少脱盐过程中肽的损失，请选择结合载量与起始量相匹配的脱盐柱。
    3. 使用 250 μL 洗脱缓冲液（60% ACN，0.1% TFA）以 500 x g 离心 30 秒，洗涤色谱柱两次。
    4. 用 250 μL 平衡和洗涤缓冲液 （0.1% TFA） 平衡色谱柱两次，以 500 x g 离心 30 秒。
    5. 在预平衡的色谱柱上加载样品。让样品以 100 x g 旋转 6 分钟与色谱柱结合。确保所有溶液都已通过色谱柱。
    6. 用 250 μL 平衡剂洗涤色谱柱 3 次，并以 500 x g 离心 30 秒洗涤缓冲液。
    7. 通过向每根色谱柱中加入 125 μL 洗脱缓冲液并以 100 x g 旋转 3 分钟来洗脱肽。检查该列是否不包含任何剩余解。
    8. 在真空浓缩器中干燥洗脱的肽，并将肽储存在 -80 °C 以备将来 TMT 标记。

3. 多肽的 TMT16 标记、标记效率测试、样品混合和标记多肽脱盐

  1. 肽的 TMT16 标记
    1. 将每个脱盐肽样品重悬于 50 μL 50 mM HEPES （pH 8.5） 中，涡旋数次或超声溶解，然后使用 pH 试纸条验证 pH 值。
      注意:如果在标记前未完全干燥，样品可能呈酸性，这会对标记效率产生负面影响。确保 pH 值在 7 到 8 之间。
    2. 从每个样品中取出 ~1 μg 未标记的肽作为 TMT 标记效率测试的阴性对照。
    3. 将 TMT16 试剂溶解在无水乙腈中。通过以 1.5:1 （w/w） 的 TMT:蛋白质比例添加试剂并在室温下孵育 30 分钟来进行标记反应。
      注:用于 TMT16 的 TMT:蛋白比例比用于 TMT11 的比例高 50%。这种微小的差异可能是由于 TMT16 的分子量比 TMT11 试剂的分子量大（1.2 倍）。从样品中估计蛋白质量，而不考虑脱盐过程中的损失。
  2. 贴标效率测试
    1. 从每个样品中取出 ~1 μg 标记肽进行标记效率测试。将剩余的样品置于-80°C下，不要淬灭反应。
    2. 根据制造商的方案，用 C18 树脂涂层的移液器吸头对 TMT16 标记和未标记的样品各 ~1 μg 进行脱盐。
    3. 通过 LC-MS/MS 分析样品（参见第 5 节，但梯度为 10 分钟）。
    4. 通过分析未标记和标记样品之间未标记肽的 MS1 强度降低来估计标记效率。选择 6 到 10 种不同的肽段来验证标记效率，以确保所有肽段都被标记。 对于完整标记，不观察到未标记的肽。
      注:确保所有样品的完整标记对于下游准确的蛋白质鉴定和定量非常重要。
    5. 如果标记不完整，请添加额外的 TMT 试剂来标记剩余的肽，并在淬灭前再次检查标记效率。样品完全标记后，加入羟胺至终浓度为 0.5%，在室温下淬灭反应，并在室温下孵育 15 分钟。
  3. 样品混合和脱盐
    1. 汇集每个 TMT 标记样品的一半以制成混合物。
    2. 从混合物中取出 1 μg，用 C18 树脂涂层移液器吸头脱盐，然后使用短梯度（~30 分钟）通过 LC-MS/MS 分析。
    3. 使用每个 TMT16 报告离子的平均强度并比较 16 个通道之间的差异来计算相对浓度。为了实现每个通道的均匀混合，根据计算的平均强度将剩余的 TMT 标记样品添加到混合物中。重复调整，直到所有样品均等混合。表 1 显示了样品混合过程的代表性数据。
      注:由于移液错误可能会影响浓度和蛋白质定量的准确性，因此确保正确的混合量非常重要。16 个样品之间的强度差异应小于 5%。
  4. 标记肽脱盐
    注:由于 TMT16 标记反应中的背景衍生物（例如，来自羟胺淬灭反应的 TMTpro-NHOH 和来自 TMT 羟基化的 TMTpro-OH）是疏水性的，因此对 TMT16 标记的样品使用广泛的洗涤条件以有效去除衍生物。在常规洗涤缓冲液 （0.1% TFA） 中添加 5% ACN 和 10 倍床体积的洗涤缓冲液。
    1. 通过将 10% TFA 添加到 pH < 3 中，使混合样品酸化。
    2. 将混合样品以 21,000 x g 离心 10 分钟，然后将上清液放入新管中。
    3. 使用真空浓缩器干燥样品以去除 ACN。
    4. 用 2 mL 100% 甲醇洗涤色谱柱，然后加入 2 mL 洗脱缓冲液（60% ACN 加 0.1% TFA），最后加入 2 mL 洗涤缓冲液（0.1% TFA），对含有 50 mg 吸附剂柱的固相萃取柱进行预处理。
    5. 将样品加载到色谱柱上。将流速调整为 ~100 μL/min，以确保肽结合的全部范围。保存流出。
    6. 用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤色谱柱 3 次。
    7. 用 1 mL 洗脱缓冲液洗脱肽。
    8. 在真空浓缩器中干燥洗脱的肽，并将肽储存在 -80 °C 以进一步分离。

4. 离线碱性 pH LC 预分馏

  1. 分馏系统制备
    1. 为微升流速高性能液相色谱系统制备缓冲液 A（10 mM 甲酸铵，pH 8.0）和缓冲液 B（10 mM 甲酸铵，90% 乙腈，pH 8.0）。
    2. 在微流速高性能液相色谱系统中设置含有桥式乙烯杂化颗粒（粒径 3.5 μm，4.6 mm × 25 cm）的 HPLC 色谱柱进行分离。
    3. 安装 100 μL 样品定量环，依次用 300 μL 甲醇、水和缓冲液 A 清洗定量环。
    4. 使用 100 μL 1:1:1:1 比例的异丙醇:甲醇:乙腈:水清洗色谱柱。然后，在 95% 的缓冲液 A 中进一步平衡色谱柱 0.5 小时。
  2. 样品制备
    1. 将混合和脱盐的 TMT16 样品溶解在 70 μL 缓冲液 A 中。确认样品 pH 值为 ~ 8.0。如果仍然是酸性的，则使用 28% 氢氧化铵 （NH4OH） 将 pH 值调节至 8.0。
      注:为避免样品损失，样品体积应小于定量环体积的 70%。
    2. 将样品以 21,000 x g 离心 10 分钟以去除沉淀物。
  3. 分馏和串联
    注:在进行实际样品分离之前，强烈建议进行中试实验，以确保液相色谱系统处于良好状态。这可以使用少量实际样品 （~5%） 或非 TMT 标记的肽混合物进行。
    1. 进样并按以下梯度进行分级分离:5% 缓冲液 B 10 分钟，5-15% 缓冲液 B 2 分钟，15-45% 缓冲液 B 148 分钟，45-95% 缓冲液 B 5 分钟。使用 0.4 mL/min 的流速。
    2. 将馏分收集器设置为每 1 分钟收集一次馏分，并在 4 个循环中将 160 个馏分连接回 40 个馏分。
      注:通过将从同一时间内部流出的早期、中等和晚期液相色谱馏分合并成一个串联馏分来进行连接。连接馏分在液相色谱的第一维中几乎没有重叠，从而提高了洗脱窗口在第二维液相色谱中的效率。此外，通过几轮连接，肽可以均匀分布在所有连接组分中。与单个组分的分析相比，这种方法已被证明可以提高蛋白质组覆盖率35,36。
    3. 在真空浓缩器中干燥所有连接馏分，并将干燥的样品储存在 -80 °C 下，以便进一步进行 LC-MS/MS 分析。

5. 酸性 pH RPLC-MS/MS 分析

  1. 酸性 pH RPLC-MS/MS 系统制备
    1. 用 1.9 μm C18 填料填充空柱（内径为 75 μm，尖端孔口为 15 μm），长度为 10-15 cm。
    2. 使用蝶形组合加热器在 65 °C 下加热色谱柱，以降低背压。
    3. 用 95% 缓冲液 B（3% 二甲基亚砜、0.2% 甲酸和 67% 乙腈）彻底清洗色谱柱。然后，在 95% 缓冲液 A（3% 二甲基亚砜和 0.2% 甲酸）中完全平衡色谱柱。
    4. 在分析实验样品之前，通过运行 100 ng 大鼠脑肽或 BSA 肽来检查 LC-MS/MS 系统的性能。
  2. 连接馏分的 LC-MS/MS 分析
    1. 在 5% FA 中从碱性 pH 级分中重构干燥的肽，并以 21,000 × g 离心 5 分钟。将每个样品的上清液转移到 HPLC 样品瓶插件中。
    2. 将每个组分的 ~1 μg 肽加载到色谱柱上。以 0.25 μL/min 的流速洗脱肽，梯度为 18–45% 缓冲液 B， 60 分钟。
      注:要获得较高的识别号，请运行一个馏分，并根据第一次运行调整其余馏分的梯度。最佳梯度应在整个梯度中具有均匀分布的肽（图 4A）。
    3. 使用以下参数作质谱仪以分析 TMT16 标记的样品:MS1 扫描（全 MS 扫描范围:450-1600 m/z;Orbitrap 分辨率:60,000;自动增益控制目标:1 x 106;最大离子时间:50 毫秒）和 20 次数据依赖性 MS2 扫描（Orbitrap 分辨率:60,000;AGC 目标:1 x 105;最大离子时间:110 ms;HCD 归一化碰撞能量:32%;隔离窗口:1.0 m/z;隔离偏移:0.2 m/z;动态排除:10 秒）。
      注:此处使用的参数在一种类型的质谱仪上进行了优化（参见 材料表）。对于不同的 MS 仪器，用户应微调仪器参数以获得高质量的结果。一种设置是监测归一化 HCD 碰撞能量，因为最佳能量可能因仪器以及 TMT11 和 TMT16 而异。

6. 数据处理

注意:数据分析是使用 JUMP 软件套件 37,38,39 进行的，包括混合数据库搜索引擎（基于模式和标签）、控制已鉴定肽/蛋白质的错误发现率 （FDR） 的过滤软件，以及用于 TMT 数据集的定量软件。根据用户的情况，可以使用其他商业或免费提供的程序进行数据分析。

  1. 数据库搜索
    1. 将 MS 仪器的 .raw 文件转换为 .mzXML 文件，并根据 UniProt 人类蛋白质序列（或其他适当的物种特异性数据库）生成的非冗余目标诱饵数据库40 搜索 MS2 谱图，以计算已鉴定蛋白质的 FDR。
      注:通过组合来自 Swiss-Prot 和 TrEMBL 数据库的蛋白质序列来生成非冗余数据库。还可以添加这些参考数据库中未包含的定制蛋白质序列，包括蛋白酶裂解的蛋白质、具有单核苷酸多态性的蛋白质和常见污染物。
    2. 使用以下参数执行搜索。前驱体的质量容差:10 ppm;子离子的质量容差:15 ppm;最大漏诊卵裂:2;最大修饰位点:3;静态修饰:Lys 残基和 N 末端上的 TMT16 标签为 304.20715 Da，Cys 残基上的氨基甲基化为 57.02146 Da;动态改性:15.99492 Da，用于 Met 上的氧化。
  2. 筛选搜索结果
    1. 按肽段长度（>6 个氨基酸）、母离子的质量精度和基于 JUMP 的匹配分数（Jscore 和 ΔJn）过滤得到的肽段谱图匹配 （PSM）。然后按肽段长度、胰蛋白酶末端、修饰、缺失切割位点和电荷态对肽进行分组。
    2. 使用匹配分数进一步过滤数据，以在蛋白质（全蛋白质组分析）或肽（磷酸化蛋白质组分析）水平上实现低于 1% 的 FDR。
      注:如果在过滤步骤中缺少阳性对照肽/蛋白质，则可以将 FDR 提高到合理的水平，以便可以挽救这些肽/蛋白质。
    3. 对于蛋白质家族中多个成员共享的肽段，将匹配的成员聚为一组。
      注:根据简约规则，该组由共享肽数量最多的同源蛋白和与独特肽匹配的其他蛋白表示。
  3. 蛋白质定量
    1. 使用统计软件套件的内置程序定量蛋白质，以总结所有匹配 PSM 的 TMT 报告离子强度。
    2. 从每个接受的 PSM 中提取 TMT 报告离子强度，并根据每种标记试剂的同位素分布校正原始强度（例如，TMT16-126 分别产生 92.6%、7.2% 和 0.2% 的 126、127C 和 128C m/z 离子），并根据用户定义的阈值过滤掉低强度和/或高噪声 PSM。使用样品的修剪均值（或中位数）强度对定量数据进行归一化，以校正负载偏差。
    3. 对于每种鉴定的蛋白质，计算匹配 PSM 的样品中以均值为中心的强度（即相对强度），并通过取样品平均值来总结 PSM 的相对强度。通过将三个最丰富的匹配 PSM 的总体平均强度相乘，将相对信号转换为绝对信号。
    4. 使用先前报道的 y1 离子校正方法37 校正干扰，该方法假设 y1 离子强度与报告离子强度相关。通过估计干净扫描中 y1 和报告离子强度之间的线性关系，推导出并校正了噪声扫描中受污染的 y1 离子强度的干扰水平。
      注:对于 TMT 标记的胰蛋白酶肽，K-TMT 和 R 残基是 MS2 谱图中的两个代表性 y1 离子（分别为 376.27574 Da 和 175.11895 Da）。如果仅检测到一个 y1 离子并且与鉴定出的肽段一致，则认为 MS2 是干净的扫描。如果检测到两个 y1 离子，则认为 MS2 是有噪声的扫描。
    5. 将蛋白质定量值传输到电子表格中以进行进一步分析。使用无监督数据分析方法（如 PCA 或聚类分析）来探索样本的分布。要鉴定差异表达的蛋白质，请使用 t 检验和方差分析 （ANOVA） 等统计方法。

7. MS 数据验证

注:在进行耗时的生物实验之前，至少使用一种验证方法来评估 MS 数据的质量。

  1. 手动检查目标蛋白质的 MS/MS 谱图，以验证肽序列和 TMT 报告离子强度。
  2. 使用基于抗体的方法（例如，蛋白质印迹或免疫组织化学分析）来验证蛋白质水平的变化。为了确认天然肽的存在，使用合成肽作为内标。在相同条件下，LC-MS/MS 期间肽的 MS/MS 谱图和保留时间应相同。
  3. 使用靶向 MS 方法验证蛋白质变化。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新开发的 TMT16 方案（包括标记反应、脱盐和 LC-MS 条件）已经过系统优化41。此外，我们直接比较了 11 重和 16 重方法，使用它们分析相同的人类 AD 样本41。在优化 TMT16 的关键参数后，TMT11 和 TMT16 方法> > 10,000 种人类蛋白质中的 100,000 个肽产生了相似的蛋白质组覆盖度、鉴定和定量。

由于 TMT16 试剂比 TMT11 试剂更疏水性，因此 TMT16 标记的肽可能比 TMT11 标记的肽更疏水性，这可能是 RPLC 中保留时间 （RT） 不同的原因。因此，我们通过使用 LC-MS/MS 分析 TMT11 和 TMT16 标记的肽混合物，评估了 TMT16 与 TMT11 相比对肽 RT 的影响。我们发现 TMT16 对中等疏水性肽的 RT 有显着影响，但对极高或极低疏水性的肽几乎没有影响。因此，LC 梯度中相似的起始和结束缓冲液 B 浓度可用于不同的 TMT 标记肽。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于 TMT16 的深度蛋白质组分析的优化方案已在早期出版物 12,13,41 中成功实施。使用当前的方案，可以在单个实验中以高精度对来自 16 个不同样品的 10,000 多种独特蛋白质进行常规定量。

为了获得高质量的结果，重要的是要注意整个实验步骤中的关键步骤。除了我们之前的第27 篇文章中讨论的所有 QC 步骤外，我们还包括特定于 TMT16 工艺的其他基本步骤。这些步骤对于确保实验成功非常重要。例如，TMT 反应衍生物（例如，来自羟胺淬灭反应的 TMTpro-NHOH 和来自 TMT 羟基化的 TMTpro-OH）在脱盐前通过 LC-MS/MS 分析检测为突出的单电荷离子。在脱盐步骤中去除它们至关重要。我们测试了不同的脱盐条件，发现在常规洗涤缓冲液中添加 5% ACN 并结合...

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披露

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作者没有什么可披露的。

致谢

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这项工作得到了美国国立卫生研究院 （R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987、RF1AG064909 和 U54NS110435） 和 ALSAC （美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构） 的部分支持。MS 分析在 St. Jude 儿童研究医院的蛋白质组学和代谢组学中心进行，该中心得到了 NIH 癌症中心支持补助金 （P30CA021765） 的部分支持。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% Criterion TGX 预制中型蛋白凝胶BioRad5671035
10X TGS （Tris/甘氨酸/SDS） 缓冲液BioRad161-0772
4–20% Criterion TGX 预制中型蛋白凝胶Biorad5671095
50% 羟胺Thermo Scientific90115
6 X SDS 样品加载缓冲液Boston Bioproducts IncBP-111R
甲酸铵 （NH4COOH）Sigma70221-25G-F
氢氧化铵，28%Sigma338818-100ml
子弹BlenderNext AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio 加热器Phoenix S&TPST-BPH-20
C18 Ziptips哈佛仪器74-4607用于脱盐
二硫苏糖醇 （DTT）SigmaD5545
DMSOSigma41648
甲酸Sigma94318
馏分收集器GilsonFC203B
凝胶代码蓝色染色试剂Thermo24592
玻璃珠Next AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
HPLC 级乙腈Burdick &JacksonAH015-4
HPLC 级水钻 &JacksonAH365-4
碘乙酰胺 （IAA）SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
质谱仪Thermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA 消解标准品Waters 186002329
甲醇Burdick 和JacksonAH230-4
纳流 UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 树脂，1.9 umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
自填充柱最新 物镜PF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50 mgWatersWAT054960用于脱
盐 脱氧胆酸盐Sigma30970
SpeedvacThermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex 标记试剂套装Thermo ScientificA44520
三氟乙酸 （TFA）Applied Biosystems400003
蛋白酶PromegaV511C
超微量离心柱，C18哈佛法74-7206用于尿
素脱盐 SigmaU5378
Xbridge 色谱柱 C18 色谱柱Waters186003943用于碱性 pH 液相色谱
钠 胰

参考文献

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