卵巢癌干细胞（OCSC）负责肿瘤的发生、复发、治疗耐药性和转移。OCSC的血管微环境被认为可促进OCSC的自我更新，从而导致化疗耐药。本实验方案为体外建立可重复的OCSC血管微环境模型提供了基础。.
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本文内容
摘要
摘要
癌症干细胞（CSCs）存在于支持性的生态位中，该生态位由邻近的间质细胞、血管和细胞外基质构成的微环境组成。CSCs参与内皮形成的能力是一项重要特征，直接有助于深入理解肿瘤发生及肿瘤转移的机制。本研究的目的是建立一种可重复的方法，用于探究卵巢癌干细胞（OCSCs）的肿瘤起始能力。在此，我们利用体外共培养模型NICO-1，研究了内皮细胞与OCSCs之间的新生血管形成机制以及内皮细胞的形态学变化。该方案可实现对OCSCs周围新生血管形成过程的时程可视化观察。该技术有助于揭示OCSCs在肿瘤转移中的血管生成特性。
引言
卵巢癌是全球女性中第八大常见恶性肿瘤，每年约有30万例新发病例，死亡人数估计达18万1。在初次诊断时，卵巢癌常表现为严重症状，约75%的患者已处于III-IV期。因此，5年生存率<30%，在妇科恶性肿瘤中死亡率最高2，且卵巢癌治疗效果在很大程度上取决于临床因素，如减瘤手术是否成功、对化疗是否耐药以及初始治疗后是否复发。
卵巢癌组织具有层级结构，并非所有肿瘤组分都具有同等的产生后代的能力。只有能够自我更新并产生异质性肿瘤细胞群体的细胞才被认为是癌症干细胞（CSCs）3。CSC的自我更新和肿瘤起始过程伴随着血管生成的促进作用，以重塑其肿瘤微环境，从而维持一个支持性的生态位。然而，由于临床样本来源的CSC在多次传代后类球体结构易被破坏，导致可重复性有限，以往的模型无法用于体外分析。最近，已开发出从患者样本中培养CSC的实验方法，并应用于多个领域4,5,6,7。特别是，利用CSC在无血清培养基和超低吸附培养板中通过形成类球体生长的特性，可诱导培养的CSC表达一种干细胞表面标志物，而这种标志物在具有多向分化潜能的普通肿瘤细胞中并不表达8,9。
最新研究数据显示，以腹膜播散形式存在的休眠卵巢癌干细胞（O）CSCs的持续存在与其再生为复发性肿瘤相关10。因此，了解OCSCs的分子和生物学特性可能有助于有效靶向并清除这些细胞，从而实现潜在的肿瘤缓解。特别是，目前对于CSCs在血管生成中所起作用的细胞与分子机制仍知之甚少11。因此，在本实验方案中，我们采用患者来源的OCSCs，在体外通过共培养模型研究内皮细胞的血管生成特性，该模型可模拟临床情况下转移部位CSCs与内皮细胞共存的肿瘤微环境。最终，由于新生血管形成是支持肿瘤生长和转移的关键过程，深入理解其机制将有助于开发针对转移部位OCSCs的新型靶向治疗策略。
本文介绍了一种以时间序列方式观察围绕肿瘤干细胞（CSCs）新生血管形成过程的实验方案。该方案的优势在于，可利用3D共培养系统NICO-1进行完全可重复的研究，从而允许观察卵巢癌干细胞（OCSC）介导的肿瘤起始能力对内皮细胞血管生成过程在患者中所产生的影响。
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方案
所有操作均在伦理委员会批准的人类福利相关方案下进行。所有患者均签署了书面知情同意书，同意将其样本用于科研；本研究的组织采集与使用已获得帝京大学人类基因组与基因分析研究伦理委员会的批准。
1. 在二级生物安全柜中从卵巢癌患者及其腹水中分离和培养卵巢癌干细胞（OCSCs）
- 通过腹腔穿刺术获取的人卵巢癌腹水分离肿瘤干细胞。从患者体内收集至少 100–250 mL 腹水，以获得足够数量的肿瘤干细胞。此外，通过流式细胞术评估肿瘤干细胞标志物（如 EpCAM、Calretinin、CD133、CD44、CD45、ALDH1 和 Oct4）以及卵巢癌标志物（pAX-8、WT-1）的表达谱。
- 在腹水抽取后 24 小时内，于室温下以 300 × g 离心 10 分钟，处理人卵巢癌腹水。
- 移除上清液，加入 2 mL OCSC 培养基和 8 mL 30% Histodenz/磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶液。
- 配制 OCSC 培养基：StemPro hESC 添加剂、含 L-谷氨酰胺（GlutaMAX 培养基）的 DMEM⁄F-12、25% BSA、100 µM 2-巯基乙醇、8 ng/mL 基础 FGF、10 µM 胰岛素和 20 µM Y-27632。
- 在 15 mL 离心管中，小心地将 2 mL OCSC 培养基叠加至步骤 1.1.2 的细胞悬液上，使用水平转子在室温下以 450 × g 离心 20 分钟，不启用刹车。
- 使用移液管小心转移 OCSC 层（位于界面处且保持未扰动状态）至新的 15 mL 离心管中。
- 用 PBS 加至 15 mL，于室温下以 300 × g 离心 5 分钟，移除上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 OCSC 培养基中，并接种至超低吸附培养皿中；培养物应于 37 °C、5% CO2 条件下维持培养。
- 每三天更换一次培养基。将培养皿静置约 1 分钟，小心吸弃部分上清液后加入新鲜培养基。
- 肿瘤干细胞的传代
- 将 OCSCs 收集至 15 mL 离心管中，于室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
- 移除上清液，加入 PBS 至满，于室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
- 移除上清液，加入 1 mL 含蛋白水解酶和胶原酶解酶的细胞解离液（如 AccuMax），于 37 °C 孵育 10 分钟。
- 用移液器充分吹打混匀，于 37 °C 继续孵育 5 分钟，确保细胞完全分散为单细胞悬液。
- 用移液器充分吹打混匀，加入 PBS 至满，于室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
- 移除上清液，将细胞沉淀重悬于 OCSC 培养基中，随后接种至超低吸附培养皿中，并于 37 °C、5% CO2 条件下继续培养。
2. HUEhT-1 内皮细胞培养
- HUEhT-1 细胞传代
- 从 HUEhT-1 细胞培养皿中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞。
- 加入 1 mL 0.025% 胰蛋白酶，室温孵育 3 分钟。
- 加入 5 mL 内皮细胞生长培养基 2，将细胞收集至 15 mL 离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 HUEhT-1 培养基中，接种至包被有胶原的培养皿中，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养维持。
- 每三天更换一次培养基。
3. 使用 HUEhT-1 细胞制备 NICO-1 共培养板以进行管形成实验
- 组装 NICO-1 并使用基于细胞外基质的水凝胶（Matrigel Matrix）进行包被。
- 按照制造商说明组装 NICO-1 的一侧，并置于冰上保存。
- 用 300 μL 冷 PBS 覆盖 NICO-1 表面，随后去除缓冲液。
- 加入 300 μL 冰冷的基于细胞外基质的水凝胶，在 37 °C 下孵育 60 分钟。
- 为进行平衡，先将滤膜浸入 100% 乙醇中，然后用 PBS 清洗 13 mm ICCP 滤膜（0.6 µm）1 分钟。
- 组装完整的 NICO-1，包括主体部分 A（右侧室）和 B（左侧室），以及 O 形圈和已平衡的滤膜。
4. 在 NICO-1 系统上接种 HUEhT-1 细胞和 CSC
- 用胰蛋白酶消化细胞单层，将细胞重悬于含2%胎牛血清的内皮细胞生长培养基中，制备HUEhT-1细胞悬液。
- 向每孔包被有基于细胞外基质的水凝胶的培养孔中加入1.2 mL细胞悬液（1.5 × 105 个细胞）。
- 向另一孔中加入培养5天的OCSCs 1.5 mL。
- 将NICO-1置于37 °C、5% CO2 条件下孵育；可在显微镜下观察管状结构的形成，并通过分支数量测定在基于细胞外基质的水凝胶上形成的网络结构。
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结果
我们收集了晚期卵巢癌患者在手术或腹腔穿刺过程中获得的腹水液，旨在建立卵巢癌球状体的长期稳定培养。本文展示了两例卵巢癌干细胞（OCSC）长期球状体培养的案例，分别命名为CSC1和CSC2。这两个细胞系具有相同的病理诊断和组织学特征。目前，卵巢癌干细胞（OCSC）与内皮细胞相互作用进而诱导OCSC周围内皮细胞新生血管形成的机制尚不明确。因此，本研究旨在阐明OCSC在转移部位血管微环境形成的生物学过程。我们利用体外共培养模型NICO-1，研究了内皮细胞（HUEhT-1）与OCSC之间的相互作用。 图1 显示了CSC1和CSC2诱导的成管活性比较。在与CSC2共培养的条件下，形成的血管管腔数量随时间显著增加图 2A）。作为阳性对照，我们提供 图2B 显示了在VEGF（10 ng/mL）处理后HuEhT-1的血管生成特性，该实验未与CSC2共培养。我们目前正在阐明该结果背后的详细机制. <...
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讨论
本方案描述了如何在体外模拟卵巢癌干细胞（OCSCs）的肿瘤微环境。该方法的核心是利用NICO-1系统（一种间接Transwell共培养系统）建立高度可重复的共培养模型。目前许多可用的共培养模型主要研究直接细胞-细胞接触对共培养细胞群体的影响12,13,14,15,16,17,18。最简单的共培养模型可通过将两种细胞直接混合实现，通过调整每种细胞类型的接种密度及亚群间的相对接种比例，可研究异型和同型相互作用的程度19。然而，由于各类细胞在显微镜下难以精确区分，因此很难直接确定OCSCs在共培养所观察到的效应中各自贡献的比例；因此，这...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由日本文部科学省科学研究费补助金C类（课题编号：19K09834，负责人：K.N.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.025% 胰蛋白酶 | Thermo | R001100 | |
| 10 mL 移液管 | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL 移液器吸头 | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL 离心管 | Nunc | 339650 | |
| 200 µL 移液器吸头 | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-巯基乙醇 | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL 移液管 | Thermo | 170366N | |
| 50 mL 离心管 | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM I 型胶原 60 mm 培养皿 | Corning | 356401 | |
| 离心机 | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 孔透明平底超低吸附多孔板 | Corning | 3471 | |
| 内皮细胞生长培养基 2 | PromoCell | C-22011 | |
| 乙醇 | WAKO | 057-00456 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（FGF-Basic） | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 细胞 | JCRB 细胞库 | JCRB1458 | |
| ICCP 滤膜 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| 胰岛素，人源 | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| 发光检测仪 | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel 基质 | Corning | 356234 | |
| 显微镜 | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 移液器 | Gilson | F123602 | |
| P200 移液器 | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| 移液管 | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
参考文献
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