介绍了多种用于表面分析的纳米颗粒制备方法（滴涂法、旋涂法、粉末沉积法和冷冻固定法）。我们讨论了每种方法在应用中面临的挑战、优势以及可能的应用前景，特别是不同制备方法对纳米颗粒表面性质所造成的影响。
本文内容
摘要
摘要
近年来，纳米颗粒因其在医学、化妆品、化学等领域的潜在应用以及在先进材料开发中的前景而受到越来越多的关注。为了有效理解并调控纳米颗粒的理化性质及其潜在的不良效应，有必要建立针对纳米颗粒各种特性的经验证测量方法。尽管测量纳米颗粒尺寸及尺寸分布的方法已较为成熟，但分析其表面化学性质的标准化方法尚未建立，尽管表面化学性质对纳米颗粒特性的影响已毋庸置疑。特别是，纳米颗粒在储存和进行表面分析前的制备过程会显著影响多种分析方法的检测结果；因此，为了获得一致可靠的分析结果，样品制备过程必须经过优化并实现标准化。本文中，我们将详细介绍一些用于纳米颗粒表面分析的样品标准制备流程。原则上，纳米颗粒可通过悬浮液或粉末形式沉积在合适的基底上。硅（Si）晶片常被用作基底材料，但其清洁处理对整个过程至关重要。对于由悬浮液制备样品的方法，我们将讨论滴涂法和旋涂法；这些方法的成功不仅取决于基底的洁净度和悬浮液的纯度，还与悬浮液的浓度密切相关。对于具有敏感配体壳层或涂层的纳米颗粒，采用粉末形式沉积更为合适，但该方法在样品固定过程中需格外谨慎。
引言
纳米材料是指任意外部尺寸在1 nm至100 nm之间，或在此尺度上具有内部或表面结构的材料1。由于纳米材料具有因尺寸微小及相应的高比表面积（以及其他因素）而产生的独特性质，其在农业、化学、汽车制造、化妆品、环境、医学、印刷、能源和纺织等多个领域中的应用日益广泛。这种日益增长的应用意味着人类和环境将以前所未有的规模接触到这些材料，而这些材料的毒理学特性尚未完全明确，且其尺寸使其易于进入生物或环境系统2。
在比表面积和粒径/粒径分布等基本特性之后，表面化学性质及涂层被确定为纳米材料最关键的特性3；较小的颗粒单位质量具有更大的表面积，因而表面原子与体相原子的比例更高。事实上，对于尺寸为1 nm的纳米颗粒，超过70%的原子位于角或边缘处；这显著影响诸如化学吸附等表面性质，而化学吸附高度依赖于原子尺度的表面形貌4。针对纳米材料的法规要求提供有关其理化特性的准确数据以及对其毒理学特性的可靠评估。为了从纳米材料的物理和化学性质高效地预测其毒理学特性，纳米材料领域亟需可靠、标准化且经过验证的分析方法。诸如ACEnano5等项目旨在收集并关联纳米颗粒的准确且可验证的物理数据，建立一个有助于更好监管和表征纳米材料的框架。这一推动分析方法标准化的趋势也得到了《ACS Nano》编辑们的支持，他们希望“整合并统一材料表征方法及最低分析要求6”。此外，XPS和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）为揭示核-壳纳米颗粒的粒子结构提供了新的可能性7,8。
X射线光电子能谱（XPS）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）是研究表面原子的成熟方法，其比较见表1。在XPS中，样品被能量为1至2 keV的X射线照射，由于光电效应而发射出电子。这些发射电子的动能处于相同能量范围，与其在固体中的电子结合能相关；因此，在特定结合能处出现且具有可测强度的光电子信号，可用于进行定量成分分析。由于这些光电子的平均自由程小于10 nm，XPS是一种对表面极为敏感的定量分析技术。此外，对高分辨率谱图中结合能的详细分析，可实现对这些电子价态的定量测定。
在飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）中，样品表面被聚焦的离子束（一次离子）溅射，从材料中溅射出的离子（二次离子）被收集并送入飞行时间质谱仪进行分析。所获得的质荷比图谱可用于确定元素、同位素或分子组成。由于二次离子的平均自由程较短，该技术对表面极为敏感，信息深度仅为1–2 nm；但由于基质效应的影响，其定量能力最多仅为半定量水平，即二次离子的电离概率（因而产率）强烈依赖于其周围的基质环境。ToF-SIMS 可在静态或动态模式下运行，两者之间的区别在于入射到表面的一次离子通量。静态 SIMS 将一次离子通量控制在仅影响（即破坏）表面最多1%–10%的水平，使表面保持相对完整，从而实现对材料最表层原子层的分析。尽管如此，静态 SIMS 仍会对表面造成一定程度的破坏，因此相较于其他方法，其“非破坏性”程度较低。
这些对表面敏感的技术可用于分析材料最表层的几个纳米，包括有意或无意的涂层，而这些涂层对于纳米材料而言会显著影响其材料特性。有意涂层的例子包括：用于提高量子点的光致发光量子产率并降低其环境反应活性的封端层9；用于防止防晒剂中二氧化钛纳米颗粒光催化活性的氧化铝或二氧化硅涂层10；实现生物偶联及后续生物活性的表面功能化修饰11；用于诊断和药物递送应用的涂层12；以及用于磁性流体和核-壳金属体系的氟碳涂层，以增强催化剂性能13。无意涂层，例如氧化、表面污染或生物系统中的蛋白冠，同样会显著影响纳米颗粒的性质，因此至关重要的是，实验制备过程必须确保纳米材料的涂层以及更广义上的表面化学性质不被破坏或发生转化。同时，评估纳米颗粒在原位状态下的性质也极为关键，因为其性质可能因环境变化而发生显著改变2,14,15。此外，纳米颗粒悬浮液中稳定剂的浓度会显著影响分析结果及纳米颗粒的结构完整性；稳定剂的存在可能在分析中产生强烈的干扰信号（例如 C、H、O 和 Na），而其去除则可能导致纳米颗粒的损伤或团聚。
由于纳米颗粒的尺寸和表面积，其储存条件会影响其行为，无论是以储存的粉末/悬浮液形式还是制备后的样品形式。已有研究表明，次优的储存条件（特别是室温储存和暴露于光照）会导致纳米颗粒降解，进而改变颗粒的物理、化学和/或毒理学性质14,15,16,17,18。较小的纳米颗粒比大颗粒氧化更快，其氧化/降解速率取决于储存条件15以及表面化学性质14。纳米颗粒在储存期间的降解已被证明会显著影响其理化性质，包括毒性14，而氧化生长可能向内进行，从而消耗颗粒核心15。
因此，纳米材料的妥善储存与制备对于准确的表面分析至关重要，任何可能影响样品表面和/或测量质量的因素都应仔细考虑。需要注意的是，由于XPS的空间分辨率相对较低（在 µ在微米范围（m范围）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS，几百纳米）下，仅能检测到少量纳米粒子；这些方法对特定区域进行平均化分析，无法实现单个粒子的成像，而电子显微镜等技术则具备此能力。因此，任何分析均需将纳米粒子沉积成连续层，以避免基底干扰。电子显微镜与XPS/ToF-SIMS因此常被结合使用，作为纳米材料分析的互补方法。
除了表面化学性质的变化外，为XPS和ToF-SIMS分析制备纳米颗粒样品的主要挑战在于制备出满足以下要求的样品层：均一，以提高重现性；无间隙，以最小化基底对谱图的贡献；足够薄，以避免非导电样品产生电荷积累效应；以及牢固地固定在基底上，以防止游离的纳米颗粒进入并损坏超高真空仪器
纳米颗粒可以通过悬浮液或粉末形式沉积到基底上。首先，我们将讨论从悬浮液中沉积纳米颗粒的不同方法。硅片是悬浮液沉积中常用的基底，因为其成本相对较低，易于获得，且通常为高纯度产品，由纯硅或掺杂硅组成（掺杂可避免电荷效应）；对于大多数纳米颗粒而言，其谱峰不会与硅片的特征峰发生重叠。最后这一点尤为重要：在分析前应确保基底的谱峰与纳米颗粒预期产生的谱峰充分分离，否则将难以甚至无法解析谱图，且无法验证纳米颗粒是否在基底上形成连续覆盖。在使用硅片之前，必须进行彻底的清洗程序（本文中将予以描述），以去除有机污染物并提高基底表面的润湿性。其他合适的基底，如金膜、高定向热解石墨（HOPG）或铟箔，也已被成功使用，但关于这些基底的制备讨论不在本研究范围之内19,20,21,22。
其次，我们介绍了将纳米颗粒粉末沉积到基底上以进行XPS和ToF-SIMS分析的方法，并阐述了每种方法的优缺点，使刚接触这些技术的研究人员能够根据自身需求选择最优的制备方法。第三，我们讨论了冷冻固定法，这是一种适用于保留纳米颗粒（NPs）聚集行为、有机冠层、固/液界面23,24或在生物介质中分布特征的样品制备方法25。冷冻固定通常指将样品在液氮冷却的冷冻剂中快速冷冻，并在冷冻水合状态下进行分析，从而实现对复杂基质中纳米颗粒的直接分析与可视化。该方法不会形成冰晶，而是形成非晶态冰，可使膜结构以及细胞和组织结构保持其天然生物学状态，避免因水结晶过程造成的损伤，从而精确维持所有细胞代谢物和细胞膜组分的化学分布26,27,28。该制备方法特别适用于精确呈现实际纳米颗粒聚集体或异质聚集体的化学分布图，可视化纳米颗粒附近悬浮液中的精确化学空间，或关联纳米颗粒聚集体或异质聚集体中特定细胞组织的特征及细胞内区室结构。
如本研究结果所示，特定情况下最合适的操作方法取决于多种参数，例如纳米颗粒的亲水性、稳定性、导电性、状态（如粉末或悬浮液）以及待分析的问题（如尺寸、体相性质或表面涂层）。本文介绍了多种可用于纳米颗粒表面分析前处理的方法，并比较了这些方法的优缺点。
方案
警告：纳米颗粒的毒理学特性仍在研究中；由于其尺寸，即使由本质上无害的材料组成，纳米颗粒在人体和环境中也可能带来独特的危害。在开展任何涉及纳米颗粒的工作之前，应完成适当的风险评估，并根据所研究材料的危害等级，采取相应的工程控制措施、实验室操作规程和个人防护装备（PPE）29,30,31,32。
1. 硅片的制备
注意：这些步骤对于去除不需要的（有机）污染物并提高表面润湿性是必要的。所使用的所有溶剂应至少为ACS级。标准超声波清洗机（35 kHz和120瓦）即可满足要求。
- 硅片的湿法化学清洗
- 将硅片放入盛有异丙醇的烧杯中，超声处理5分钟。
- 将硅片转移至盛有碱性玻璃清洗液的烧杯中，超声处理10分钟。
- 将硅片放入盛有超纯水的烧杯中。通过倾倒并重新加水的方式换水10次；由于毛细作用，硅片会始终停留在烧杯底部。
- 用洁净的N2气体吹干硅片。
注意：使用N2吹干可防止水分蒸发时形成“咖啡环”及其他水渍残留物。 - 将硅片放入第二个盛有异丙醇的烧杯中，超声处理10分钟。
- 用洁净的N2气体吹干硅片。
- 将硅片放入盛有乙醇的烧杯中，超声处理10分钟。
- 用洁净的N2气体吹干硅片。此步骤后可暂停实验流程。
- 硅片的等离子体或紫外/臭氧清洗
- 将硅片放入等离子体清洗仪或紫外/臭氧清洗仪中，开启设备处理30分钟。
注意：硅片应在使用前立即进行等离子体或紫外/臭氧清洗。
- 将硅片放入等离子体清洗仪或紫外/臭氧清洗仪中，开启设备处理30分钟。
2. 来自悬浮液的纳米颗粒沉积
注意：纳米颗粒最常见的暴露途径是通过吸入。使用悬浮液可降低暴露风险。
- 从粉末制备纳米颗粒悬浮液
注意：此处描述的所有用量均为示例，应根据每种具体使用的纳米颗粒对方法进行优化。- 准确称取15 mg纳米颗粒粉末（±10%）至10 mL离心管中。
- 准确加入约8 mL超纯水。
- 盖紧管盖，用纸巾包裹后放入50 mL离心管中，置于涡旋振荡器中以3,000 rpm处理15分钟。
- 从水相悬浮液中滴铸导电性纳米颗粒
- 将晶圆放入紫外/臭氧清洗仪中处理30分钟。
- 将晶圆置于晶圆夹具的一半中，并在环形区域中心滴加3 µL纳米颗粒悬浮液。
- 在晶圆上液滴周围安装一个直径为6.07 mm的Viton O型圈，注意O型圈不得接触液滴。
- 将晶圆置于真空干燥器中，在4 mbar真空条件下干燥15分钟。
- 从干燥器中取出晶圆，使用光学显微镜和X射线光电子能谱（XPS）进行检测，确认颗粒层均匀且致密。重复步骤2.2.1和2.2.2，直至分析结果显示形成连续且均匀的薄膜。此步骤可暂停。
- 从水相悬浮液中旋涂非导电性纳米颗粒
- 将晶圆放入紫外/臭氧清洗仪中处理30分钟。
注意：通过使用相同方案旋涂不同浓度的悬浮液，可实现不同程度的表面覆盖率。 - 设置旋涂仪程序。一个合适的示例程序为：第一步：以500 rpm/s加速至1,000 rpm（5 s）；第二步：以1,000 rpm/s加速至2,000 rpm（3 min）；第三步：以2,000 rpm/s减速至0 rpm。
- 将晶圆装入旋涂仪中，并开启真空固定。
- 在晶圆表面滴加80 µL悬浮液，启动程序。
- 从旋涂仪中取出晶圆。
- 将样品存放在新的洁净晶圆托盘中。此步骤可暂停。
- 使用扫描电子显微镜（SEM）分析样品，确认基底表面被完全覆盖且无间隙。
- 将晶圆放入紫外/臭氧清洗仪中处理30分钟。
3. 从粉末中沉积纳米颗粒
- 纳米颗粒在双面胶带上的沉积（“粘贴即用”）
- 将双面胶带固定在样品台上，并移除离型纸。
- 取少量纳米颗粒粉末（刮刀尖端的量），将其蘸取后接触胶面。
- 用刮刀将样品在胶带上铺开，并压入胶中，尽可能使粉末牢固粘附。
- 通过翻转并轻敲样品台，以及用气流（例如氮气）吹扫表面，检查粉末是否已牢固附着。此步骤可暂停。
注：也可将少量粉末置于清洁表面（铝箔或玻璃载片）上，再从上方用带有双面胶的样品台压紧。 - 将少量粉末（刮刀尖端的量）置于清洁表面上，再将带胶的样品台从上方压在粉末上。
- 通过翻转并轻敲样品台，以及用气流（例如氮气）吹扫表面，检查粉末是否已牢固附着。此步骤可暂停。
- 压片粉末样品的制备
- 彻底清洁压片模具的所有部件，注意避免划伤抛光表面。
- 将压片模具倒置，放置在小垫片上。
- 插入冲头和一片不锈钢垫片（抛光面朝上），拉动冲头直至模具内有足够空间填充粉末样品。
- 向模具中加入少量样品（约一大刮刀尖端的量），然后插入第二片不锈钢垫片，使其抛光面朝向样品。
- 将底座装到模具主体上，小心翻转。如需且有条件使用真空，将真空泵连接至压片模具的底座。
- 将模具放入压片机中，确保其居中放置。
- 施加轻载荷（2 kN）约 20 秒，然后释放。
- 施加较重载荷（6 kN）保持 2 分钟，然后释放。
- 卸载后，关闭真空泵。
注：由于不同纳米材料的物理性质各异，建议制备一系列在不同压力和保压时间下成型的压片，以确定最佳压片条件。 - 将模具翻转，装入顶出环，并在冲头与顶出环之间施加轻压（不超过 1 kN）。
- 从压片机中取出模具部件，用镊子小心取出样品压片。
- 使用双面胶将样品轻轻固定在清洁的硅片上。此步骤可暂停。
4. 纳米颗粒悬浮液的冷冻固定
- 用液氮填充快速冷冻装置的主腔室。
- 向已冷却的快速冷冻腔室中加入冷冻剂（丙烷）。
- 使快速冷冻装置冷却至其工作温度。
注意：快速冷冻装置在样品制备前需要一定时间达到工作温度，因此冷冻固定样品需预留合理的时间（数小时）。 - 用移液器将10–20 µL的纳米颗粒悬浮液滴加到已清洁的硅片上。
- 用固定镊子夹持硅片，将其放入浸入式冷冻装置中。
- 将固定镊子移至浸入位置。
- 按下按钮，将样品投入冷冻剂中。
- 等待数秒，直至样品完全冻结。
- 尽快将冷冻后的样品转移至低温环境中。
- 将冷冻固定的样品（硅片）装入样品台，并转移至仪器内。
注意：运输过程中建议使用干冰，样品可短期保存。样品可在冷冻状态下使用冷却仪器进行分析，或在经冷冻干燥稳定处理后，采用常规的飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）条件进行检测。
结果
本文介绍了多种用于纳米颗粒表面分析的样品制备方法。由于特定纳米颗粒（NP）的理化性质将决定样品制备的最佳方法（例如，滴涂法与旋涂法）以及该方法的最优操作流程（例如，需要不同的基底或溶剂），因此应通过替代性分析方法验证所用方法的适用性，并在必要时进行优化。本研究结果与以往发表的文献一致，表明样品制备过程需要建立一致的实验方案和操作流程，同时需要进行质量检查，以确保样品制备和纯化方法的恰当性、有效性，并且不会对纳米颗粒造成损伤22,33,34,35,36。
本文未涉及纳米颗粒（NPs）的采样和储存方法，这些内容已在其他多种参考文献中有详细描述14,15,16,17,18,34,37,38,39。显然，必须高度重视所分析样品的代表性，确保其能够反映整体纳米颗粒的分布情况，并应开发和验证合适的采样方法。研究也表明，储存条件在数月时间内会显著影响纳米颗粒的性质，因此必须谨慎考虑。例如，我们建议将纳米颗粒分装于密封容器中避光保存，理想条件下应置于4 °C以下。此外，储存、采样和样品制备过程必须严格按照已验证的程序一致地进行，并详细记录。该记录应包括纳米颗粒本身的元数据，例如来源信息和储存条件40。电子实验记录本（ELNs）等工具可用于系统记录操作流程和纳米颗粒元数据，有助于按照FAIR原则（可发现、可访问、可互操作和可重用）生成数据。
准确且正确的纳米颗粒表面分析首先需要选择合适的基底。我们选用经过清洗的硅晶圆作为基底，因为其易于获得、耐用、易于清洁、具有导电性且表面足够平整；然而，根据分析目的的不同，其表面的氧化层可能成为缺点，因为基底上的偶然碳氢化合物无法与纳米颗粒上的区分开来。必要时，可选用其他材料，例如在硅晶圆上镀金或聚合物涂层、氮化硅（Si3N4）晶圆，或高取向热解石墨（HOPG）19,20,21,22。本文所述样品制备的第一步是清洗硅晶圆，示意图见图1。清洗过程的有效性可通过多种方法验证，包括X射线光电子能谱（XPS），如图2所示。主要污染物（偶然碳）是空气中储存样品的典型特征，在清洗后显著减少。此外，通过紫外光或臭氧处理对晶圆表面进行羟基化，可增强润湿性，从而避免水相悬浮液沉积过程中出现咖啡环效应，实现纳米颗粒更均匀的分布，如图3所示。可根据需要采用其他湿化学清洗方法；此处仅要求获得可重复的洁净表面，而无需完全去除所有有机污染物或氧化层。若在清洗与悬浮液沉积步骤之间暂停实验流程，则应在等离子体或紫外光/臭氧处理后再次处理晶圆，并最好在处理后15分钟内完成悬浮液的沉积。
第2.2节所示的60 nm金-银核壳纳米颗粒悬浮液中含有大量用作稳定剂的柠檬酸钠，这在纳米颗粒悬浮液中是一种常见现象。为了准确分析这些颗粒及其表面性质，特别是通过X射线光电子能谱（XPS）进行分析，应尽可能去除稳定剂，因为稳定剂会衰减来自纳米颗粒的信号并引起电荷积累效应。为了确定适用于这些纳米颗粒的最佳纯化方法（其扫描电镜图像见图4），分别采用了在超纯水中透析或通过离心与再分散进行纯化的方法，每种方法均重复三次。尽管透析看似是一种更温和的方法，而离心与再分散更可能导致颗粒发生团聚或聚集，但扫描电镜图像显示，透析后的金-银纳米颗粒出现了明显的形变和损伤（图4B），而经离心与再分散处理的颗粒仍保持完整（图4C）。这一现象在金属纳米颗粒中尤为显著；我们推测，存在一个最佳的柠檬酸钠含量，既能为溶液提供一定的稳定作用，又不会干扰纳米颗粒的信号，而过度去除稳定剂则会导致纳米颗粒受损。先前有报道称，离心次数存在一个最佳值，可有效去除大部分柠檬酸钠；超过该次数则会导致部分纳米颗粒发生聚集33。在本研究中，需要进行九次透析循环（共计36小时）才能达到相似的柠檬酸盐浓度；然而，该方法导致的聚集程度高于离心法，同时也引起了表面功能化的下降。这些结果表明，在制备不同类型纳米颗粒时，验证每个步骤的重要性，尤其是针对未知样品时更为关键。
本示例中使用的60 nm金-银核壳纳米颗粒具有良好的导电性，适用于滴铸法，因为不会产生电荷积累问题，且使用相对简单的设备通过多次沉积即可形成较厚的颗粒斑点。较厚的沉积层有助于获得更可重复的测量结果，而使用浓度更高的悬浮液进行铸膜还可通过减少沉积步骤来节省时间。沉积效果会受到基底润湿性的影响；润湿性差可形成较厚的纳米颗粒斑点，这对导电样品有利；而润湿性好则可形成更均匀的纳米颗粒层，适用于导电和绝缘样品。如实验方案所述，纳米颗粒悬浮液的滴铸通常需要多次重复加样才能获得完全覆盖的厚层；该过程可通过X射线光电子能谱（XPS）进行验证，也可通过光学显微镜快速简便地确认。图5展示了从水溶液中滴铸金-银核壳纳米颗粒时液滴覆盖面积的演变过程；在此情况下，需要经过13次滴铸步骤才能实现完全覆盖。滴铸法特别适用于导电性颗粒，或电荷效应能够被充分补偿的颗粒。与本出版物中描述的其他方法一样，应针对不同样品优化滴铸条件，因为不同的纳米颗粒材料在信息深度、浓度以及薄膜厚度限制方面具有不同的特性。需注意避免形成过厚的薄膜，否则可能导致有机物堆积，进而抑制纳米颗粒信号。
均匀且高质量的涂层有助于确保结果的一致性和可重复性。除了悬浮液浓度、溶剂和旋涂参数外，灰尘或其他较大的宏观或微观颗粒的存在也可能对旋涂后薄膜的质量产生负面影响。图6展示了使用0.45 µm注射器滤膜过滤后，纳米颗粒悬浮液旋涂质量的改善情况。应选择合适的滤膜，以确保不会将纳米颗粒从悬浮液中去除。本实验方案中所述的三种不同浓度悬浮液（分别为90、9.0和0.9 mg/mL的135 nm PS-PTFE核壳纳米颗粒）在相同条件下进行旋涂，并通过扫描电子显微镜（SEM）和X射线光电子能谱（XPS）进行分析。图7中的顶部图像和谱图显示了由90 mg/mL悬浮液制备的薄膜，其SEM图像呈现出厚实且无间隙的多层覆盖，CPS谱图中明显缺乏Si峰，表明基底对谱图无贡献。该样品非常适合用于XPS或飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）分析；此外，由于基底信号干扰极小，颗粒壳层产生的较小F1s峰也能清晰可见。由9.0 mg/mL悬浮液制备的第二个样品在SEM图像中表现为小范围的单层团聚体，未能完全覆盖表面。该样品过薄且不均匀，不适合用于XPS或ToF-SIMS分析。此外，即使经过仔细清洗，基底表面吸附碳的信号仍可能干扰定量分析；至少应在测量的不确定度评估中考虑这一影响。然而，该样品非常适合利用图像分析软件进行颗粒尺寸分布的SEM或透射电子显微镜（TEM）分析，因为颗粒以单层形式存在，且数量足够（在图像范围内），可实现具有统计意义的评估。由最低浓度（0.9 mg/mL）悬浮液制备的样品既无法形成连续覆盖，也未达到足够的颗粒密度，因此不适合用于表面化学或颗粒尺寸分布的分析。由于基底信号占主导地位，无法进行可靠的定量分析。
通过滴铸法从悬浮液以及采用“粘附即用”（stick-and-go）方法从粉末制备了具有PDMS或甘油外层的Al2O3-TiO2核壳纳米颗粒（NPs），以比较不同制备方法对敏感外层的影响。样品通过飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）进行分析，并对谱图数据采用主成分分析（PCA）进行处理。PCA是一种统计技术，通过构建新的不相关变量（即主成分）来降低大型数据集的维度，从而最大化数据中的方差41,42,43,44,45。在主成分图上不同样本集的分离情况使得结果更易于分析和归类。在图8B所示的PCA得分图中，展示了各数据集相对于所有其他数据集（即不同样本集之间）的区分能力，由粉末制备的两个样品表现出显著不同的得分，而由分散液制备的样品则表现出极为相似的得分。如图8C所示的载荷图揭示了变量之间的关系，即哪些峰对相应的主成分贡献最大。所有主成分均根据其对数据集间差异的贡献程度进行排序，其中PCA1对不同数据集之间的分离贡献最大。PC1主要由PDMS峰的存在（由粉末制备的PDMS包覆NPs）或缺失（其余所有样品）所主导，而PC2作为解释数据集中第二大幅值变异的因素，能够区分Al2O3与纳米颗粒上的有机封端层。这表明从悬浮液制备的纳米颗粒所测得的谱图非常相似，提示PDMS和甘油层可能在悬浮液制备过程中或干燥过程中被去除或破坏，导致Al2O3或TiO2的信号占主导地位。
尽管压片法在粉末样品制备方面具有诸多优势，例如便于操作以及在超高真空仪器中具有良好的稳定性（包括可在高真空腔室内进行溅射而不会使纳米颗粒脱落），但其所涉及的高压可能会损坏敏感的纳米颗粒，这一点已在其他制备方法中有所体现。因此，应制定并验证一种合适的实验方案。
对于纳米颗粒分散液，通过冷冻固定滴加的样品悬浮液可避免咖啡环效应（由于纳米颗粒悬浮液被瞬间固定，从而消除了干燥效应），同时还能保留悬浮液中存在的较大结构。此外，该方法无需使用粘性胶带。这相应地减少了信号干扰，这些干扰可能源于盐类、污染物或样品制备过程中其他人为因素，在相应的质谱图中表现为干扰信号，如图9所示。冷冻固定的主要优势在于能够原位保存纳米颗粒周围的化学环境，以及颗粒聚集体或异质聚集体的化学形态，并保持其与组织或单个细胞内生物学特征的相关性，甚至可实现与细胞内区室的共定位，而不会因干燥、滴加等样品处理步骤造成干扰46’47。本文已证实了冷冻固定技术在此类分析中的适用性，并强调了其在TiO2纳米颗粒分析中的优势。我们强调，冷冻固定特别适用于分析处于天然状态的生物样品，避免因样品制备过程中产生的人为因素导致化学物质移位。有关生物样品固定技术的更深入信息，读者可参考相关文献19,25,27,48,49。
| XPS | ToF-SIMS | |
| 探针束 | 光子 | 离子 |
| 分析束 | 电子 | 离子 |
| 空间分辨率* | > 1 µm | 0.1 µm |
| 采样深度 | 0.5 – 7.5 nm | <2 nm |
| 检测限 | 0.01 - 0.1 原子% | ppb |
| 定量能力 | 优异（半定量） | 具有挑战性（基质效应） |
| 信息含量 | 元素 化学键合 | 元素 分子 |
| 有机物分析 | 优异 | 在静态模式下优异 |
| * 由制造商指定 | ||
表1：不同表面分析方法的比较。
| 方法 | 适用对象 | 效果 | 优点 | 缺点 | 注意事项 | 控制参数 | 检测方法 |
| 透析 | 纯化 | 去除稳定剂/杂质 | 操作简单，耗时少，无需复杂设备 | 过程控制能力差 | 可能对纳米颗粒造成损伤 | 时间 | 纳米颗粒损伤（SEM） |
| 离心/再分散 | 纯化 | 去除稳定剂/杂质 | 过程可控性更高，可同时实现浓缩 | 劳动强度大，需要离心机 | 可能导致纳米颗粒聚集或团聚 | 离心转速、溶剂量 | 团聚/聚集/纳米颗粒损伤（SEM） |
| 滴涂法（悬液） | 无敏感外层的导电纳米颗粒 | 形成相对较厚的涂层斑点 | 操作简单，无需复杂设备 | 可能产生不均匀厚度，耗时较长 | 悬液制备可能损伤敏感的纳米颗粒外壳 | 悬液浓度、溶剂（基底润湿性） | 覆盖度（光学显微镜/XPS） |
| 旋涂法（悬液） | 无敏感外层的导电或非导电纳米颗粒 | 形成薄而均匀的涂层，或单个颗粒分布 | 参数一致性好 | 需通过实验确定最佳参数 | 需过滤灰尘/杂质，覆盖度可能不一致 | 浓度、旋涂参数、溶剂 | 预过滤、覆盖度、层厚（SEM/XPS） |
| “粘附即用”法（粉末） | 具有敏感外层的无机导电和非导电纳米颗粒 | 在粘附剂上形成粉末斑点 | 操作简单，耗时少，无需复杂设备 | 不适用于有机或含碳纳米颗粒，薄膜厚度不一致 | 存在纳米颗粒释放至仪器中的风险 | 纳米颗粒在粘附剂上的固定情况 | 高真空条件下的稳定性 |
| 沉积于样品台孔洞中（粉末） | XPS分析；导电或非导电的有机或无机颗粒 | 轻压成型的纳米颗粒样品 | 不与其他材料接触 | 纳米颗粒无牢固固定；不适用于ToF-SIMS | 存在纳米颗粒释放至仪器中的风险 | 无 | 轻微倾斜样品台侧面，确保粉末压实 |
| 压片法（粉末） | 导电和非导电纳米颗粒，聚合物纳米颗粒 | 固体片剂 | 可实现以粉末形式分析聚合物纳米颗粒 | 可能损伤或污染纳米颗粒表面 | 材料应彻底清洁以避免表面污染；可能损伤表面 | 尺寸、压力、时间 | 高真空条件下的稳定性 |
| 冷冻固定法（悬液） | 具有敏感配体层的纳米颗粒悬液；生物样品 | 固体样品 | 保持形态、天然生物状态及蛋白冠结构，减少咖啡环效应 | 制备和样品处理过程复杂且昂贵，需要熟练操作人员 | 样品处理与储存需要高度专业技能 | 浓度、液滴大小、温度 | 玻璃化状态的保持情况 |
表2：不同样品制备方法的比较。
图1：硅晶圆的清洗流程。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：硅片清洗前后的 XPS 谱图。 清洗前（灰色）和清洗后（红色）的全谱扫描，显示碳含量从 13 at% 降至 2 at%。谱图使用 Kratos Supra DLD（英国曼彻斯特）仪器采集，激发源为单色 Al Kα 射线。样品用双面胶带固定在样品台上，分析器通能为 80 eV，步长 1 eV，驻留时间 500 ms，采用“混合透镜模式”，X 射线光斑尺寸为 300 × 700 µm²。使用电子洪流枪进行电荷补偿。定量分析采用 UNIFit 202050 软件包，通过 Tougaard 背景校正各光电子峰面积，并利用 Scofield 因子、非弹性平均自由程和传输函数进行归一化处理。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：UV/臭氧清洗对水相悬浮液中 PTFE-PMMA 核壳纳米颗粒滴涂时颗粒分散均匀性的影响。经 UV/臭氧清洗的晶圆片显著减少了咖啡环现象，并提高了颗粒在表面的附着性。请点击此处查看该图的高清版本。
图 4：从纳米颗粒悬浮液中去除杂质（例如稳定剂）的处理方法 扫描电镜图像显示了透析（右上）以及离心后重新分散（右下，三组重复实验）对60 nm金-银核壳纳米颗粒的影响。透析处理明显导致纳米颗粒受损，而离心处理未见明显影响。所有比例尺均为100 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：液滴沉积法的光学显微镜图像，显示将水悬浮液中直径为60 nm的Au-Ag核壳纳米颗粒滴加到硅片上，滴加13滴后已实现充分覆盖。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：经旋涂的纳米颗粒悬浮液，过滤前（左）和使用0.45 µm注射器滤器过滤后（右）。过滤后质量的提升可明显看出。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：不同浓度旋涂的 PMMA-PTFE 核壳纳米颗粒的 SEM 图像与 XPS 谱图，显示了基底峰（由于覆盖不足）对 XPS 谱图的影响。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：基于飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）谱图对甘油和聚二甲基硅氧烷（PDMS）包覆的Al2O3-TiO2核壳纳米颗粒（NPs）进行主成分分析（PCA）的得分图。(A) 纳米颗粒结构示意图；(B) 通过滴铸法（分散液）和“粘附即走”法（粉末）制备样品后，经ToF-SIMS分析得到的得分图与(C) 载荷图。PC1代表与PDMS碎片相关的峰；PC2将具有有机涂层的样品（由粉末制备的样品）与表面似乎无涂层的Al2O3峰区分开来。所有质谱数据均在IONTOF ToF-SIMS IV仪器（ION-TOF GmbH，德国明斯特）上以正离子模式、在谱图模式（HCBU）下采集，使用25 kV的Bi3+离子束，最大剂量密度为1012 ions/cm2。扫描视场为150 × 150 µm，采用锯齿扫描模式，像素为125 × 125。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：TiO2 纳米颗粒的飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）谱图片段。（A）采用“粘附即用”（stick and go）方法由粉末制备的样品；（B）纳米颗粒分散液经冷冻固定后的样品。使用飞行时间二次离子质谱仪（ToF-SIMS，ION-TOF V；Ion-TOF GmbH，德国明斯特）进行质谱分析，离子源为脉冲式30 keV Bi3+液态金属离子枪（LMIG，直流模式（dc），16 nA）。每张谱图通过在500 × 500 µm的样品区域上扫描离子束获得。正离子二次离子信号在0–1,200 Da质量范围内采集，使用106次Bi3+脉冲。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
已有多种方法用于制备适用于XPS和ToF-SIMS表面分析的纳米颗粒。我们已在表2中总结了这些方法的优缺点、可能的误差来源以及对不同材料的适用性。如代表性结果所示，纳米颗粒的制备方式会显著影响最终表面分析的成功与否。此外，由于基底或固定材料的信号干扰、非导电厚膜的荷电效应、纳米颗粒处于粉末或悬浮状态、可能对敏感外层造成损伤、生物结构及有关聚集和界面信息的破坏，以及敏感的超高真空仪器易受游离纳米颗粒影响等因素，并非所有方法都适用于所有类型的颗粒。
由于XPS和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）测量是对一定面积进行平均，而非针对单个颗粒进行测量，因此只有在均质层上才能获得可重复的结果；因此应避免颗粒在基底上发生聚集或团聚。此外，过厚的非导电材料层在分析过程中会产生电荷积累效应，可能导致谱图中出现不希望的伪影，尤其是无法通过电荷中和枪完全补偿的部分充电现象。另一方面，不完整的薄膜会显著显示出基底或固定材料（如粘合剂）的信号，可能干扰来自颗粒表面的敏感峰。薄膜的理想厚度取决于具体材料，应通过分析不同厚度薄膜的实验结果来确定。特别是采用旋涂法制备的样品，应使用扫描电子显微镜（SEM）进行分析，以确认涂层的完整性。
与处理纳米颗粒粉末相比，操作纳米颗粒悬浮液具有更少的暴露危害和更低的安全要求。滴涂法是一种设备需求较低且相对简单的方法，特别适用于对膜厚度无要求的导电性纳米颗粒悬浮液。虽然样品可在常压条件下轻松干燥，但使用真空干燥器有助于缩短液滴干燥时间，并保护晶圆免受污染。使用氟橡胶（Viton）环可改变液滴的蒸发模式，从而最大限度地减少咖啡环的形成。此外，还可通过采用不同的清洗方案调节基底亲水性，或施加其他涂层51,52、在溶剂气氛中蒸发53，甚至加热基底54等方式来调控蒸发模式。对于非导电性纳米颗粒悬浮液，推荐使用旋涂法，因其能够形成均匀的颗粒层，厚度足以避免电荷效应，同时又足够薄，以防止硅基底对XPS和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）信号产生干扰。针对每一种特定的纳米颗粒体系及其浓度，离心和旋涂参数均需优化，但一旦确定，即可在不同仪器上高度可靠地重复使用。由于旋涂时液滴始终位于晶圆中央，旋转半径无关紧要，因此可直接使用“每分钟转数”（rpm）作为单位。悬浮液也可在程序启动后滴加至晶圆上，但此方法需要调整旋涂参数，并使用更多的悬浮液以获得更厚的涂层。
由于纳米颗粒的尺寸极小，在受到离子束或X射线束轰击时，可能会从基底上脱落，并在超高真空腔体内自由移动。这对于粉末制备的样品尤为严重。在某些情况下，纳米颗粒可能进入仪器的敏感部件，导致昂贵且耗时的维护需求。由于飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）所使用的加速电压较高，其对敏感部件造成损坏的风险大于X射线光电子能谱（XPS）。特别是采用“粘附转移法”（stick and go）制备的粉末样品，应仔细检查以确保粉末已牢固固定，尤其是在进行ToF-SIMS分析时。可通过例如将样品倒置并用气流（如N2）吹扫的方式确认其固定程度。在分析前，还可将样品在仪器的过渡腔室或其他初始样品引入腔室中静置过夜，若能维持稳定的真空度，则表明样品无松散颗粒。然而，压片形式制备的纳米颗粒样品即使在低加速电压下进行溅射也不会损坏仪器；该方法可去除来自压片过程的污染物（尤其是碳氢化合物），并可实现对颗粒本体的分析。
在样品台底座中制备纳米颗粒粉末，可获得具有确定几何形状和宏观平坦表面的样品。关键点包括压片工具的清洁度，以及使用低压以避免因该操作导致纳米颗粒表面发生变化。该方法的缺点是需要相对大量的材料，并且在高真空仪器中可能存在样品损失的问题。我们不推荐将此方法用于飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）分析，因为颗粒未被压缩或固定。
关于纳米颗粒（NP）材料，样品制备的首要考虑因素是消除或尽量减少纳米颗粒与基底材料之间的相互干扰；例如，在使用XPS和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）分析SiO2纳米颗粒时，即使样品覆盖充分，硅晶圆（Si wafer）也不适合作为基底。金属或无机纳米颗粒在双面胶带上以粉末形式进行分析时通常较为可行（前提是其不含有机层或涂层），因为纳米颗粒与双面胶带之间不存在信号干扰，但该方法不适用于聚合物纳米颗粒。由于不存在荷电效应，金属纳米颗粒在可选薄膜厚度方面具有更大的灵活性，且可通过滴涂法实现，所需设备相对较少；然而，这些颗粒在合成过程中可能含有大量杂质和稳定剂，必须在不损伤颗粒的前提下仔细去除。聚合物纳米颗粒可能更容易在压片过程中受损，但根据所施加压力的不同，也可能更易于在压片后保持结构完整。纳米颗粒表面的压片体或软质有机涂层也 可能对损伤敏感。直接从溶液中沉积的方法可能在分散或干燥过程中损伤敏感涂层，但其优势在于适用于分析原本就处于悬浮状态的纳米颗粒。冷冻固定法适用于分析在悬浮状态下的化学结构、表面或界面，这些结构可能在其他多种样品制备技术中受损或被破坏，但该方法需要专门的冷冻设备，才能用于XPS和ToF-SIMS分析46’47。
尽管本文描述了多种可用于样品制备的典型方法，但在每种情况下，都应使用替代的分析方法对所选方法进行优化和验证。不同因素影响的详细综述最近已有发表22。除了开发和验证合适的制备方法外，对这些步骤的记录同样至关重要40。本文介绍了一些易于操作的方法，并为根据特定任务的需求修改或开发新方法提供了指导。
披露
作者声明无竞争利益需要披露。
致谢
本项目获得了欧洲联盟“地平线2020”计划（H2020）的资助，资助协议编号为720952（ACEnano）。作者谨此感谢Sigrid Benemann提供的扫描电镜（SEM）测量支持，Markus Schneider提供的飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）测量与主成分分析（PCA）支持，以及Philipp Reichardt在拍摄过程中提供的协助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 四图实验室天平 | 克恩 & Sohn GmbH | ADB200-4A | |
| 5 mm 颗粒模具 | Specac | GS03060 | |
| 碱性玻璃清洗液 | Sigma-Aldrich | Hellmanex™ III Z805939 | 比色皿专用清洗液 |
| 碳导电胶带 | 平的 | "Leit-Tabs" G3347 | |
| 洁净的实验室烧杯 | 任何 | 例如，300 mL | |
| 超低温冰箱 | 电子显微镜科学公司 | EMS-002 冷冻工作站 | |
| 带夹子的透析管 | Medicell Membranees Ltd | DTV12000.06.30 | 分子量截留值（MWCO）12-14 kDa |
| 冲压模具 | 任何 | 可承受 2 kN 的力 | |
| 一次性注射器，1 mL，鲁尔滑动接头 | TH Geyer | Labsolute 7657545 | 可使用任意合适体积 |
| 双面胶带 | 3M | 可移除可重定位胶带 665 | |
| 干冰 | Linde AG | ICEBITZZZ® | 用于短期储存/冷却 |
| Eppendorf 移液器及吸头 | Eppendorf | 各种 | 检查移液量程的正确尺寸 |
| 乙醇，ACS 级 | 默克股份公司 | 1009832500 | |
| FFP2 或 FFP3 口罩 | 各种 | 对于使用非危险材料制备的纳米颗粒，若不在通风橱或手套箱中操作时 | |
| 异丙醇，ACS 级 | 默克股份公司 | 1096342500 | |
| 实验服、手套和护目镜 | 任何 | ||
| 实验室离心机 | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| 实验室通风橱 | 任何 | 处理纳米颗粒所必需的 | |
| 实验室搅拌器 &和搅拌子 | NeoLab | D-6010 | |
| 无尘擦拭布 | 金伯利·克拉克专业版 | Kimtech Science 精密擦拭巾 | 推荐用于硅晶圆操作 |
| 液氮 | Linde AG | 氮气流üssig 5.0 | 仅用于冷却冷冻剂。 |
| 1.5 mL 微量离心管 | T.H. Geyer GmbH & Co. KG | Labsolute 7696751 | |
| 氮气 5.0 | 任何 | 99.999% 纯度 | |
| 巴斯德吸管，聚乙烯，塑料，3 mL | TH Geyer | Labsolute 7 691 203 | |
| 巴斯德吸管，聚乙烯，塑料，3 mL | TH Geyer | Labsolute 7 691 203 | |
| 粉末样品架 | BAM 研讨会 | "自制" 样品台 | |
| 丙烷 | Sigma-Aldrich | 769037 | 冷冻剂应尽可能高纯。 |
| 1 mL 样品瓶或离心管 | Greiner Bio-One GmbH | Cellstar 188 261 | 应能够在涡旋振荡器中固定 |
| 硅片 | 任何 | 理想情况下为1 cm2 预切 | |
| 旋涂仪 | SPS Europe | SPIN150i-NPP | |
| 0.45 微米注射器滤器 µm | Th Geyer | Labsolute 7699803 | 适用于较小样品；另有适用于较大样品体积的较大规格版本 |
| 飞行时间二次离子质谱 | IONTOF GmbH | 配备 Bi LMIG 和喷淋枪的 ToF-SIMS IV 或 V | |
| 用于操作硅片的镊子 | 任何 | ||
| 超纯水 | 全膝关节置换术 | MicroPure 08.1202 | |
| 超声波破碎仪 | Bandelin | Sonorex Super | |
| 紫外/臭氧清洗仪 | 纳米生物分析 | UVC-1014 | |
| 真空干燥器 | 任何 | ||
| 真空泵（膜式/隔膜式） | Vacuubrand GmbH | MD-4T型 | |
| Viton O形圈 6.07 x 1.78 mm | Betech GmbH | 2-010，FKM 80 | |
| 涡旋振荡器 | Heathrow Scientific | Vortexer HS120212 | |
| 25毫米硬币式晶圆夹具 | 半导体生产系统欧洲公司 | eWB0091-ASSY-1 | |
| XPS | Kratos | Kratos Axis Ultra DLD |
参考文献
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重印与许可
